Che tipo di macromolecola è un enzima?

Come tutti sappiamo, gli organismi viventi sono composti da cellule. Gli enzimi sono i catalizzatori del metabolismo nel corpo umano e solo quando gli enzimi sono presenti le reazioni chimiche possono avvenire nel corpo umano, il metabolismo nel corpo può procedere e ogni cellula può mostrare tutti i tipi di attività di vita. Più enzimi ci sono nel corpo, più la vita è completa e più è sana. La maggior parte delle malattie umane è legata alla carenza di enzimi o a un disturbo della sintesi.

In effetti, gli enzimi si incontrano spesso nella nostra vita, come il detersivo per bucato arricchito di enzimi, la creatina chinasi e altri tipi di indicatori "enzimatici" nel sangue, e così via, che sono ovunque "enzimi". Oggi diamo uno sguardo agli enzimi e alle loro funzioni.

Che cos'è un enzima?

Gli enzimi sono proteine ad alta efficienza e con effetti catalitici specifici. Quasi tutte le reazioni metaboliche dell'organismo richiedono la partecipazione di enzimi e il controllo del metabolismo materiale avviene principalmente attraverso la regolazione dell'attività enzimatica. È ormai chiaro che molte malattie umane sono dovute alla mutazione, alla riduzione o all'assenza di alcuni enzimi, e quindi la carenza o la mutazione enzimatica può causare disturbi metabolici e portare alla malattia. Un catalizzatore accelera solo una reazione chimica verso un punto di equilibrio, ma non cambia il punto di equilibrio.

Lo stesso vale per gli enzimi, anche se sono estremamente efficienti rispetto ai catalizzatori non enzimatici; inoltre, gli enzimi catalizzano solo alcune reazioni chimiche di sostanze specifiche (dette effettori), producendo determinati prodotti senza sottoprodotti, cioè gli enzimi hanno un grado di specificità molto elevato. La capacità catalitica di un enzima è chiamata attività enzimatica, che può essere misurata e la quantità di enzima è spesso espressa in termini di attività. La misurazione dell'attività di alcuni enzimi spesso aiuta nella diagnosi delle malattie, quindi l'enzimologia è molto vicina all'eziologia, alla diagnosi e al trattamento delle malattie.

La natura degli enzimi

Durante le dinastie Shang e Zhou in Cina, sono state documentate le attività di produzione degli enzimi nei microrganismi, come la produzione di birra, di salsa e di sciroppo. Tuttavia, solo all'inizio del XX secolo si è giunti a una conclusione sulla natura degli enzimi; a metà del XIX secolo si credeva ancora che gli enzimi dovessero funzionare negli organismi viventi; il significato greco originale della parola "enzima" era "nel lievito" e solo quando, nel 1897, si scoprì che gli estratti di lievito privi di cellule potevano essere fermentati, ci si rese conto che gli enzimi potevano ancora funzionare al di fuori della cellula.

Nel 1926, J.B. Sumner, un biochimico americano, purificò l'ureasi e la cristallizzò, dimostrando che si trattava di una proteina, proponendo per primo il concetto che gli enzimi sono proteine. Tuttavia, le autorità accademiche dell'epoca più obiettare, non ritengono che l'enzima sia stato cristallizzato, anzi, pensano che la cristallizzazione della proteina non sia funzionante, mentre il ruolo degli inquinanti legati alla natura dell'ignoto. In seguito, anche altri scienziati hanno purificato e cristallizzato pepsina e tripsina e altre idrolasi proteiche, dimostrando che si tratta di proteine; l'essenza dell'enzima è una proteina e questa conclusione è riconosciuta dalla comunità scientifica.
Migliaia di enzimi sono stati scoperti, centinaia di enzimi sono stati purificati e cristallizzati, nonché analizzati e determinati nella struttura chimica del primo livello dell'enzima, si è dimostrato che sono proteine. Il concetto che gli enzimi sono proteine è talmente solido che sarebbe inappropriato chiamarli enzimi se venissero scoperte macromolecole con proprietà catalitiche diverse dalle proteine. Per questo motivo, diversi acidi ribonucleici di recente scoperta con attività catalitica sono stati definiti enzimi-simili.

