파라 니트로페놀 분광광도법은 α- 람노시다아제 및 β- 글루코시다아제의 효소 활성을 검출하기 위해 기질로 p- 니트로페놀- α- 람노사이드 (pNP- α- Rha) 및 p- 니트로페놀-β-D- 글루코피라노사이드 (pNP- β-Glu)를 사용합니다. 리핑은 효소 가수분해를 위해 아스퍼질러스 니거 β- 글루코시다제를 p- 니트로페놀 -β- 글루코사이드 용액에 첨가하는 실험에서 p- 니트로페놀 분광광도계 방법을 사용했고, 흡광도 값은 400nm 자외선 파장에서 측정했습니다. 그리고 흡광도 값을 기준으로 β- 글루코시다아제의 효소 활성을 계산합니다. 이 방법은 기질 특이성이 강하지 만 표준 기질은 비싸고 식품에서 배당체를 가수 분해하는 나린 기나 제의 효소 활성을 결정할 수 없으므로이 방법은 나린 기나 제의 산업적 대규모 제조에서 효소 활성 검출에 적합하지 않습니다.
데이비스 분광 광도계 방법의 원리는 나린진이 약 알칼리성 조건에서 90% 디 에틸렌 글리콜과 발색 반응 반응을 일으킬 수 있으며, 420nm 파장의 자외선 아래에서 노란색 나린진 칼콘 생성을 검출 할 수 있다는 것입니다. 측정 된 흡광도 값에 따라 기질 나린진의 남은 양을 계산할 수 있으며, 계산을 통해 나린 기나 제 활성을 얻을 수 있습니다. 왕 웨이나 등은 개선된 데이비스 방법을 사용하여 나린진을 기질로 삼고 효소 가수분해를 위해 아스퍼질러스 니거 FFCC 848의 액체 발효에 의해 생성된 나린기나제를 첨가했습니다. 420nm 자외선 아래에서 흡광도를 측정한 후 효소 활성을 계산했습니다. 효소 활성 측정을 위한 데이비스 분광광도계 방법은 조작이 간단하고 속도가 빠르기 때문에 발효에 의한 나린기나제 생산 및 고정화된 나린기나제 활성의 적시 검출에 널리 사용되고 있습니다.
1-2 고성능 액체 크로마토그래피
고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)의 원리는 전체 가수분해 과정에서 기질 나린진, 중간 생성물 푸루닌 및 최종 생성물 나린게닌을 정확하게 결정하고 정량적으로 분석한 다음 효소 활성을 계산할 수 있다는 것입니다. Chen Yuelong 등은 HPLC를 사용하여 나린진, 알부틴, 미리세틴 및 그 제품의 체류 시간을 결정하고 1.5 이상의 분해능으로 완전한 분리를 달성했으며 가수 분해 과정에서 여러 배당체에 대한 나린기나제의 효과를 효과적으로 모니터링하는 동시에 효소 활성을 정확하게 결정했습니다. HPLC 방법은 정확도가 높고 불순물의 간섭을 피할 수 있다는 장점이 있지만 데이비스 방법에 비해이 방법은 검출 시간이 길고 작동이 더 복잡합니다.
1-3 나린지나제 효소 활성 측정 방법 개선
개선된 데이비스 방법 사용: 0.8 g-L의 0.8 mL-1 pH 4.5 완충액으로 제조한 나린진 용액을 고정된 나린기나제 40mg(또는 유리 나린기나제 0.2mL)을 포함하는 반응 시스템에 첨가했습니다. 50℃ 항온 수조에 30분간 놓아둡니다. 반응 효소 가수분해 용액 0.1mL를 취하고 디에틸렌 글리콜(90% 부피 분획) 5mL와 NaOH 용액 0.1mL(4mol-L)를 첨가합니다.-1)을 튜브에 넣고 균일하게 섞은 후 10분간 그대로 둡니다. 혼합 용액의 흡광도를 420nm에서 측정합니다.
나린기나제 효소 활성(U)의 정의 : pH 4.5, 50℃ 조건에서 1 효소 활성 단위는 분당 1μg의 나린기를 분해하는데 필요한 효소의 양을 의미합니다. 효소 활성비 ( U-g-1 또는 U-mL-1)는 pH 4.5, 50 ℃의 조건에서 고정화 나린기나제(또는 유리 나린기나제 1 mL)가 나타내는 효소 활성으로 정의됩니다. 상대 효소 활성은 다음 공식에 따라 계산됩니다:
상대적 효소 활성 /% = 효소 활성/최대 효소 활성×100
표준 곡선 결정 : 표준 배당체 나린진 용액의 질량 농도는 0, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6 g - L로 배열됩니다.-10.1mL 용액을 취한 다음 5mL의 디 에틸렌 글리콜 (90% , v / v) 및 0.1mL 수산화 나트륨 용액 ( 4 mol-L)과 반응시키기 위해 취했습니다.-1). 혼합물을 균일하게 혼합하고 10분간 방치한 후 혼합 용액의 광 흡수 값을 420nm에서 측정하고 그에 따라 표준 곡선을 그렸습니다.
