Mi a számításos kémiai megközelítés az ipari enzimkutatásban?
A cikk bemutatja az ipari enzimkutatásban, különösen az enzimtervezés irányítására használt főbb számításos kémiai módszereket, beleértve a molekulamechanikai erőtér- és molekuladinamikai szimulációkat, a kvantummechanikai és kombinált kvantummechanikai/molekulamechanikai modellezést, a kontinuum elektrosztatikus modellezést és a molekuláris dokkolást. Ezeket a módszereket a szöveg két szempontból foglalja össze: egyrészt maguknak a módszereknek az alapfogalmait, az eredeti számítások eredményeit, az alkalmazhatóság feltételeit, valamint az előnyöket és hátrányokat; másrészt a számításokból nyert értékes információkat a mutánsok és mutánskönyvtárak tervezésének irányítására.
Az enzimek ipari alkalmazása több száz éves múltra tekint vissza, és az enzimkatalízist széles körben használják a különböző iparágakban, például az élelmiszeriparban, a mezőgazdaságban, az orvostudományban és a vegyiparban, mivel nagy hatékonyságú, nagy specificitású és szelektív, valamint környezetbarát. [1-2]. Mivel az ipari alkalmazási környezet messze eltér attól a környezettől, amelyben az enzimek a természetben élnek, a természetes enzimek jellege és katalitikus funkciója, valamint alkalmazási környezetük általában nem egyezik meg, vagy nem optimális. Ebben az esetben az enzim természetes aminosav szekvenciáját enzimtechnológia segítségével módosítani kell, hogy javuljon az enzim teljesítménye. [3]. A leggyakrabban alkalmazott enzimtechnológiai stratégia a mutációs könyvtárak létrehozása szűrés céljából, azaz a laboratóriumi irányított evolúció. [4]. A hatékony irányított evolúció egyik szükséges előfeltétele, hogy a szűrés alatt álló mutánskönyvtár könyvtárkapacitása (azaz a könyvtárban található mutánsok száma) kellően nagy legyen a könyvtárban található potenciálisan hasznos mutánsok arányához képest. A mutánskönyvtár méretét gyakran a szűrési módszer, a rendelkezésre álló erőforrások és egyéb objektív feltételek korlátozzák. A kulcskérdés az, hogy hogyan növelhető a mutánskönyvtárban lévő hatékony mutánsok aránya. Az enzimszekvencia, a szerkezet és a fontos tulajdonságok közötti kapcsolat mélyreható megértése segíthet a mutációs gócpontok azonosításában, a mutáció hatókörének korlátozásában és a minőségi mutánskönyvtár-tervezés megvalósításában. A számítógépes kémiai módszerek fontos eszközei ennek a megértésnek. Kimutatták, hogy a számítógépes tervezésen alapuló fehérjemutációs könyvtárak több nagyságrenddel növelhetik a hatékony mutánsok százalékos arányát a véletlenszerű mutációs könyvtárakhoz képest. [5]. Egyes nehéz enzimtechnológiai vagy fehérjemérnöki témák esetében a számítással elérhető jelentős javulás elegendő lehet a téma végső sikerének vagy kudarcának meghatározásához, ami már nem korlátozódik a hatékonyság javulására. A számítógépes kémia és a számítógépes biológia módszerei ugyanis sikeresen lehetővé tették olyan mesterséges enzimek tervezését a semmiből, amelyek olyan katalitikus funkciókkal rendelkeznek, amelyekkel a természetes enzimek nem rendelkeznek. Mivel ebben az albumban más áttekintések az aminosav-szekvenciák automatikus optimális tervezésének módszereivel foglalkoztak, ez a cikk az adott aminosav-szekvenciával rendelkező enzimek szimulálására és elemzésére szolgáló számítási módszerekre összpontosít. Természetesen a kutatók ezeket a módszereket használhatják a vad típus és a mutánsok külön-külön történő vizsgálatára, majd az eredmények összehasonlítására.
A fehérjék, különösen az enzimek tanulmányozása régóta a számítógépes kémiai kutatások egyik fontos területe. [6-8]. A fő módszerek közé tartoznak a klasszikus molekuláris mechanikai erőtereken alapuló molekuladinamikai szimulációk (klasszikus MD). [9], kvantummechanika (QM) [10] és kombinált kvantummechanikai/molekulamechanikai (QM/MM) módszerek [8,11-12], molekulák közötti komplexek előrejelzése, azaz molekuláris dokkolás (Docking) [13], és polarizálható kontinuum modell (PCM) az elektrosztatikus és oldószer hatások számszerűsítésére [ 14]. ), mint például a Poisson-Boltzmann-modell (PB) [14], és néhány geometriai tulajdonságokon alapuló modell. Ebben a tanulmányban két szempontból adunk áttekintést az egyes módszerekről: először magukról a módszerekről, beleértve az alapelveket, az eredeti számítási eredményeket, az alkalmazhatósági feltételeket, a (lehetséges) előnyöket és hátrányokat stb.; másodszor pedig arról, hogyan lehet ezeket a módszereket felhasználni a mérnöki szempontból fontos információk megszerzésére, például a katalitikusan releváns mechanizmusok mélyebb megértésére, elméleti előrejelzésekre vagy magyarázatokra a különböző mutánsok tulajdonságaiban vagy funkcióiban a vad típushoz képest bekövetkező változásokról, amelyek irányított evolúcióhoz szükséges, jó minőségű mutációs könyvtárak tervezéséhez, vagy jó minőségű mutációs könyvtárak tervezéséhez, vagy mutációs bankok tervezéséhez, vagy a nyers számítási eredmények elemzése alapján konkrét mutációs helyek és mutációs típusok javaslata stb. alapján.
