Mi a bioenzim előállításának folyamata?

1.Enzimtermelés

Az enzimeket mikroorganizmusokból, állatokból és növényekből állítják elő, de a fő forrás a mikroorganizmusok. Mivel a mikroorganizmusok több előnnyel rendelkeznek, mint a növények és az állatok, általában kiváló enzimtermelő törzseket választanak ki az enzimek erjesztéssel történő előállítására. Az enzimkoncentráció növelése érdekében a fermentációs levesben kiváló törzseket választanak ki, genetikailag módosított baktériumokat fejlesztenek ki, és optimalizálják a fermentációs körülményeket. Az ipari termeléshez az új enzimek különleges teljesítményére van szükség, mint például a magas hőmérsékletnek ellenálló α-amiláz, lúgnak ellenálló proteáz és lipáz stb. Ezért olyan törzseket kell kutatni és fejleszteni, amelyek különleges teljesítményű új enzimeket termelnek.

2.Enzim előkészítés

Az enzimelválasztási és -tisztítási technológia a jelenlegi biotechnológiai "utókezelési folyamat" lényege. A különböző elválasztási és tisztítási technikák, a mikrobiális sejtek és a fermentációs húsleves, vagy állati és növényi sejtek és a tenyésztési húsleves az elválasztás és tisztítás az enzimek, készült nagy aktivitású enzimkészítmények különböző tisztaságú, annak érdekében, hogy enzimkészítmények szélesebb körben használják minden szempontból a nemzetgazdaság, javítani kell az enzimkészítmények, tisztaság és a hozam, az új elválasztási és tisztítási technikák tanulmányozásának szükségességét.

3.Enzimek és sejtek immobilizálása

Az enzimek és sejtek immobilizációjának kutatása az enzimtechnológia központi feladata. Annak érdekében, hogy javítsa a stabilitás az enzimek, újra enzimkészítmények, bővítse az alkalmazás tartományát enzimkészítmények, a különböző immobilizációs módszerek az immobilizáció az enzimek, az immobilizált enzimek, mint például az immobilizált glükóz izomeráz, immobilizált karbamoiláz, stb., az immobilizált enzimek meghatározása, és immobilizált enzimek az alkalmazás különböző aspektusait a kutatás fejlesztése. Immobilizált enzim még mindig erős vitalitással rendelkezik. Nagyra értékelik a különböző területeken, például a biokémia, a vegyészmérnöki tudományok, a mikrobiológia, a polimerek és az orvostudomány területén.

Az immobilizált sejteket immobilizált enzimek alapján fejlesztik ki. Különböző immobilizációs módszereket alkalmaznak mikrobiális sejtek, állati sejtek és növényi sejtek immobilizálására, hogy különféle immobilizált biológiai sejteket hozzanak létre. Az immobilizált sejtek enzimatikus tulajdonságainak, különösen a kinetikai tulajdonságok tanulmányozása, valamint az immobilizált sejtek kutatása és fejlesztése különböző alkalmazásokban napjainkban az enzimtechnika egyik legforróbb témája.

Az immobilizációs technológia fontos mérföldkő az enzimtechnológia korszerűsítésében, és áttörést jelent a természetes enzimek hiányosságainak kiküszöbölésére az ipari alkalmazásokban, valamint az enzimreakció jellemzőinek teljes körű kihasználására. Elmondható, hogy nincs modern enzimtechnológia az immobilizációs technológia fejlesztése nélkül.

4. Enzim molekuláris módosítása

Más néven enzim molekuláris módosítás. Annak érdekében, hogy javítsa az enzim stabilitását, csökkentse az antigénességet, meghosszabbítja a gyógyászati baktériumok felezési idejét a szervezetben, különböző módosítási módszerekkel módosítja az enzim molekula szerkezetét, annak érdekében, hogy egy természetes enzim nem rendelkezik néhány kiváló tulajdonsággal (például nagyobb stabilitás, nem antigén, ellenállás a proteáz hidrolízis, stb.), és még egy új enzim aktivitást hoz létre, hogy bővítse az enzim alkalmazását, hogy növelje az enzim alkalmazásának értékét, és nagyobb gazdasági és társadalmi előnyöket érjen el. és társadalmi előnyöket.

Az enzim molekuláris módosítása két szempontból történhet:

(1) Használja a fehérje mérnöki technológiát az enzim molekula szerkezetének génjének módosítására, várva, hogy új enzimet (mutáns enzimet) kapjon kiváló tulajdonságokkal és magas aktivitással, amely ésszerű elsődleges szerkezettel és térszerkezettel rendelkezik.