2. 나린기나제 효소 용액 준비
4 ℃에서 보관 된 Aspergillus niger FFCC uv-11을 경사 배지로 옮기고 30 ℃에서 96 시간 동안 일정한 온도 배양하여 성숙한 포자를 얻었습니다. 그런 다음 포자를 0.9%의 질량 분율로 멸균 생리 식염수로 세척했습니다. 포자 현탁액의 흡광도 값은 600nm (OD600 값)에서 측정하고 멸균 식염수를 사용하여 OD600 값을 0.200으로 조정했습니다. 그런 다음 10% 접종량의 부피 분율로 포자 현탁액을 100mL의 발효 배지 (250mL 원추형 플라스크)에 넣고 얻은 발효 국물을 4 ℃ 및 6000 r-min에서 원심 분리했습니다.-1 를 냉장 원심분리기에서 10분간 돌립니다. 그런 다음 흡입 필터를 통해 나린진 효소 효소액에 필요한 상청액을 얻습니다. 나중에 사용할 수 있도록 4℃에서 차갑게 보관합니다.
3. 키토산 고정화 나린기나제 효소의 제조
키토산 3.0g을 취하고 2% 아세트산 용액 100mL의 부피 분획을 용해하여 0.3g-L을 준비합니다.-1 키토산 콜로이드 용액을 20분간 초음파 처리하여 기포를 제거하고 완전히 녹도록 했습니다. 키토산 콜로이드 용액을 바늘로 0.5g - L에 한 방울씩 주입했습니다.-1 NaOH 응축액(1000mL)을 사용하여 부드러운 펠릿을 형성합니다. 실온에서 3시간 동안 방치하고 펠릿을 증류수로 반복적으로 세척하여 중성으로 만든 후 여과지에 물을 흡수하여 키토산 마이크로스피어를 얻었습니다. 키토산 마이크로스피어 0.4g의 무게를 측정하고 6% 부피 분율의 글루타르알데히드 0.4ml를 첨가한 후 25℃ 150 r-min에서 일정한 온도와 진동 후 마이크로스피어 표면에 글루타르알데히드가 없을 때까지 증류수로 반복적으로 세척하여 마이크로스피어를 중화시켰습니다.-1 여과지로 건조하여 가교된 키토산 마이크로스피어를 얻었습니다.
그는 0.4g의 키토산 마이크로 스피어, 0.4 mL 크레딧 6% 글루타르 알데히드, 150 r - 분에서 0.4 mL 멤버 수를 추가한다고 말했습니다.-1 25 ℃ 온도 진동에서 2 시간 후 증류수 마이크로 스피어로 반복적으로 세척하여 표면에 펜틸 디 알데히드와 여과지를 건조하여 가교 된 키토산 마이크로 스피어를 얻습니다. 나린 기나 제 효소 용액 4mL를 0.4g의 가교 키토산 마이크로 스피어에 첨가하고 25 ℃의 일정한 온도, 150 r-min에서 흔들어줍니다.-1 2시간 동안 흡착 결합을 위해 4℃ 냉장고에 4시간 동안 보관합니다. 담체 표면에 남아있는 효소 용액을 pH 4.5 완충액으로 헹구고 여과지의 물을 흡수하여 고정화된 나린기나제를 얻은 후 나중에 사용하기 위해 4℃ 냉장고에 보관합니다.
4. 자성 실리콘 기반 키토산(MSC) 마이크로스피어 제조
자성 실리콘 기반 나노입자(MS)의 제조 과정은 그림 1에 나와 있습니다.
그림 1 자성 실리콘 기반 나노 입자 제조의 개략도
(1) 첫째, 자성 Fe3O4 구연산으로 개질된 나노 입자는 화학적 공침법으로 제조되었으며, 실험 절차는 다음과 같습니다: 2.25g의 FeCl3-6H2O와 1.61g의 FeSO4-7H2O를 100mL 탈이온수로 채워진 3 개의 목 플라스크에 넣고 질소 가스 조건에서 시스템의 온도를 85 ℃로 가열했습니다. 1000 r-min 이하로 저어줍니다.-1 를 넣고 농축 암모니아수 10mL를 빠르게 붓습니다. 용액이 검게 변하면 구연산 나트륨 153mg을 추가합니다. 30분간 반응한 후 자석으로 생성물을 분리하고 탈이온수와 에탄올로 고상을 여러 번 씻어냅니다. Fe3O4 얻은 나노 입자는 나중에 사용하기 위해 건조됩니다.