1
Klasszikus molekuláris mechanikai erőtereken (MM) alapuló molekuladinamikai szimuláció (MD)
1.1
Bevezetés a módszerbe
Az enzimkatalízisben végbemenő kémiai változásokat egyelőre nem vesszük figyelembe, hanem csak az enzim konformációjának változását, az enzim és a reaktánsok (vagy termékek) közötti nem kovalens komplexek kialakulását és disszociációját a molekuláris hőmozgás következtében. E folyamatok során a molekula elektronállapota nem változik (pl. nem jönnek létre vagy szakadnak meg kovalens kötések), és a molekulamechanikai erőtérmodell érvényesül. Az úgynevezett molekulamechanikai erőtér egy olyan empirikus matematikai függvény, amely kifejezi egy molekuláris rendszer potenciális energiájának függését a molekuláris rendszer geometriai konfigurációjától (azaz a molekuláris rendszert alkotó összes atom térbeli koordinátáitól) (1A. ábra). Más szóval, ha a X az összes atom térbeli koordinátáinak ábrázolására, és VMM (X ) a molekuláris erőtér potenciális energiájának reprezentálására, a potenciális energia változik, ahogy a molekula az egyik konformációból X1 egy másikra X2:
∆VMM = VMM ( X2 ) – VMM ( X1 ).
A termodinamikai elmélet szerint a molekulában lévő atomok mindig hőmozgásban vannak, azaz, X folyamatosan változik az idővel; ráadásul amikor kísérleti megfigyeléseket végzünk, a minta mindig nagyszámú molekulából áll (az egymolekulás kísérletek kivételével), és a különböző molekulák különböző konformációs állapotokban vannak. Ezért kinetikai szempontból figyelembe kell vennünk a konformáció időbeli változását, termodinamikai szempontból pedig a különböző konformációs állapotú molekulák valószínűségi eloszlását. A molekuladinamikai szimuláció (MD) a legegyszerűbb modell a tulajdonságok e két aspektusának vizsgálatára (1B. ábra). Az MD-szimulációban egy kezdeti konformációból indulunk ki, minden egyes időpontban kiszámítjuk az egyes atomokra ható erőt az aktuális konformáció és a potenciális energiafüggvény alapján (az erő a potenciális energiafüggvény negatív deriváltja az atomok koordinátái tekintetében), numerikusan integráljuk Newton mozgásegyenleteit, hogy megkapjuk a konformációt a következő időpontban, és megismételjük a folyamatot, hogy megkapjuk a konformáció időbeli fejlődésének pályáját.
A kettő között speciális algoritmusok segítségével szimulálható a környezeti tényezők (pl. hőmérséklet, nyomás stb.) hatása a molekulák mozgására. A termodinamikai elv szerint, ha az időintervallum elég hosszú, akkor az azonos molekula különböző időpontokban kialakuló konformációjának és a termodinamikai egyensúlyi állapotban lévő különböző molekulák konformációjának valószínűségi eloszlása megegyezik (azaz az időátlagolás egyenértékű a rendszerátlagolással). Ezért, ha az MD-szimulációt elég hosszú ideig végezzük, a szimulációból kapott konformációk halmaza egy adott termodinamikai egyensúlyi állapotban a molekulakonformációk eloszlásának mintájaként használható. Ezen elv alapján az MD-vel kapott időbeli trajektóriák alapján elemezhetjük egy rendszer tetszőleges megfigyelhető tulajdonságait a termodinamikai egyensúlyi állapotban.