(2) Az enzimfehérjék elsődleges szerkezetének kémiai vagy enzimatikus módosítása, vagy az enzimmolekula kémiai módosítása az oldallánccsoport kémiai módosításával. Az enzimatikus tulajdonságok megváltoztatása érdekében. Ezek az enzimek különösen hasznosak az enzimológiai alapkutatásban és az orvostudományban.

Az enzimek előállításához használt mikroorganizmusok a fonalas gombák, élesztők és baktériumok három fő csoportja, elsősorban az aerob baktériumok. Az alábbiakban számos fontosabb ipari enzim törzsét és felhasználási módját soroljuk fel:

Amiláz

Az amilázok a keményítőt hidrolizálják, hogy pasztaszerű maláta oligoszacharidokat és malátacukrot állítsanak elő. A termelésben a Bacillus subtilis és a Bacillus licheniformis nemzetséghez tartozó Bacillus subtilis és Bacillus licheniformis fajokkal történő mélyerjesztés dominál, ez utóbbi hőálló enzimeket termel. Az Aspergillus és Rhizopus törzsekkel történő mély- és félszilárd fermentációt is alkalmaznak az élelmiszer-feldolgozásban [6] . Az amilázokat főként a cukorgyártásban, a textilipari deszikkálásban, az erjesztési nyersanyagok kezelésében és az élelmiszer-feldolgozásban használják. A glükoamiláz képes a keményítőt glükózzá hidrolizálni, amelyet ma már szinte teljes egészében Aspergillus niger mélyfermentációjával állítanak elő, és cukorgyártásban, alkoholgyártásban és fermentációs nyersanyagok feldolgozásában használják.

Proteáz

A törzsek használata és a legtöbb fajta előállítása. A zuzmó alakú bacillus, rövid kis bacillus és bacillus subtilis baktériumokkal bakteriális proteáz mélyerjesztésű előállítására; a streptomyces, Aspergillus mélyerjesztésű semleges proteáz és Aspergillus savas proteáz előállítására, amelyet a bőrtelenítéshez, a szőrzet lágyításához, a gyógyszeriparban, az élelmiszeriparban használnak; a Trichoderma spp. néhány baktériummal a félszilárd erjesztésű oltóanyag előállítására a sajtgyártásban az eredeti borjú gyomrából kivont oltóanyag helyett.

Glükóz izomeráz

A faj a 70-es években gyorsan fejlődött. A Streptomyces sejteket először mélyfermentációval nyerik, és az immobilizálás után a glükózoldatot kb. 50% fruktózt tartalmazó sziruppá alakítják át, amely az élelmiszeriparban szacharóz helyett használható. Az amilázzal, glükoamilázzal és glükóz izomerázzal stb. kukoricakeményítőből sziruppá válik az egyik feltörekvő cukoripar.

Az expressziós rendszerek kiválasztása
1 E. coli expressziós rendszer
①pET expressziós rendszer előnyben részesül
② A fehérje rekombináns expressziója és tisztítása szolubilizált címkékkel végezhető, első választásként az MBP-t részesítjük előnyben.
③ Előnyben részesített pET24 vagy pET28 (ha tisztításra van szükség) BL21(DE3), TB táptalaj 37°-os növekedés 1-1,5 OD-ig, 18 ℃ növekedés 1 órán át 3 OD-ig , 0,5 mM IPTG indukció 19 órán át OD-ig 10-ig.
④ A magas expresszió és az alacsony oldhatóság mentőintézkedései: lehűtés akár 15 ℃-ra is; a közeg 2xYT-re vagy ZYP5052-re történő módosítása (önindukált), az expressziós gazda megváltoztatása; az N-terminális és/vagy C-terminális 2-10 aminosav-maradékok csonkítása; expresszió nagy oldékonyságú fehérjékkel, például MBP-vel történő fúzióval; molekuláris chaperonok kémiai indukálása, molekuláris chaperonok/interaktív fehérjék koexpressziója vagy ligandok biztosítása.
⑤ Az E. coli expressziós rendszer előnyei és hátrányai
Előnyök: a legkényelmesebb, leghatékonyabb
Hátrányok: gyenge szekréciós expressziós képesség; nehézségek a diszulfidkötések kialakításában; nincs poszttranszlációs módosítás.