(2) 그런 다음 그림 1과 같이 솔-젤 방법으로 자성 실리콘 기반 나노 입자(MS)를 제조했습니다. 실험 단계는 다음과 같습니다: 0.1 g Fe3O4 나노 입자를 무수 에탄올 40mL, 증류수 10mL, 농축 암모니아수 1.2mL를 포함하는 혼합 용액에 균일하게 분산시켰습니다. 300 r-min의 교반 조건에서-1를 함유한 용액 방울3O4 나노 입자를 무수 에탄올 30mL에 분산된 TEOS(0.4mL)에 첨가하고 실리콘 기반 나노 입자의 반응을 실온에서 12시간 동안 수행했습니다. 생성물을 무수 에탄올과 증류수로 여러 번 세척하여 자성 실리카 기반 나노 입자(MS)를 얻었으며, 나중에 사용하기 위해 건조시켰습니다.
MSC 마이크로스피어는 그림 2와 같이 에멀젼 가교법으로 준비했습니다. 실험 단계는 다음과 같습니다: 0.125g 자성 실리카 나노 입자(MS)를 질량 분율 2.5%의 키토산 용액 10mL에 균일하게 분산시킨 다음, 5.0%의 부피 분율로 아세트산 용액에 용해된 키토산으로 제조된 키토산 용액을 60mL 액체 파라핀 왁스와 1.8mL 트위인 80 방울을 포함하는 에멀젼에 첨가했습니다. 40 ℃ 수조 및 800 r-min의 조건에서 30 분 동안 교반 한 후-1에 2.0 mL 글루타르알데히드를 첨가하고 1시간 반응시킨 다음 시스템의 pH를 1 mol-L로 9.0으로 조정했습니다.-1 NaOH를 넣고 1시간 동안 반응을 계속했습니다. 생성물을 석유 에테르, 에탄올 및 증류수로 여러 번 세척하여 MSC 마이크로스피어를 얻었고, 나중에 사용하기 위해 진공에서 건조시켰습니다.
그림 2 자성 실리콘 기반 키토산 마이크로스피어 제조의 개략도
5. 에폭시 기반 자성 실리콘 기반 키토산 마이크로스피어(MSCE) 제조
4의 방법으로 제조한 건조 MSC 마이크로스피어 0.5g의 무게를 측정하고 50mL의 원뿔형 플라스크에 첨가했습니다. 그런 다음 NaOH 용액, 에피크롤로히드린 용액 및 NaBH4 용액을 각각 일정 농도로 플라스크에 첨가했습니다. 그리고 반응은 일정 시간 동안 일정한 온도 진동에 의해 수행되었습니다. MSCE 제조의 반응 메커니즘은 그림 3에 나와 있습니다.
그림 3 에폭시 기반 자성 실리콘 기반 키토산 마이크로스피어의 제조 원리
활성화 후, 활성화된 마이크로스피어를 증류수로 표면에 유리 OH- 및 에폭시기가 없어질 때까지 반복적으로 세척하여 에폭시 기반 자성 실리콘 기반 키토산 마이크로스피어(MSCE)를 얻습니다. 검출 방법은 다음과 같습니다: 세척 상청액 3.0mL를 취하고 페놀프탈레인 1~2방울을 첨가합니다. 흔든 후 빨간색으로 변하지 않으면 MSCE와 함께 유리 OH-가 없다는 의미이며, 세척 상청액 3.0mL를 취하고 1.3mol-L 3.0mL를 추가합니다.-1 티오황산나트륨과 1~2방울의 페놀프탈레인을 넣고 흔들어도 용액이 붉게 변하지 않으면 MSCE가 있는 유리 에폭시기가 없다는 뜻입니다. 에폭시기를 검출하는 반응식은 다음과 같습니다:
6 MSCE 고정화 나린기나제 효소의 제조
방법 5에 의해 제조된 5.0 g의 MSCE를 특정 pH의 나린기나제 효소 용액 50mL에 첨가하고 그림 4와 같이 일정한 온도의 수조에서 반응을 진동시켰습니다. 반응 후, 마이크로스피어 표면에서 유리 나린기나제가 발견되지 않을 때까지 완충 용액으로 마이크로스피어를 여러 번 세척했습니다. 마이크로스피어는 브리넬라 깔때기로 배수하여 MSCE 고정화 나린기나제 효소를 얻었고, 나중에 사용하기 위해 4℃에서 냉장 보관했습니다.
그림 4 MSCE 고정화 나린기나제 효소의 제조 원리
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