Az MD hatékony számítási eszközt biztosít a konformációs változások kinetikai változásainak és fontos mikroszkopikus kvantumtermodinamikai eloszlásainak átfogó, atomi felbontású elemzéséhez, ami különösen fontos a komplex biomolekuláris gépek, például az enzimek tervezési elveinek és működési mechanizmusainak feltárásához. Mivel a makromolekuláris szerkezetelemzés jelenlegi kísérleti módszerei csak tér-időben átlagolt statikus szerkezeteket tudnak szolgáltatni, az MD-szimulációk pótolhatatlan funkciót töltenek be a kapcsolódó kutatásokban. Ezen előfeltételezés alapján maga az MD eszköz még mindig a folyamatos fejlesztés és finomítás folyamatában van. Módszertanilag az MD fő korlátai két szempontból jelentkeznek: először is, a molekuláris erőtérmodell pontossága; másodszor, a korlátozott szimulációs idő megnehezíti a konformációs tér teljes mintavételezését. Az első probléma tekintetében a molekuláris erőtér az elmúlt években jelentősen javult, és a biológiai makromolekulák, különösen a fehérjerendszerek konformációs egyensúlyának termodinamikai leírásának pontossága nőtt, sikeresen szimulálva a különböző fehérjemolekulákat a fejhajtogatás folyamatától a természetes szerkezetig. [15-16]. Ami a szimulációs időt illeti, a számítógépes hardverek és szoftverek fejlődésének köszönhetően ma már a szokásos méretű rendszerek (pl. több száz maradékból álló enzimmolekulák vizes oldatban) esetében a hagyományos számítástechnikai hardverek (pl. a csoport által használt többmagos szerverek) segítségével mikroszekundumos nagyságrendű szimulációkat lehet végezni. Ezen az időskálán olyan folyamatok figyelhetők meg, mint a szerkezeti domének vagy gyűrűs régiók nyitása és zárása. Ha több számítási erőforrás áll rendelkezésre, olyan folyamatok közvetlen szimulációja is megvalósítható, mint a szubsztrátkötés/dissociáció. A szimuláció hatókörén túli időskálán zajló folyamatok (pl. allosztérikus fehérjék nagyléptékű funkcionális változásai stb.) tanulmányozására fokozott mintavételi módszerek alkalmazhatók [17], feltéve, hogy a felhasználó alaposabban ismeri az MD elméletét.
Jelenleg a legtöbb MD-szimulációs alkalmazás nanoszekundumtól a mikroszekundumig terjedő időskálákat fed le, és a konformációs tér mintavétele többnyire a kezdeti szerkezet környékére korlátozódik (egydoménes fehérjék esetében ez általában a 3-4 Å tartományba eső strukturális négyzetes középérték-eltolódás (RMS) emelkedése és csökkenése). Ezért ahhoz, hogy a szimulációs eredmények értelmezhetőek legyenek, ésszerű kezdeti szerkezetet kell használni az MD bemenetként. A legtöbb esetben kísérletileg meghatározott kristályszerkezeteket vagy homológ fehérjék összehasonlító modellezésén alapuló szerkezeteket használnak MD kiindulási szerkezetként. Enzim-szubsztrát komplexek szimulációjakor gyakran szükséges a komplex kezdeti szerkezetét az üres enzim vagy az enzim más molekulákkal alkotott komplexben lévő enzim szerkezete alapján modellezni, akár molekuláris dokkolással, akár a kristályszerkezetben lévő egyéb kismolekulák (pl. inhibitorok) szubsztráttal való közvetlen helyettesítésével. Az MD-szimulációkhoz egy olyan molekuláris erőtér megalkotására is szükség van, amely a rendszer összes kémiai egységét ábrázolja. Ha a szimulálandó rendszerben egy kis molekula szubsztrátként szerepel, gyakran előfordul, hogy az MD szoftvercsomagban biztosított standard molekuláris erőtér nem fedi le a kis molekulát mint szubsztrátot. Ebben az esetben olyan eszközszoftvereket lehet használni, amelyek automatikusan képesek kis molekulákhoz való erőtereket generálni. [18-19]. Az erőtérfájlokat kézzel kell ellenőrizni és rövid szimulációs próbákhoz használni, mielőtt az automatikusan generált erőtérfájlokat hosszú MD-szimulációkhoz használná.
Ábra. 1 Molekulamechanikai erőtér (A) és molekuladinamikai szimuláció (B)
1. ábra Molekulamechanikai erőtér (A) és molekuladinamikai szimuláció (B)
1.2
Alkalmazás az enzimkutatásban
Az MD-szimulációkból nyert információk különböző módon alkalmazhatók az enzimtechnikai módosítások irányítására. [20]. Például a szobahőmérsékletű és a magas hőmérsékletű MD-szimulációk összehasonlításával megjósolható, hogy az enzimmolekula mely régiói rendelkeznek a környezeti hőmérsékletre legérzékenyebb szerkezeti stabilitással. Prolin pontmutációk, diszulfidkötések stb. bevezetése ezekbe a régiókba potenciálisan növelheti az enzim hőállóságát. [21-24]. A stabilitás javításának másik stratégiája olyan mutánsok tervezése, amelyek több felületi hidrogén- és sókötést képeznek. [25-26]. Az ilyen mutánsok kísérleti validálása előtt a vad típusú és a mutánsok párhuzamosan szimulálhatók, hogy elméletileg felmérjék, hogy a mutáció elérheti-e a kívánt hatást. [27-28]. A hőmérsékleten kívül az MD használható a környezeti pH, oldószerek stb. változásainak a fehérje konformációjára és stabilitására gyakorolt hatásának elemzésére is. [29-30].