Specificità dell'enzima

Una delle caratteristiche più evidenti di un enzima è la specificità (o specificità) della reazione che catalizza. Ciò si riferisce sia alla scelta degli effettori dell'enzima sia alla specificità della reazione che catalizza. Il grado di specificità varia da enzima a enzima.
Ad esempio, l'ureasi catalizza solo l'idrolisi dell'urea a CO2 e NH3; la succinato deidrogenasi ha come effettore solo l'acido succinico; la loro specificità è estremamente rigorosa, e può essere definita specificità assoluta, mentre altri enzimi hanno un gruppo comune o una selettività di legame chimico; come la fosfatasi, che può catalizzare l'idrolisi di molti tipi di composti contenenti acido fosforico per rimuovere l'acido fosforico, e le esterasi che catalizzano l'idrolisi del legame estere di molti composti diversi, la cui selezione è meno rigorosa. Questa può essere chiamata specificità relativa.

Si può notare che la specificità di diversi enzimi per l'azione di sostanze varia notevolmente, anche la stessa classe di enzimi, a causa di fonti diverse, il grado di specificità del grado stretto di incoerenza.

Importanza degli enzimi

Il corpo umano e gli altri organismi sono sottoposti a migliaia di reazioni chimiche diverse. Tutte le attività come la digestione, l'assorbimento, il trasporto, la sintesi, la secrezione, la locomozione e la riproduzione (comunemente chiamate metabolismo delle sostanze) si basano su reazioni chimiche. La maggior parte di queste reazioni sono lente, ma gli enzimi le accelerano in modo che le varie attività da cui dipende la vita possano essere svolte tempestivamente. La stragrande maggioranza di queste reazioni avviene nella cellula; ogni reazione è catalizzata da un enzima diverso; la cellula contiene migliaia di enzimi, segregati in vari organelli, che catalizzano metodicamente le reazioni fondamentali per la vita.

Prendiamo ad esempio l'amido che mangiamo ogni giorno: l'amido viene digerito nel tratto digestivo e idrolizzato in glucosio dall'amilasi e da altri enzimi catalitici, mentre il glucosio entra nella cellula, anch'esso catalizzato da enzimi, e i vari metabolismi del glucosio nella cellula sono ancora di più una serie di reazioni catalizzate da enzimi, che ossidano il glucosio in anidride carbonica e acqua e forniscono energia, e possono anche essere convertiti in altre sostanze come i grassi. Rispetto all'ossidazione del glucosio nell'organismo e alla sua combustione all'esterno, sebbene i prodotti siano anidride carbonica e acqua ed entrambi rilascino energia, l'ossidazione del glucosio nell'organismo è catalizzata da enzimi, avviene in condizioni blande, come la temperatura ambiente, passa attraverso una serie di fasi e rilascia gradualmente energia che può essere facilmente utilizzata, il che è estremamente diverso dalla combustione all'esterno dell'organismo.

I. Nell'industria della fermentazione alimentare

La produzione di salsa di soia prevede l'utilizzo di proteasi secrete dall'Aspergillus oryzae per scomporre le proteine presenti nelle materie prime e degradarle in peptidi, aminoacidi, ecc. in modo da produrre salsa di soia con colore, aroma e gusto. Ad esempio, la proteasi acida utilizzata nella produzione di salsa di soia può sopperire alla mancanza di enzimi nel ribes, promuovere la decomposizione delle proteine nelle materie prime della salsa di soia e dell'aceto, rafforzare il processo produttivo e facilitare la produzione su larga scala. Inoltre, l'idrolisi della proteasi può aumentare il contenuto di aminoacidi negli alcolici della salsa di soia, favorendo così il processo di fermentazione e la formazione di sostanze aromatiche e di sapore. Allo stesso tempo, aiuta anche a migliorare il tasso di utilizzo delle materie prime, a risparmiare cibo, a ridurre i costi e a contribuire al miglioramento della produzione e alla stabilità della qualità del prodotto.

II. Nella produzione di birra

Quando si riduce la quantità di malto e si aumentano i materiali ausiliari, spesso è necessario un supplemento di proteasi per degradare completamente le proteine e la proteasi acida microbica è anche un efficace chiarificatore della birra.