2 Élesztő-expressziós rendszer (Picrosporum)
Előnyök: az exogén gének stabil integrációja; az alkohol-oxidáz gén promótere erős, és az expresszió szigorúan szabályozható metanollal; a rekombináns fehérjék intracelluláris vagy extracelluláris formában fejthetők ki; az eukarióta expressziós rendszerekhez hasonló poszttranszlációs módosító funkciókat tartalmaz; vannak kereskedelmi gazdák/vektorok, amelyek könnyen kezelhetők; könnyen amplifikálható, és a fermentációs sűrűség rendkívül magas.
② Hátrányok: a poszttranszlációs feldolgozás egyedi formája; a túlzott glikoziláció problémája.

3 Az első választás az irodalomban közölt expressziós rendszer, a második választás az E. coli rendszer, és az élesztő rendszer akkor használható, ha az E. coli-ban történő expresszió inaktív. A gén forrása szerint a gén meghatározásához az expressziós rendszer, a gén plusz affinitáscímkék a tisztítás megkönnyítése érdekében.

Enzim módosítás
① Racionális tervezés: a fehérje szerkezetére és funkciójára vonatkozó információk alapján a kódoló gén változás és a rekombinációs expressziós teszt.
Eljárás: először az enzim szerkezetét a BRENDA adatbázisból szerezzük be, majd az enzim szerkezetét módosítjuk, és az Alphafold2 segítségével megjósoljuk az enzim szerkezetét, majd PyMOL szoftverrel dokkoló elemzést végzünk az enzim és a ligandum molekula között, végül az új enzimszerkezetnek megfelelően a génszekvenciákat irányítottan mutáljuk, majd rekombinánsan expresszáljuk, hogy új enzimet kapjunk (az enzim hőstabilitásának, katalitikus hatékonyságának és szubsztrátspecifikusságának javítása érdekében).
② Irracionális tervezés: kódoló szekvenciák nagy gyakoriságú mutációja vagy rekombinációja, rekombináns expresszió és nagy áteresztőképességű tesztelés.

Ab initio tervezési folyamat: 2. nagy áteresztőképességű tesztelés 3. szerkezetazonosítás

A fehérjék irányított evolúciója
①Eredeti gének kiválasztása
②Establish egy sokszínűség génmutációs könyvtár létrehozása
③ Több mutált gén összekapcsolása vektorokban és expressziója a megfelelő törzsekben
④ Válasszon ki egy jó minőségű mutáns gént szűréssel, majd fejezze ki a mutáns gént nagy mennyiségben.

Mutáns génkönyvtárak létrehozásának módszerei
①In vivo nagy gyakoriságú véletlenszerű mutáció: E. coli XL1-Red gént használnak génreplikációs gazdatestként (hibás DNS-károsodást javító rendszer).
Plateau stádiumig tenyésztve átlagosan 1 bázismutáció történik 2Kb-onként.
②Random Mutagenesis kit: mutációs ráta 0,1 -1,6% /PCR, ami 1-16 bázismutációnak/génnek felel meg.
③ Pontról pontra történő telítési mutagenezis

Természetes evolúció: Rekombináció, természetes szelekció.
Mezőgazdasági evolúció: spontán mutáció, nemesítés, szűrés
Laboratóriumi evolúció: gyorsított mutációs ráta, molekuláris nemesítés, szűrés

DNS keverés
Fehérjemérnöki kísérleti stratégia
①Válassza ki a kiindulási gént egy inaktiválási rendszer és/vagy egy szűrési módszer létrehozásához.
②Ha a szerkezet-funkció kapcsolat ismert, először fogadjon el racionális tervezési módszert.
③Random mutáció finomhangolás és nagy áteresztőképességű szűrés
④Design a semmiből csak akkor, ha nincs megfelelő kiindulási gén.

