프로테아제 생산 균주의 변형
프로테아제는 동물, 식물 및 미생물에서 널리 발견되는 단백질의 펩타이드 결합 가수분해를 촉매하는 효소의 일종으로, 산업용 효소 종에서 가장 많이 사용되는 효소 제제 중 하나이며 전체 효소 양의 약 60%를 차지합니다. 프로테아제의 미생물 공급원은 풍부하고 다양하며 생산하기 쉬워 시중에서 프로테아제의 주요 공급원이 되고 있습니다. 프로테아제의 상업적 생산은 지난 세기 초로 거슬러 올라갈 수 있으며, 1908 년 독일인들은 췌장 효소 무두질 가죽을 사용하기 시작했고 1911 년 미국 월러 스타 인 회사는 맥주 정화제로 파파인을 생산했으며 60 년대 초 네덜란드는 프로테아제를 첨가하여 세제를 생산했습니다. 또한 내열성, 내산성, 내염성 프로테아제 생산 박테리아 선택 및 번식뿐만 아니라 알칼리성 프로테아제 연구의 원료 발효 생산으로 석유를 수행하기 위해 실용성과 결합되었습니다.
프로테아제에는 많은 종류가 있으며 분자량 크기, 공간 구조 및 기능이 매우 다르지만 각 프로테아제 계열은 여전히 고도로 보존된 구조 도메인을 유지합니다. 현재 100가지 이상의 프로테아제가 결정화되거나 고도로 정제되었으며, 그 중 많은 종류의 프로테아제가 1차 및 입체 구조(3차 구조) 측면에서 해명되었습니다.
2 프로테아제 균주 변형
프로테아제의 효율적인 발현과 효소 특성의 최적화를 위한 엔지니어링 박테리아의 구축은 국내외 학자들의 뜨거운 관심사이며, 일반적으로 사용되는 방법은 돌연변이 육종, 원형질 융합, 유전자 조작 박테리아 구축, 체외 방향성 진화 기술 등이 있습니다.
2.1 돌연변이 유발 육종 및 원형질 융합
돌연변이 육종은 주로 방사선 돌연변이 유발 또는 일부 화학 시약을 통해 박테리아의 유전 물질에 돌연변이를 유도하여 우수한 형질을 가진 돌연변이 균주를 얻습니다. 예를 들어, Cai Wanling 등이 효소 생산 균주의 UV 돌연변이 유발 후, 효소 활성은 원래 균주에 비해 16% 증가했습니다. Yanli Li 등은 Co60 유도 돌연변이 유발을 통해 아스퍼질러스 오리제 ZW-06의 중성 프로테아제 생산 효소 활성을 최대 15,000 U/g의 건조 두부까지 스크리닝했으며, 이는 돌연변이 유발 전보다 74% 더 높았습니다. 황홍잉 등은 야생형 바실러스 리케니포르미스에 저에너지 N+ 이온 주입 기술을 다양한 물리화학적 돌연변이 유발 수단과 4회 결합하여 고수익 균주인 12425의 조효소 활성을 얻었습니다. 9 U/mL로 출발 균주보다 17.1배 높았습니다.
원형질 융합 기술은 양부모 균주의 세포를 원형질 융합을 위해 벽을 제거하여 유전체를 교환하고 재조합하여 안정적인 재조합체를 얻는 과정입니다. 예를 들어, 판 야윈 등은 원형질 융합 방법을 사용하여 바실러스 리케니포르미스 2709와 알칼리성 프로테아제 유전자 복제 벡터 pDW2를 포함하는 바실러스 서브틸리스 BD105를 융합하여 발효 효소 생산량이 2709보다 50%-100% 높고 셰이크 플라스크 테스트에서 최대 30,000 U/mL의 효소 생산량을 가진 고수익성 균주 A16을 얻었습니다.