A stabilitás mellett az MD-t alkalmazták olyan hotspot-maradványok előrejelzésére is, amelyek jelentősen befolyásolhatják a szubsztrátkötéshez/termékfelszabaduláshoz kapcsolódó konformációs dinamikát, és így alapot szolgáltatnak olyan mutációk vagy mutánskönyvtárak tervezéséhez, amelyek megváltoztathatják a szubsztrát-szelektivitást, a reakciószelektivitást, a termékfelszabadulás sebességét stb. [31-32]. A szubsztrát/reakció szelektivitás MD-vel történő vizsgálatának egyik módja az, hogy összehasonlítjuk a különböző (kezdeti szerkezetű) enzim-szubsztrát komplexek szimulációs eredményeit, és megjósoljuk a nagyobb affinitású (vagy nagyobb reakcióképességű) szubsztrát vagy szerkezeti állapotokat. Az affinitás (vagy reaktivitás) kiszámításának szigorú kvantitatív módszere a szabadenergia-számítás. [33-34]. A szabadenergia-számítások számításigényes jellege miatt a legtöbb jelenlegi alkalmazás kvalitatív módszereket használ az előrejelzéshez: a relatív affinitás kvalitatív megkülönböztetése alapulhat a kis molekula-makromolekula komplexek szerkezetének stabilitásán, az átlagos intermolekuláris kölcsönhatási energián stb., míg a reaktivitás kvalitatív megkülönböztetése a katalitikus és reaktív funkciós csoportok relatív geometriai konfigurációs eloszlásán stb. alapul. [35]. Az ilyen minőségi megkülönböztetés eredményei alapul szolgálhatnak az irányított evolúciós szekvenciák könyvtárainak tervezéséhez. Ezenkívül az MD-szimulációk a szubsztrátkötő/termék-diszociációs pórus körüli hotspot-maradékok elemzésére is felhasználhatók. [36-37]. Az ilyen típusú alkalmazások a kis molekulák fehérjékből történő disszociációs útvonalainak szimulációját foglalják magukban, és ha a szimulációs időskálák elégtelensége miatt nehézségek merülnek fel, akkor ezeket a nehézségeket fokozott mintavételi technikákkal lehet áthidalni. [38-39].
2
Kvantummechanikai (QM) és kombinált kvantummechanikai/molekuláris mechanikai (QM/MM) modellek
2.1
Bevezetés a módszerbe
Az enzimkatalízis kémiai lépéseinek, például a kovalens kötések létrehozásának és felbontásának, az elektronátvitelnek és a különböző elektronállapotok közötti ugrásoknak a szimulálásához kvantummechanikai (QM) modellekre van szükség. Jelenleg a számításos kémiában általánosan használt QM modelleket több típusba sorolják, mint például ab initio ( ab initio ), a sűrűség-funkcionális elmélet (DFT) és a fél-empirikus módszerek [40]. Ezek közül a félempirikus módszerek a legkevésbé számításigényesek. Ezek azonban nem első elvi módszerek, és a számítási eredmények megbízhatósága nagymértékben függ az adott rendszertől és problémától. Mind az ab initio, mind a DFT módszerek első elvi módszerek és univerzálisak. A gyakorlati DFT-modellek több empirikus elméleti közelítést tartalmazhatnak, mint az ab initio számítások, de a DFT nagyon nagy számítási hatékonysággal képes kezelni az elektronok korrelációs energiáit. Emellett számos kémiai reakcióprobléma esetében a legjobb DFT-modellek számítási hibái a kulcsfontosságú paraméterek, például a reakciófolyamat során bekövetkező energiaváltozások esetében már csak kb. 1 kcal/mol körüli értéket érnek el, és az eredmények elegendőek ahhoz, hogy egy adott katalitikus mechanizmus vagy reakcióútvonal kémiai megalapozottságának meghatározásához alapul szolgáljanak.
Egy molekula geometriai konfigurációjának ismeretében az energiája a QM segítségével kiszámítható. Ezt nevezzük egypontos számításnak (azaz a geometriai konfigurációs tér egyetlen pontjával foglalkozik.) A QM modellt gyakrabban használják molekuláris geometriák optimalizálására, azaz arra, hogy egy kezdeti konfigurációtól való egymást követő változtatások után megtalálják a lokálisan stabil (a szomszédos szerkezeteknél alacsonyabb energiájú) szerkezetet, vagy hogy megtalálják a reaktánsokat a termékekkel összekötő, legkisebb energiájú pályákat és a pályák mentén az átmeneti állapotokat. Ezek a számítások számításigényesek, mivel különböző geometriai konfigurációkat kell figyelembe venni és összehasonlítani, és jellemzően több tíz-ezer egypontos számítást kell elvégezni. A számítási erőfeszítések megtakarítása érdekében gyakori stratégia, hogy először a reakcióútkeresések széles skáláját optimalizálják hatékony, korlátozott pontosságú QM-modellekkel, majd a keresett legalacsonyabb energiájú konfiguráció/útvonal közelében nagyobb pontosságú modellekkel végzik el a konfigurációoptimalizálást, vagy egypontos számításokat végeznek.