Fehérje kutatási technikák
1 A fehérjék elválasztásával és tisztításával kapcsolatos fizikai és kémiai tulajdonságok
Molekulaméret (dialízis, ultraszűrés, gélszűrés, centrifugálás)
②Molekuláris forma (gradiens centrifugálás, elektroforézis)
(iii) Töltött tulajdonságok (elektroforézis, ioncserélő kromatográfia)
(iv) Szolubilizációs tulajdonságok (sózás, szerves oldószeres kicsapás)
⑤ Különbségek a ligandumokhoz való specifikus kötődésben (immunoaffinitás kromatográfia, bioaffinitás kromatográfia, fémkelát affinitás kromatográfia).
(vi) Adszorpciós tulajdonságok (hidrofób kromatográfia)
(vii) denaturáció és denaturáció (a karbamid denaturációja és denaturációja)

2 Fehérje expressziós rendszer
① Bakteriális expressziós rendszer: rövid ciklus, nagy hatékonyság, alacsony költség, de nincs poszttranszlációs módosítás. Elsősorban prokarióta fehérjék, egyszerű eukarióta fehérjék előállítására használják.
Expressziós vektor kiválasztása: pet sorozat, pGEX sorozat, PQE30......
Expressziós törzsek kiválasztása: BL21(DE3), Rosetta, M15......
Indukciós feltételek: IPTG-koncentráció, hőmérséklet és időtartam
Tisztítás: Ni-NTA (His tag), Strep-gyöngyök, GST.....

② Élesztő expressziós rendszer: rövid ciklus, nagy hatékonyság, alacsony költség, létezik poszt-transzlációs módosítás. Lesz nem megfelelő glikoziláció, magas mannóz módosítás. Elsősorban intracelluláris/szekréciós fehérjék, diszulfidkötő fehérjék, glikozilált fehérjék előállítására használják.

(iii) bakteriofág expressziós rendszer: nagy génkapacitás, fehérjeoldható, toxikus fehérjék előállítására alkalmas, poszttranszlációs módosítások az emlősökéhez hasonlóak. A tenyésztési körülmények zordak, és hiányzik néhány glikozilációs módosítás. Elsősorban membránfehérjék, nagy méretű fehérjék, vírusvakcinák, jelátviteli fehérjék, citokinek, kinázok előállítására használják.
A baculovírus genom hatalmas kapacitással rendelkezik az akár 38 kb-os exogén génbeillesztésekhez.
A baculovírusok rovarsejtekben termelődnek, és nem szaporodnak emlőssejtekben.
Előnyök: a baculovírusok hatékonyan transzdukálhatók emlős sejtvonalakban, beleértve az elsődleges és őssejteket is.
Biztonságos (nem szaporodik emlőssejtekben) és nincs megfigyelhető citopátiás hatása.
A fagyasztva tárolt, pre-transzdukált sejtek szintén felhasználhatók vizsgálati előkészítő sejtekként.
Hordozhatóság (farmakológiailag releváns sejttípusok elemzésére)
A tesztfejlesztés gyorsasága (nem kell időt fordítani stabil sejtvonalak létrehozására)

④ Emlős expressziós rendszerek: hosszú ciklusidő, alacsony hatékonyság, poszttranszlációs módosítások jelenléte, magas fehérje bioaktivitás. Elsősorban komplex eukarióta fehérjék, pontos PTM-et igénylő fehérjék előállítására használják.
Fehérjék tranziens expressziója: PEI vagy liposzómás transzfekciós reagensek
Stabil sejtvonal kifejlesztése: Flp-In™ Jump-In™ sejtszerkesztési platformok
Indukálható expresszió: Tetraciklin-szabályozott expresszió
Vírusos hordozással közvetített expresszió: lentivirális expressziós rendszer funkcionális elemzéshez; adenovirális expressziós rendszer fehérje előállításához.

3 Fehérjetisztítás
Miért kell tisztítani a fehérjéket?
Az érdeklődésre számot tartó fehérjék szerkezetének és működésének jellemzése.
(ii) A fehérje szabályozás és a fehérje kölcsönhatások tanulmányozása
③ antitestek előállítása
Tisztítási módszerek
Fizikai/kémiai tulajdonságok alapján
Fehérjeméret: dialízis, ultraszűrés, gélszűréses kromatográfia
Fehérje töltés: ioncserélő kromatográfia
Fehérje hidrofóbicitás: hidrofób kölcsönhatás kromatográfia

Biológiai tulajdonságok alapján: affinitáskromatográfia

①Dialízis
Befolyásoló tényezők: dializálócső MWCO; puffer térfogat; dialízis ideje; dialízis puffercsere gyakorisága.

Ultraszűrés
Centrifugális szűrés, a fehérje mérete kisebb, mint a szűrőcső pórusmérete, a cső aljára centrifugálódik.