III. Nella produzione conciaria

Le proteine fibrose della pelle della materia prima conciaria sono una componente utile della pelle, ma ci sono anche molte proteine non fibrose che si trovano nella fessura delle fibre e nell'epidermide; il contenuto di queste proteine è piccolo e, se non viene rimosso, la pelle finita diventerà rigida e fragile. La proteasi è utilizzata nella lavorazione della pelle per la decomposizione delle proteine interstiziali; la produzione domestica di proteasi neutre e alcaline può essere utilizzata per il dehairing enzimatico.

Quattro. Utilizzato nella produzione di gelatina e fibra di collagene solubile:

L'industria con l'acqua di calce liscivia la pelle, le ossa e altre materie prime in olio e grasso e proteine varie, ecc, questo processo richiede tempo fino a diversi mesi, ad alta intensità di manodopera, basso tasso di gelatina e consumo di energia, con la purificazione della proteasi del collagene, la purezza della gelatina, la qualità, l'uniformità della massa molecolare relativa, la disposizione molecolare del tutto, il ciclo di produzione è breve, la resa della gelatina è elevata.

V. Utilizzato per il pretrattamento della tintura a bassa temperatura della lana:

Lana con tintura ad alta temperatura, farà la forza della lana danni, e facile da causare contrazione infeltrimento fibra e l'erezione del corpo dei capelli, con il trattamento proteasi di lana, tintura al punto di ebollizione, il tasso di colore di 2min quasi fino a 100%, il colore del prodotto finito e la lucentezza è luminoso, sentire grassoccio, e l'acqua di scarico nel contenuto di carburante è notevolmente ridotto.

Per la degommatura della seta:

I tessuti di seta grezzi devono essere degommati, la colla di seta è una proteina, il nostro Paese ha tradizionalmente utilizzato il metodo del sapone alcalino di raffinazione ad alta temperatura per la degommatura, con molte carenze, l'invasione alcalina del pigmento di seta, facile da influenzare la lucentezza, e con la degommatura della proteasi, il prodotto finito è lubrificato e morbido al tatto, lucido e brillante, e il tempo di degommatura è breve, la temperatura operativa è bassa, e la produttività è aumentata.

L'ingegneria genetica degli enzimi e la biocatalisi industriale dell'ingegneria delle proteine negli anni '90, l'ascesa dell'evoluzione diretta delle proteine, lo sviluppo della tecnologia genomica e proteomica. Il cuore della biocatalisi industriale è l'applicazione degli enzimi. Rispetto alla catalisi chimica tradizionale, la biocatalisi presenta i vantaggi della sito-specificità e della stereospecificità, che consentono di effettuare una "ri-evoluzione" secondo i desideri dell'uomo senza la necessità di comprendere la struttura dell'enzima, e può essere utilizzata per il clonaggio genico, la mutazione casuale o l'ibridazione, la mutazione mirata e la costruzione di librerie di mutazioni con metodi PCR a rischio di errore. Le librerie di mutazioni possono essere costruite mediante clonazione, mutazione casuale o ibridazione, mutazione mirata e PCR a errore, che possono essere combinate con strategie di screening ad alto rendimento per migliorare l'attività enzimatica, la stabilità, la stereoselettività e le proprietà di reazione non acquosa.

La xilanasi è un enzima chiave per la degradazione dell'emicellulosa e in Cina abbiamo utilizzato il gene dello Streptomyces olivaceus per trasferirlo nel lievito Pichia piscine Pichiapastoris e ottenere un'espressione efficiente. L'attività enzimatica è stata di 1.200 U/mL e l'attività specifica di 2.869 U/mg. Ha un'ottima resistenza alla degradazione delle proteasi [3]. I quattro geni del fungo acidofilo Biospora sp. MEY-1 sono stati clonati con successo in Saccharomyces cerevisiae per l'espressione eterologa; l'attività specifica dell'enzima ricombinante XYL11 del lievito è stata di 1.8831 U/mg e l'enzima ha mantenuto più di 87% della sua vitalità a 90 ℃ per 10 minuti. La degradazione dello xilano di avena produce principalmente xilosio e disaccaridi di xilano, che hanno una buona resistenza alla degradazione delle proteasi [8]. Il gene produttore di xilano del ribes nero IME-216 è stato clonato ed espresso in Saccharomyces cerevisiae e il vigore è stato aumentato a 90 000 U/mL [8], mentre il resto degli oltre 30 geni xilanasi sono stati espressi in Escherichia coli e altri lavori non verranno citati in dettaglio.