2.2 유전공학 박테리아의 구축
엔지니어링 박테리아를 제작하려면 일반적으로 적합한 발현 숙주와 발현 벡터 또는 발현 요소가 필요합니다. 먼저, 표적 유전자를 발현 벡터에 복제하여 재조합 벡터를 얻은 다음 스크리닝 과정을 통해 발현 숙주로 형질 전환하고 마지막으로 고수율 균주 프로세스를 얻습니다. 외인성 표적 유전자 조각을 숙주의 게놈에 직접 통합하여 고수익 균주를 얻을 수도 있습니다.
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민 장 등은 sacB 유전자의 프로모터 신호 펩타이드 서열(sacR)을 바실러스 서브틸리스 중성 프로테아제 유전자와 연결하고 이를 벡터 pHP13에 복제하여 중성 프로테아제 유전자를 포함하는 유도 발현 분비 벡터 pHP13SN을 만든 후 이를 바실러스 서브틸리스 DB104로 형질 전환하여 출발 균주에 비해 48% 효소 생존율이 증가했음을 보여주었습니다. 왕후이 등은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 K11에서 중성 프로테아제인 Banpr을 복제하고 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 K11을 발현 숙주로 재조합 발현 플라스미드인 pUB110-Banpr을 제작했으며, 셰이크 플라스크 발효에서 효소 활성은 8995 ± 250 U/mL, 15L 발효 시스템에서 28084 ± 1282 U/mL에 달했으며 이는 산업용 균주인 바실러스 서브틸리스 AS.1398의 효소 활성(8000~1만 U/mL) 보다 훨씬 더 높았습니다. (8000-10000 U/mL)보다 더 높은 수치입니다.
2.3 프로테아제 특성 개선
체외 유도 진화 기술의 발달로 표적 단백질의 3차원 구조 정보와 작용 메커니즘에 대한 지식 없이도 코딩 유전자의 무작위 돌연변이, DNAShuffling 기술 및 직접 스크리닝을 통해 개선되거나 새로운 기능을 가진 단백질을 얻을 수 있습니다.
효소의 안정성은 상업화 성공의 핵심 요소입니다. 효소의 안정성은 염교, 이황화 결합, 방향족 상호작용을 도입하고 칼슘 이온에 대한 효소의 친화력을 높여 표적 돌연변이 유발을 통해 분자의 강성을 증가시킴으로써 개선할 수 있습니다. 프로테아제 BPN'의 Gly61 또는 Ser98을 Cys로, 또는 둘 다로 대체하면 촉매 효율의 변화 없이 효소의 열 안정성이 증가했습니다.
B. 서브틸리스 프로테아제의 Val72를 Ile로, Ala92를 Thr로, Gly131을 Asp로 대체함으로써 돌연변이 효소는 10°C에서 야생 효소보다 2배 더 높은 기질 활성을 촉매할 수 있습니다. 2005년에 덴마크 회사 Novozymes는 세제에 첨가할 수 있는 저온 프로테아제 "Polarzyme"을 출시했습니다. 세제에 첨가해 세탁 온도를 60°C와 40°C에서 30°C와 20°C로 낮춰 60%의 전력을 절약했고, 저온 프로테아제를 첨가한 세제 '케어콜드워시'의 판매량은 7배나 증가했습니다.
3 전망
프로테아제는 일상 생활과 밀접한 관련이 있는 다양한 분야에서 사용되고 있으며, 이러한 환경은 프로테아제의 생산 및 특성 분석에 대한 높은 요구 사항을 제시합니다. 따라서 프로테아제의 촉매 메커니즘, 공간 구조와 촉매 기능의 관계, 산업 생산의 요구 사항을 충족하기 위한 효소 생산 균주의 방향 수정에 대한 심층적 이해는 향후에도 효소 공학의 발전 추세입니다. 또한 좋은 균주의 선택과 육종 외에도 새로운 발현 시스템 또는 다중 프로테아제 유전자 공 발현 시스템을 구축하고 프로테아제에 대한 더 많은 발현 벡터를 구축하여 다양한 성분의 효과적인 발현을 실현하고 발현량, 효소 활성 및 효소 안정성을 더욱 향상시키기 위해 노력해야합니다.
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