Jelenleg az első elvi QM-módszerek alkalmazása a teljes enzimmolekulára számításigényes, alapvetően az egypontos számításokra korlátozódik, és még mindig nem elég gyakorlatias. A QM/MM modellt (2. ábra) általában nagy molekulák esetében használják. [11]. Ebben a modellben a molekuláris rendszert legalább két részre osztják: a kémiai reakcióban közvetlenül részt vevő részt a QM-modellel, a többit pedig a molekuláris mechanikával (MM) kezelik. A QM-MM határok és kölcsönhatások kezelésére többféle stratégia létezik [41]. Az első elvi QM/MM modellekben a QM számítások sokkal költségesebbek, mint az MM. ezért a konformációs optimalizációs módszereket leginkább a QM régióra használják annak geometriájának előrejelzésére vagy szimulációjára, és molekuladinamikai szimulációkat használhatnak az MM rész mintavételezésére. [42]. Ez azt jelenti, hogy a számítási eredmények érzékenyebbek lehetnek a rendszer QM régiójának kezdeti szerkezetére. Ebben az esetben különböző kezdeti szerkezeti modellekkel végzett számítások szükségesek a megbízható eredmények eléréséhez. Ha a félempirikus módszerek [43] vagy empirikus valencia kötés elméletek [44-45] a QM részhez használják , lehetséges lehet a konformációs tér teljesebb feltárása és a kezdeti szerkezet hatásának csökkentése hosszabb QM/MM MD mintavételezéssel.
Ábra. 2 Kvantummechanikai (QM)/Molekuláris Mechanika (MM) modellek
2. ábra Kvantummechanikai (QM)/molekuláris mechanikai (MM) modell.
2.2
A módszer alkalmazása
Mindkettő a QM modell [10] és a QM/MM modell [41] széles körben használták az enzimkatalizált reakciók kémiai mechanizmusainak elméleti előrejelzésére és tesztelésére. Eredményeik segíthetnek abban, hogy felismerjük, mely kulcsfontosságú maradékok vesznek részt a kémiai reakciófolyamatban, megtaláljuk a reakció sebességkorlátozó lépését, modellezzük a reakció közbenső és átmeneti állapotainak szerkezetét, elemezzük, hogyan lépnek kölcsönhatásba az enzim környezetével stb. A QM klaszter modellel összehasonlítva a QM/MM modell reálisabban tudja szimulálni az enzim környezetét, amelyben a kémiai reakciócentrumok helyezkednek el. a QM/MM-et széles körben használják az enzimkatalízis kémiai mechanizmusának elméleti előrejelzésére/tesztelésére, valamint a környezeti aminosavmaradékok lehetséges hatásainak elemzésére és előrejelzésére a katalitikus folyamatra. [46]. Elvileg ezek az eredmények felhasználhatók irányított evolúciós mutációs könyvtárak tervezéséhez, amelyek célja a katalitikus aktivitás fokozása és a specifitás vagy szelektivitás megváltoztatása. Nagyobb kihívást jelentő vizsgálat lenne teljesen új mesterséges enzimek előállítása, amelyek új aktív centrumok tervezésén alapulnak a semmiből, a QM vagy QM/MM előre jelzett átmeneti állapotszerkezeti modellek alapján. [47].
3
Elektrosztatikus kontinuum közeg modellezése
3.1
A módszer elve
Az enzimkatalízis szinte mindig egy adott oldatkörnyezetben valósul meg. Az oldószerhatások döntően befolyásolják az enzimek tulajdonságait. A kémiai kezelések oldószerhatásainak kiszámítására szolgáló modellek két kategóriába sorolhatók: explicit oldószer-modellek, pl. a molekulamechanikai erőtérben vagy a QM-modellekben, ahol minden egyes oldószer-molekula és minden egyes atom explicit módon szerepel a modellben; és implicit oldószer- vagy kontinuumközeg-modellek. [48], ahol az oldószer molekulák és atomok nem szerepelnek a modellben, és az oldószerhatások kezelésére az ún. "oldószer-közepes mezők" szolgálnak. amely nem tartalmazza az oldószer molekulákat és atomokat, hanem az oldószerhatásokat egy ún. Az explicit oldószer-modell előnye, hogy képes az oldott anyagot és az oldószert teljesen konzisztens módon kezelni, reálisan modellezve az olyan specifikus kölcsönhatásokat, mint az oldott anyag-oldószer hidrogénkötés, sókötés stb. Hátránya, hogy az oldószermolekulák száma nagy és számításigényes. Ezenkívül az oldószer sztochasztikus emelkedése jelentősen hozzájárul a rendszer teljes energiájához, és hosszú szimulációs mintaátlagolást kell végezni az emelkedés hatásának kiküszöböléséhez. A rejtett oldószer modell ábrázolja az oldószer átlagoló hatását, és az oldószer termodinamikai emelkedését és süllyedését átlagoltuk.
Az egyszerűbb kezelés érdekében a rejtett oldószer modellben általában elkülönítjük a nem poláris oldószer hatását (hidrofób hatás) a poláris oldószer hatásától. A tapasztalat azt mutatja, hogy egy nem poláros oldott anyag szolvatációjának szabad energiája arányos az oldószerrel hozzáférhető felületével (SASA). Ezért ehhez az összetevőhöz gyakran a SASA szolvatációs modellt használják. E modell paraméterei közé tartoznak a SASA kiszámításához szükséges atomi sugarak, az oldószer-molekula sugara (vízmolekulák esetében 1,4 Å) és a SASA-val arányos szolvatációs szabadenergia arányossági állandója. Ezeket a paramétereket általában a kis molekulák szolvatációs szabad energiájának kísérleti értékeire való illesztéssel határozzák meg.