Gli enzimi per mangimi sono diventati il settore in più rapida crescita e più forte dell'industria mondiale degli enzimi industriali. La fitasi è un additivo per mangimi per la degradazione dell'acido fitico in fosfato inorganico e inositolo nei mangimi. L'Istituto di Ricerca sui Mangimi dell'Accademia Cinese delle Scienze Agricole ha ricombinato il gene della fitasi di Aspergillus niger963 in Saccharomyces cerevisiae per ottenere un'espressione altamente efficiente; l'attività enzimatica ha raggiunto 8×105IU/mL, più di 3.000 volte superiore a quella dell'Aspergillus niger originale e molto più alta di quella dei funghi ingegnerizzati riportati all'estero [4, 11]. 11] e in Cina sono state fondate diverse imprese di produzione.

La cellulasi è un sistema enzimatico complesso multienzimatico, la progettazione irrazionale è l'attuale metodo di evoluzione diretta della cellulasi, l'esonucleasi della cellulosa di Aspergillus xylosus e l'endonucleasi della cellulosa sono state inserite in fagi per dimostrarne la funzione. Attualmente sono stati clonati ed espressi diversi geni per la cellulasi medio-alcalina, che possono essere utilizzati nei tessuti e nei detergenti, e la coltivazione ottimizzata di batteri per l'ingegneria dell'endocellulasi neutra per l'industria della carta, con un'attività enzimatica fino a 32.529 U/mL [10], che è aumentata di 7,8 volte rispetto al ceppo originale. Il gene della cellulasi multifunzionale di Fusarium ampullaia crossean è stato espresso in E. coli e si è ottenuta una linea di cellulasi ad alta attività specifica, con una buona attività idrolitica nei confronti di xilano, glicosidi disaccaridi della fibra di p-nitrofenolo e carbossimetilcellulosa [5]. Il clonaggio del gene S38 Swollenin di Mycobacterium anthropophilum potrebbe interrompere i legami idrogeno, che sono una componente del sistema di degradazione della cellulasi fungina [6]. Inoltre, in Cina sono state condotte ricerche sul sistema enzimatico di degradazione della lignocellulosa della termite gigante dalle ali gialle.

La lipasi è una classe di enzimi importante nella biosintesi. Attualmente, la Cina ha stabilito una piattaforma tecnica per la modifica, la produzione e l'applicazione di tre geni lipasi maturati attraverso la progettazione razionale. L'attività enzimatica di Penicillium expansum FS8486 è stata aumentata da 317% utilizzando la tecnologia di riorganizzazione genica [7]. La struttura a "cappuccio" della lipasi per la mutazione mirata, per ottenere una lipasi a cappuccio aperto, l'attività specifica dell'enzima è aumentata di 5,7 volte, l'efficienza catalitica bifasica è aumentata di 1,8 volte [8].
La Cina ha anche costruito batteri di ingegneria a visualizzazione superficiale, batteri di ingegneria E. coli, batteri di ingegneria Picrosporum, piattaforma tecnologica di coltura ad alta densità, l'attività della lipasi di Pseudohyphae Candida sp. 99-125 ha raggiunto più di 15 000 U/mL [9]. La lipasi clonata di Rhizopus miehei è stata espressa con successo in due lieviti Pichia e la massima attività enzimatica ha raggiunto 18 000 U/mL. L'attività enzimatica non è diminuita a 4 ℃ per 6 mesi e la resa in biodiesel è stata superiore a 95% a 12 h [9]. Il gene della lipasi di Rhizopuschinensis è stato clonato con successo in Picrosylla e le due proteine chaperone co-espresse hanno potuto aumentare l'attività enzimatica di 30% e l'attività enzimatica ha raggiunto 16 200 U/mL [10-11]. Allo stesso tempo, è stato condotto lo studio di una lipasi legata alle cellule con buona tolleranza ai solventi organici e stabilità termica.