③ Gélszűréses kromatográfia
Különböző méretű fehérjék elkülönítése

④Ioncserélő kromatográfia
Kationcserélő oszlop: a gél negatív töltésű, a fehérje pozitív töltésű.
Anioncserélő oszlop: a gél pozitív töltésű, a fehérje negatív töltésű.
Közepes
Inert hordozó: agaróz, dextrán
Töltött csoportok: karboximetil: negatív töltésű, dietil-amino: pozitív töltésű
Kiegyensúlyozó ionok: negatív töltésű csoportok: H+ vagy Na+ pozitív töltésű csoportok: OH- vagy Cl-
A fehérjék fokozatos vagy gradiens elúciója a sókoncentráció növelésével vagy a pH megváltoztatásával.

⑤ Affinitás kromatográfia
Az affinitáskromatográfia egy olyan módszer, amely a biomolekulák keverékből történő elválasztására szolgál, és a biomolekula és egy másik anyag közötti, nagyon specifikus makromolekuláris kötő kölcsönhatásokon alapul.
Példák: antigén kötődése antitestekhez, enzim kötődése ligandumokhoz, glutation és GST fúziós fehérjék kötődése, antibiotin fehérjék kötődése biotin-kötő molekulákhoz és fémionok kötődése polihisztidin fúziós fehérjékhez.

Immobilizált fémkelát kromatográfia (IMAC) poli-(His)-hez kötött fémionok (Ni 2+; Co 2+; Cu 2+) felhasználásával. ₆ megjelölt fehérjék.

Strep-jelölt fehérjék tisztítása
A gyöngyök képesek specifikusan adszorbeálni a strep-taggal ellátott fehérjéket, majd biotinnal a fehérje eluálható a gyöngyökből. (Az elv hasonló a GST pull down kísérlethez.)

proteinA/protein G affinitás kromatográfia
A géntechnológiával előállított A és G fehérje specifikusan képes kötődni az emlős IgG Fc régiójához. Az A és G fehérje oszlopanyaghoz kötésével az IgG és annak alosztályai és fragmentumai affinitáskromatográfiával tisztíthatók.
A fehérje: molekulatömege 42kDa, a spa gén kódolja, 5 izotípusos immunglobulin-kötő szerkezeti doménnel, amelyek mindegyike 3 alfa-hélixből áll.
protein G: 65 kDa molekulatömegű, az spg gén által kódolt fehérje, amely megköti az antitest Fc és Fab szegmensét, valamint a szérumban lévő albuminokat. A genetikailag módosított G fehérje eltávolítja az albumin kötőhelyét, és csak az Fc-kötő doménjét tartja meg, amely hatásosabb, mint az A fehérje.
proteinA/protein G: genetikailag módosított kötőfehérje. Ez 4 protein A és 2 protein G immunglobulin-kötő doménből áll, amely szélesebb kötési tartományt biztosít, mint a protein A vagy a protein G önmagában, és egyesíti előnyeiket egybe, amely szinte minden fajból származó IgG tisztítására alkalmazható.

Hogyan lehet azonosítani a tisztított fehérjét?
SDS-PAGE; HPLC; tömegspektrometria; Western blot; kötődési vizsgálatok; funkcionális vizsgálatok; szerkezeti felderítés.

4 Elektronmikroszkópia
Egyrészecske krio-elektronmikroszkópia (Single-ParticleAnalysis, SPA)
Krio-elektron-tomográfiás mikroszkópia (cryo-ET)

Lépjen kapcsolatba velünk most!

Ha szüksége van Price-ra, kérjük, töltse ki elérhetőségét az alábbi űrlapon, általában 24 órán belül felvesszük Önnel a kapcsolatot. Ön is küldhet nekem e-mailt info@longchangchemical.com munkaidőben ( 8:30-18:00 UTC+8 H.-Szombat ) vagy használja a weboldal élő chatjét, hogy azonnali választ kapjon.

Összetétel Glükoamiláz	9032-08-0
Pullulanase	9075-68-7
Xilanáz	37278-89-0
Celluláz	9012-54-8
Naringináz	9068-31-9
β-Amiláz	9000-91-3
Glükóz-oxidáz	9001-37-0
alfa-amiláz	9000-90-2
Pektináz	9032-75-1
Peroxidáz	9003-99-0
Lipáz	9001-62-1
Kataláz	9001-05-2
TANNASE	9025-71-2
Elasztáz	39445-21-1
Ureáz	9002-13-5
DEXTRANASE	9025-70-1
L-laktil-dehidrogenáz	9001-60-9
Dehidrogenáz malát	9001-64-3
Koleszterin-oxidáz	9028-76-6