A poláris oldószerhatások figyelembevételére leggyakrabban használt modellek az oldószer által elfoglalt területet folytonos közegként kezelik, amelynek fajlagos dielektromos állandója (víz esetében 78,4), az oldott anyag területét pedig alacsony dielektromos állandójú (általában 2-8 értékű) közegként vagy vákuumként (1 dielektromos állandó) (3A. ábra). A folytonos közeget polarizálja az oldott anyag tartományban lévő töltéseloszlás által létrehozott elektrosztatikus mező, és az így létrejövő polarizált töltéseloszlás viszont elektrosztatikus mezőt hoz létre az oldott anyag tartományban, amely az oldott anyag töltésére hat. A polarizált töltések által létrehozott elektromos mezőt reakciómezőnek nevezzük. Ezért az elektrosztatikus folytonos közeg modellt reakciómező modellnek is nevezik. A folytonos közeg modellben, ahol az oldószer tartományban nincsenek szabad ionok, a térbeli elektrosztatikus potenciál és a térbeli töltéseloszlás közötti kapcsolat kielégíti a Poisson-egyenletet. Szabad ionokat tartalmazó oldatkörnyezet esetén az ionok térbeli eloszlását a térbeli elektrosztatikus potenciál befolyásolja. Ezt a tényezőt figyelembe véve a térbeli elektrosztatikus potenciál és a térbeli töltéseloszlás közötti kapcsolat a Poisson-Boltzmann-egyenletet (PB-egyenlet) elégíti ki.A PB-egyenlet egy részleges differenciálegyenlet, amely az elektrosztatikus potenciál eloszlása, valamint a töltés és a dielektrikum háromdimenziós térben való eloszlása közötti kapcsolatra vonatkozik, és numerikusan megoldható. A PB-egyenlet megoldásának legelterjedtebb numerikus módszere makromolekuláris rendszerek, például enzimek esetében a véges differenciák módszere (FD), amelyet együttesen FDPB-modellnek neveznek (3B. ábra). [14]. Az FDPB segítségével három dimenzióban kiszámítható az elektrosztatikus potenciál az oldott anyag térbeli töltéseloszlása alapján, ami viszont lehetővé teszi más tulajdonságok, például az elektrosztatikus szabad energia kiszámítását. A kis molekulájú rendszerek QM-számításaiban a reakciómezőt gyakran egyenértékűen a molekula felületén lévő felületi töltéseloszlás által létrehozott elektromos mezővel helyettesítik, és a megfelelő modellt polarizálható folytonos közeg (PCM) modellnek nevezik.
A poláris oldószerhatások figyelembevételére leggyakrabban használt modell az oldószer által elfoglalt területet folyamatos közegként kezeli, amelynek fajlagos dielektromos állandója (víz esetében 78,4) van, míg az oldott anyag régióját úgy kezeli, mintha azt alacsony dielektromos állandójú (általában 2-8 értékű) közeg vagy vákuum (1 dielektromos állandó) foglalná el (3A ábra). A folytonos közeget polarizálja az oldott anyag tartományban lévő töltéseloszlás által létrehozott elektrosztatikus mező, és az így keletkező polarizált töltéseloszlás viszont elektrosztatikus mezőt hoz létre az oldott anyag tartományban, amely az oldott anyag töltésére hat. A polarizált töltések által létrehozott elektromos mezőt reakciómezőnek nevezzük. Ezért az elektrosztatikus folytonos közeg modellt reakciómező modellnek is nevezik. A folytonos közeg modellben, ahol az oldószer tartományban nincsenek szabad ionok, a térbeli elektrosztatikus potenciál és a térbeli töltéseloszlás közötti kapcsolat kielégíti a Poisson-egyenletet. Szabad ionokat tartalmazó oldatkörnyezet esetén az ionok térbeli eloszlását a térbeli elektrosztatikus potenciál befolyásolja. Ezt a tényezőt figyelembe véve a térbeli elektrosztatikus potenciál és a térbeli töltéseloszlás közötti kapcsolat a Poisson-Boltzmann-egyenletet (PB-egyenlet) elégíti ki.A PB-egyenlet egy részleges differenciálegyenlet, amely az elektrosztatikus potenciál eloszlása, valamint a töltés és a dielektrikum háromdimenziós térben való eloszlása közötti kapcsolatra vonatkozik, és numerikusan megoldható. A PB-egyenlet megoldásának legelterjedtebb numerikus módszere makromolekuláris rendszerek, például enzimek esetében a véges differenciák módszere (FD), amelyet együttesen FDPB-modellnek neveznek (3B. ábra). [14]. Az FDPB segítségével három dimenzióban kiszámítható az elektrosztatikus potenciál az oldott anyag térbeli töltéseloszlása alapján, ami viszont lehetővé teszi más tulajdonságok, például az elektrosztatikus szabad energia kiszámítását. A kis molekuláris rendszerek QM-számításaiban a reakcióteret gyakran egyenértékűen helyettesítik a molekula felületén a felületi töltéseloszlás által létrehozott elektromos térrel, és a megfelelő modellt polarizálható folytonos közeg (PCM) modellnek nevezik.