L'amilasi è un enzima industriale molto importante, che rappresenta il 25% del mercato degli enzimi. Attualmente, l'industria è principalmente un enzima ad alta temperatura, l'archaea anaerobico termofilo Thermococcus del genere Thermococcus ha prodotto un enzima extracellulare resistente al calore ad alta temperatura, la temperatura ottimale di 95 ℃, 100 ℃ ha ancora 60% della vitalità del gene dell'enzima è stato clonato mediante PCR ed è stato espresso in E. coli [7]. Anche due ceppi di batteri Geobacillus produttori di amido resistenti al calore sono stati isolati da Tengchong, Yunnan, e la vitalità specifica era di 1.320 e 890 U/mg dopo la purificazione [7]. Il gene di Bacillus alcalophilus è stato clonato mediante PCR, in cui Bacillus subtilis è stato espresso eterologicamente con un'attività di 450 U/mL [9]. L'α-amilasi acida mesofila, che consente di risparmiare e ridurre l'energia per la lavorazione dell'amido, il gene dell'α-amilasi di Bacillus sp. ha un'omologia di 98% con il gene dell'α-amilasi di B. amyliquefaciens [7].

La mannanasi appartiene alle emicellulasi ed è adatta alla preparazione degli oligosaccaridi di mannano. L'azienda di preparazione enzimatica di Zhaodong City, Richeng, ha prodotto un'attività di espressione della β-mannanasi acida di Aspergillus niger, pari a 20.000 U/mL, per un livello attuale di produzione di ceppi di 25 volte, nella posizione di leader dei batteri di ingegneria genetica fungina [10]. Il mutante di A. tabescens MAN 47 β-mannanasi con resistenza alle alte temperature e agli acidi è stato ottenuto mediante mutazione mirata del DNA e l'attività enzimatica ad alta temperatura di 80 ℃ e a pH 4,0 è stata 10 volte superiore a quella del tipo selvatico. L'introduzione mirata di siti di N-glicosilazione ha permesso di esprimere sia il wild-type che il mutante in A. tabescens e di migliorare la stabilità al calore, la stabilità agli acidi e la resistenza alle proteasi. Sono stati ottenuti anche tre mutanti con attività mannanasica da 3 a 5 volte superiore a quella del wild type [10-11]. Una β-1,4-mannanasi stabile al calore è stata clonata da Thermoanaerobacter thermophilus, con la massima attività a 80 ℃ in pozzi petroliferi ad alta temperatura e bassa permeabilità e contro la gomma idrossiguanica. L'emivita di questo enzima è di 46 ore [10].

La laccasi è una polifenolossidasi contenente rame, un enzima ligninolitico, in grado di catalizzare anche la sintesi di fenoli, ammine aromatiche e oligomeri. L'attività di espressione del gene della laccasi clonato da Tanya ruderalis in Saccharomyces cerevisiae è stata di 9,03 U/mL, 3 volte superiore a quella del ceppo originale [5]. La laccasi della graminacea selvatica Panus rudis è stata trasformata in lievito Picros per la secrezione e l'espressione; l'attività specifica dell'enzima è risultata pari a 16,17 U/mg, aumentata di 4,4 volte con la mutazione mirata e la mutazione casuale [7]. La nuova laccasi batterica marina è stata sottoposta a mutagenesi mirata degli aminoacidi; l'emivita del mutante è stata prolungata di 3 volte e la proteina solubile è aumentata di 244% rispetto a quella prima dell'ottimizzazione. La resa di fermentazione è stata 7,9 volte superiore a quella del wild type [10]. L'attività enzimatica della laccasi di un ceppo fungino tropicale della carie bianca ha raggiunto 11.400 U/L (metodo del guaiacolo) [7].