Ábra. 3 Elektrosztatikus kontinuum modell (A) és véges-differencia Poisson-Boltzmann (FDPB) módszer (B)
3. ábra Elektrosztatikus kontinuum modell (A) és a véges differencia Poisson-Boltzmann (FDPB) módszer (B).
3.2
A módszer alkalmazása
A kontinuummodell egyik fontos alkalmazása az enzimmolekulák töltött aminosav-oldallánccsoportjainak protonálódási állapotának vizsgálata. A PROPKA szoftver az egyes disszociálható csoportok pKa értékét a PB-egyenlet megoldásával jósolja meg, hogy kiszámítsa az elektrosztatikus szabad energiát a különböző protonálódási állapotokra. [50]. Az enzimmolekula felületi elektrosztatikus potenciáleloszlása fontos tényező, amely befolyásolja az enzim szubsztrát-szelektivitását. Az enzimmolekula térbeli szerkezetének és protonáltsági állapotának ismeretében az enzimmolekula felületi elektrosztatikus potenciáleloszlása kiszámítható az FDPB módszerrel, amely az aminosav-maradékok mutációinak vagy a környezeti pH változásának, az ionkoncentráció változásának stb. a felületi elektrosztatikus potenciálra gyakorolt hatását is előre jelzi. [14].
Az enzimkatalízis kémiai lépéseinek QM klasztermodellel történő vizsgálatakor gyakran szükséges a PCM modell használata a környezetnek a reakciózónára gyakorolt elektrosztatikus hatásának szimulálásához. Ha a reakciófolyamat a töltéseloszlás jelentős változásaival jár, a folytonos közeg használata nélküli vákuum QM-számítások eredményei nem ésszerűek, sőt téves minőségi következtetésekhez vezethetnek. A QM/MM modellben a reakciócentrumot általában oldható molekulák veszik körül, amelyeket MM módon kezelünk, és általában nincs szükség a folytonos közegű reakciómező figyelembevételére. Ha azonban a rendszer nettó töltése a reakció előtt és után változik (pl. redoxpotenciál-számítások), akkor valószínűleg figyelembe kell venni a rendszerhatáron kívüli oldatkörnyezet hozzájárulását a reakció szabad energiájához, és ebben az esetben a QM/MM eredmények a folytonos közeg modell segítségével korrigálhatók.
Az MM/PBSA a hatékonyság és a pontosság egyensúlyát biztosító módszer, amely a fehérje-fehérje és fehérje-kismolekula komplexek affinitásának elemzésére használható. [49]. A hibaelhárítás elérése érdekében a komplexek explicit szolvens molekuladinamikai szimulációit szokás elvégezni, hogy a konformációk gyűjteményét kapjuk; minden egyes komplex-konformációra kiszámítjuk a komplex egészének, illetve a komplexet alkotó egyes monomerek MM/PBSA energiáját; és a kötés szabad energiáját a teljes konformációra vonatkozó MM/PBSA energia és a monomerek MM/PBSA energiája közötti különbség átlagának felhasználásával közelítjük. Ez a módszer használható a szubsztrát-affinitást befolyásoló hotspot-maradványok elemzésére, valamint a mutánsok szubsztrát-szelektivitás-változásainak előrejelzésére is.
4
Egyéb módszerek
4.1
Molekuláris dokkolás
A dokkolás egy komplex szerkezetének (és affinitásának) megjóslására szolgáló számítási folyamat, amely a monomer szerkezetén alapul. A kismolekula-fehérje dokkolás a gyógyszerek szerkezetalapú virtuális szűrésének központi eszköze, amelyre számos algoritmust fejlesztettek ki. [13]. Ezek az algoritmusok és modellek a szubsztrát-enzim komplexek dokkolására is alkalmazhatók. A virtuális gyógyszerszűrés nagyszámú különböző kismolekula figyelembevételét igényli, és számítási hatékonysági okokból a molekuláris dokkolási számítások során gyakran nem veszik figyelembe a receptor (vagy csak az oldallánc) szerkezeti változásait. A virtuális szűréssel ellentétben a szubsztrát-enzim dokkolási vizsgálatokban gyakran csak egy vagy több különböző szubsztrátot vesznek figyelembe, és az enzim szerkezeti változásait elvileg teljesebben figyelembe lehet venni. Ennek legegyszerűbb módja az, hogy konformációs mintavételi módszerekkel, például MD-vel, változatos enzimszerkezeteket kapunk, amelyeket külön dokkolunk a szubsztráthoz. A szubsztrát-enzim dokkolásban gyakran a szubsztrát és a katalitikus funkciós csoportok relatív térbeli elrendeződését is fel lehet használni a dokkolási eredmények szűrésére/értékelésére.
4.2
Kis molekulák pórusainak előrejelzése a geometria alapján
Számos kísérleti vizsgálat kimutatta, hogy az aktív centrumtól távol eső mutációk nagy hatással lehetnek az enzimek katalitikus teljesítményére. E helyek némelyike a szubsztrátkötő/termékfelszabadító pórus megváltoztatásával hathat, és a pórus mérete, a pórus körüli maradékok fizikai-kémiai tulajdonságai stb. megváltoztathatják a szubsztrát/termék átjutási sebességet és befolyásolhatják a szubsztrát-szelektivitást. A pórusok előrejelzési módszerei felhasználhatók a releváns forró maradékok megtalálására, és alapul szolgálhatnak az irányított evolúciós könyvtárak tervezéséhez. Számos geometriai szerkezeten alapuló módszer áll rendelkezésre a fehérjefelszíni gödrök, belső üregek, különböző régiókat összekötő pórusok stb. előrejelzésére. [51-53]. Ezek a módszerek statikus térbeli struktúrákat használnak bemenetként, és többnyire geometriai és gráfelméleti módszereket alkalmaznak a nagy számítási hatékonyságú előrejelzés megvalósítására.
4.3
Aktív központ összehasonlító módszerek
Jelenleg a Protein 3D Structure Database-ben (PDB) nagy mennyiségű, különböző szerkezetű és családba tartozó enzimek 3D szerkezetére vonatkozó adat halmozódott fel. Ha összehasonlítjuk a különböző enzimeket, azt találjuk, hogy némelyikük aktív centrumai nagyfokú hasonlóságot mutatnak (tipikus példa erre a szerinproteázok közös katalitikus triád aktív centrumai), még akkor is, ha a teljes szerkezeti szekvenciák nem hasonlóak. Az aktív központ szerkezetének összehasonlítási módszere [54-55] lehet segítségével automatikusan lekérdezhetők más enzimek aktív centrumai, amelyek hasonlóak az aktuális enzim aktív centrumához. Több hasonló aktív centrum egymásra helyezése a háromdimenziós térben és a különböző aktív centrumok közötti hasonlóságok és különbségek elemzése értékes információt nyújthat a mutációs helyek kiválasztásához.
5
Összefoglaló
Az áttekinthetőség kedvéért a fenti módszerek bemutatása kategorizálva történik. A gyakorlatban a különböző típusú módszerek nem zárják ki egymást. Sokféleképpen kombinálva is felhasználhatók, hogy jobban megválaszoljuk a minket érdeklő kérdéseket. Például enzim-szubsztrát komplex szimulációkban a molekuláris dokkolás használható a szimuláció kezdeti konformációjának meghatározására; az MD szimulációkból kapott konformációk halmaza felhasználható póruspredikciós elemzéshez, molekuláris dokkoláshoz, QM/MM szimulációkhoz stb.; a QM vagy QM/MM modellekből kapott átmeneti állapotokat beíró MM modellek építhetők és használhatók hosszú ideig tartó klasszikus MD-szimulációkhoz a konformáció emelkedésének és csökkenésének a kémiai folyamatokra gyakorolt hatásainak elemzésére, vagy a nagyszámú mutáns szimulációjához a mutánsok virtuális szűrésének MD-szimulációkon alapuló megvalósításához; a már említett MM/PBSA megközelítés az MD és a kontinuum közeg modellezés kombinációja, és így tovább.
A biomolekula rendszerek, például a fehérjék számításos kémiai módszerekkel történő tanulmányozása több mint 40 éves múltra tekint vissza. Ezeket a módszereket egyre szélesebb körben használják az ipari enzimkutatásban, miközben folyamatosan fejlődnek. Kína kutatócsoportjai mind a számításos kémia, mind az ipari enzimtechnika területén egyre bővülnek, és kutatási képességeik gyorsan fejlődnek. A számításos kémia alkalmazása az enzimtechnológiában egyre szélesebb körűvé és mélyebbé válik, ahogy e két tudományág kereszteződése egyre szorosabbá válik. A fehérjemérnökség, az irányított evolúció és más technikák nagy hatással voltak az ipari enzimkutatásra. A számítási módszerek jövőbeli fejlődése, különösen az új enzimtervezési módszerek áttörése várhatóan új technológiai áttörést hoz az ipari enzimkutatás számára a szintetikus biológia korszakában.
Lépjen kapcsolatba velünk most!
Ha szüksége van Price-ra, kérjük, töltse ki elérhetőségét az alábbi űrlapon, általában 24 órán belül felvesszük Önnel a kapcsolatot. Ön is küldhet nekem e-mailt info@longchangchemical.com munkaidőben ( 8:30-18:00 UTC+8 H.-Szombat ) vagy használja a weboldal élő chatjét, hogy azonnali választ kapjon.
| Összetétel Glükoamiláz | 9032-08-0 |
| Pullulanase | 9075-68-7 |
| Xilanáz | 37278-89-0 |
| Celluláz | 9012-54-8 |
| Naringináz | 9068-31-9 |
| β-Amiláz | 9000-91-3 |
| Glükóz-oxidáz | 9001-37-0 |
| alfa-amiláz | 9000-90-2 |
| Pektináz | 9032-75-1 |
| Peroxidáz | 9003-99-0 |
| Lipáz | 9001-62-1 |
| Kataláz | 9001-05-2 |
| TANNASE | 9025-71-2 |
| Elasztáz | 39445-21-1 |
| Ureáz | 9002-13-5 |
| DEXTRANASE | 9025-70-1 |
| L-laktil-dehidrogenáz | 9001-60-9 |
| Dehidrogenáz malát | 9001-64-3 |
| Koleszterin-oxidáz | 9028-76-6 |