La pullulanasi, nota anche come polisaccaridasi taumatina, è un enzima debranching che scinde i legami α-1,6-glucosidici. Thermococcus sp. HJ21 produce Pullulanasi extracellulare ad alta temperatura con una temperatura ottimale di 95 ℃, e l'attività enzimatica è ancora superiore a 50% a 100 ℃ per 2 ore [7]. Il gene di questo enzima è stato clonato mediante PCR. L'Anoxy bacillus sp. p28 è stato clonato nella sequenza del gene della purulanasi ed è stato costruito il plasmide ricombinante. Trasformato in E. coli, il prodotto era un singolo maltotriosio, una pullulanasi di tipo I. Il gene della purulanasi di Bacillus sp. anaerobico resistente al calore isolato dalla sorgente calda di Tengchong è stato introdotto in Bacillus subtilis ed espresso. A 60 ℃ e 48 ore si è conservata una vitalità superiore a 50% e l'attività enzimatica extracellulare è risultata pari a 42 U/mL, con un aumento di 40 volte della vitalità dell'espressione [10]. Attraverso la tecnologia del knockout genico e della ricombinazione, la Nanjing Bestjie Bioengineering Company ha modificato il gene del Bacillus Pullulanase selvatico e ha creato un enzima composito con la glucoamilasi, in grado di preparare glucosio con un valore DE superiore a 96,5; il nome commerciale è High DEX series, che può soddisfare la produzione di glucosio e raggiunge il livello internazionale [10].

La penicillina acilasi è l'enzima chiave dell'industria degli antibiotici β-lattamici. La Cina è entrata con successo nell'industria degli antibiotici di sintesi enzimatica, la penicillina acilasi è stata mutagenizzata per ottenere un ceppo mutante con una vitalità di 820 U/mL [2]. Il clonaggio del gene della penicillina acilasi di Bacillus megaterium è stato espresso in Bacillus subtilis con una vitalità di 30 U/mL [4]. La penicillina acilasi è stata secreta ed espressa in Bacillus subtilis con una concentrazione di 864 U/L, 144 volte superiore alla resa del produttore wild-type Bacillus-like A. faecalis [5]. La penicillina acilasi di B. faecalis è stata secreta ed espressa in E. coli e l'attività enzimatica della coltura migliorata del batterio ingegnerizzato era >2.000 U/L. L'acilasi dell'acido 7-amino cefalosporanico (GL-7-ACA acilasi) è stata in grado di trasformare la cefalosporina C ed è stata espressa in E. coli, con un'attività enzimatica massima di 266 U/L [5], mentre l'acilasi della penicillina di Bacillus megaterium immobilizzata nel vettore Eupergitc ha prodotto 30 lotti di trasformazioni successive. L'enzima è stato immobilizzato con il vettore Eupergitc e prodotto in 30 lotti consecutivi senza alcuna diminuzione dell'attività [6].

La D-amminoacidasi può catalizzare la produzione di D-amminoacidi per produrre i corrispondenti chetoacidi e ammoniaca; questo enzima e l'acido 7-amminocefalosporanico acilasi (7-ACA acilasi) producono in due fasi le cefalosporine, importante materia prima dell'acido 7-amminocefalosporanico (7-ACA). Un Picrosporum spp. ricombinante altamente espresso è stato costruito utilizzando la D-amminoacidasi espressa dal lievito metanolico e la vitalità della fermentazione ha raggiunto 8 000-1 2000 U/L in vasche da 14 L [5]. È stata costruita una D-amminoacidasi espressa da lievito Picot con una vitalità di 1 700 U/L [5] e sono stati costruiti anche due tipi di GL-7-ACA acilasi ricombinanti, con ceppi costitutivi fino a 1 500 U/L e ceppi inducibili fino a 900 U/L; il tasso di conversione degli enzimi immobilizzati ha raggiunto 97% [5]. Il gene della D-amminoacido ossidasi di Saccharomyces cerevisiae è stato trasferito in E. coli con un vigore di espressione di 23,3 U/mL [5] .
La D-amminoacidasi è stata immobilizzata e trasformata su resina epossidica Amberzyme per 14 lotti senza alcuna diminuzione della vitalità [6]. La P-idrossifenilglicina è un importante intermedio nella semisintesi degli antibiotici β-lattamici, che può essere preparato mediante una preparazione catalitica a due fasi di Amberzyme e D-carbamoil idrolasi; la solubilità è stata aumentata di 6 volte in E. coli mediante mutazione casuale della D-carbamoil idrolasi. coli mediante mutazione casuale della D-carbamoil idrolasi[6], e l'espressione ricombinante di E. coli con scarsa solubilità della D-arbamoil idrolasi e la co-espressione di chaperoni molecolari ha aumentato la solubilità dell'espressione di circa 3 volte[7].

La riduzione asimmetrica dei composti carbonilici da parte della carbonil reduttasi è ampiamente utilizzata per la preparazione di alcoli chirali. L'etile (S)-4-cloro-3-idrossibutirrato è stato preparato dalla carbonil reduttasi di Streptomyces azureus. Il suo batterio ricombinante, E. coli BL21, ha preparato etile (S)-4-cloro-3-4-fenilbutirrato e metile (S)-o-cloromandelato con valori di conversione e di ee superiori a 99% I valori di ee enantiomerici e le rese dei prodotti dell'espressione omologa del gene della carbonil reduttasi del lievito di birra sono stati aumentati. Una nuova carbonil reduttasi di tipo (S)- è stata clonata dal genoma di pseudofagi quasi lisci e il batterio ricombinante E. coliBL 21 è stato in grado di preparare (S)-fenilglicole con una purezza ottica di 99,1% e una resa di 89,6% [8,11].

La β-glucosidasi è un componente importante del sistema cellulasico, in grado di idrolizzare il cellobiosio e il cellobiosio solubile in glucosio e ligandi corrispondenti, idrolizzare i legami β-glicosidici e sintetizzare nuovi derivati dello zucchero. La β-glucosidasi di Aspergillus suisse, attraverso il knockout del gene e la mutazione degli aminoacidi, ha permesso di ottenere un'attività enzimatica 143 volte superiore a quella del wild type [9]. Il gene della β-glucosidasi di Sphingobacterium neoformans è stato espresso con successo in E. coli, in grado di convertire i glicosidi isoflavonici per produrre i glicosidi corrispondenti [10]. L'espressione eterologa della β-glucosidasi nel tratto intestinale della termite del latte di Taiwan E. coli, utilizzando un sistema di espressione procariotica, ha portato a un aumento di 2,6 volte dell'attività dell'enzima mutante rispetto all'enzima wild-type. Inoltre, ha migliorato la tolleranza al glucosio e la stabilità termica [10]. La β-glucosidasi di Penicillium obliquum è stata geneticamente modificata e tre ceppi di espressione sono stati ottenuti mediante trasformazione, e l'attività dell'enzima è stata aumentata di 3,4-3,7 volte rispetto a quella del ceppo originale [10]; il gene della β-glucosidasi resistente al calore è stato isolato da un batterio prionico non decompetente e clonato in E. coli, e l'attività dell'enzima è stata aumentata di 17 volte [4]. Una β-glucosidasi tollerante al glucosio è stata selezionata da un macrogenoma marino e clonata in E. coli per un'espressione efficiente; concentrazioni di glucosio inferiori a 400 mmol/L hanno favorito l'enzima e, fino a una concentrazione di glucosio di 1.000 mmol/L, l'attività enzimatica è stata 50% [8,11]. La riorganizzazione del DNA e la mutagenesi mirata sono state utilizzate per migliorare la stabilità della β-glucosidasi e l'emivita di inattivazione termica a 61 ℃ dei quattro mutanti è stata aumentata di 14,16-, 68- e 44 volte rispetto a quella del wild type. La resistenza al calore è stata significativamente migliorata [8].

La galattosidasi, nota anche come lattasi, scinde il lattosio in glucosio e gruppi galattosilici e può sintetizzare oligosaccaridi. La β-galattosidasi, un efficiente enzima transglicosilante, è stata ottenuta dal fango del fondale marino con metodo macrogenomico, è stata solubilizzata ed espressa in E. coli, tollera i solventi organici e sintetizza oligo-galattosio in rese fino a 51,6% [9]. L'α-galattosidasi di Aspergillus è solidamente fermentata con un'attività enzimatica di 305 UI/g [6]. La β-galattosidasi di Sulfolobus solfataricus P2 è stata modificata molecolarmente per costruire un mutante; l'enzima mutante, F441Y, ha prodotto oligogalattosio con una resa di 61%, superiore di circa 10% rispetto al wild type [9].

La nitrile idratasi trova importanti applicazioni nella sintesi di ammidi, acidi carbossilici e loro derivati, catalizzando la produzione di acrilammide dall'acrilonitrile, con una vitalità fermentativa fino a 6.000 unità internazionali in Nocardia sp. YS-2002, espressa in E. coli e Picrosporum [5].

L'inulinasi è un enzima idrolitico che idrolizza il legame β-2,1-D-fruttosio-fruttoside dell'inulina per produrre oligofruttosio, e si divide in due tipi: endonucleasi ed esonucleasi. Il gene dell'endonucleasi dell'inulina di Aspergillus niger è stato clonato nel lievito Bichiria per ottenere un'espressione efficiente e l'attività dell'enzima ricombinante ha raggiunto 128 U/mL, raggiungendo il livello internazionale [9].

L'alginato sintasi, ampiamente utilizzato nel campo dell'alimentazione, della medicina e dell'industria leggera, può essere utilizzato per produrre alginato dal maltosio con il metodo dell'enzima singolo, attraverso la progettazione razionale di molecole enzimatiche e la tecnologia del DNAshuffling da due ceppi GRAS e due batteri termofili clonati per i geni dell'alginato sintasi e realizzati con successo l'espressione di alta efficienza, ed è stato realizzato nella produzione industriale [5].

Il plasmide ricombinante del gene Npr di Bacillus subtilis AS1398 è stato trasferito in B. subtilisAS 1398 per ottenere un batterio ricombinante multicopia; la stabilità del plasmide del batterio ricombinante è stata mantenuta a 100% per 30 generazioni consecutive e il livello di espressione della proteasi è stato aumentato di oltre 1 volta fino a raggiungere 24 000-28 000 U/mL [10]. Il ceppo di B. subtilis con un'efficiente virulenza nematocida è stato ottimizzato per la coltura per ottenere un'attività proteasica fino a 12.379 U/mL, 5 volte superiore a quella precedente all'ottimizzazione, e il sistema di espressione di B. subtilis WB600 è stato applicato per costruire una libreria di mutazioni casuali per ottenere un mutante stabile al calore, che è stato utilizzato come base per il biocida [8]. La metalloproteinasi di matrice umana è strettamente correlata alle metastasi tumorali e l'enzima è stato clonato ed espresso con successo in E. coli, ponendo così le basi per lo studio del meccanismo dell'enzima e delle metastasi tumorali e per la ricerca di inibitori specifici dell'enzima [5].

La glucanasi è un'idrolasi, suddivisa in endonucleasi ed esonucleasi, utilizzata nella produzione di birra e nell'aggiunta di mangimi. Il gene della β-1,3-1,4-glucanasi di Penicillium thermophilum è stato clonato in un vettore di espressione procariotica e trasfettato in E. coli BL 21 con un'attività enzimatica di 240 U/mL [8], mentre il gene dell'endonucleasi β-1,3-glucanasi di Streptomyces sp. S27 è stato espresso in modo efficiente in E. coli, in grado di idrolizzare i polisaccaridi della kombucha, ecc. e di inibire i funghi patogeni e produttori di tossine [8]. Il gene dell'endoglucanasi di Aspergillus longum è stato introdotto nel Picrosporum per essere espresso e l'attività enzimatica del batterio ricombinante III ha raggiunto 110 U/mL, ottimizzata per aumentare da 50% [8]. Mutazione puntiforme estremamente resistente al calore Thermotogamaritima endoglucanasi Cell-12B, la temperatura ottimale dell'enzima di 95 ℃, 90 ℃ ancora conservato 70% vivo.
L'acido N-acetilneuraminico è uno degli acidi salivari più importanti negli organismi viventi e la catena di zuccheri dell'acido salivare è coinvolta in molti processi vitali; l'acido CMP-salivario promuove la rigenerazione delle cellule neuronali e la modifica della base del gene della CMP-salivario sintetasi ha portato a un'espressione altamente efficiente in E. coli, con l'espressione dell'enzima pari a 26,5% della proteina totale e un'attività enzimatica di 100 U/L, che era 850 volte quella del ceppo di partenza [4]. L'enzima di detossificazione dell'aflatossina è un'ossigenasi; il gene è stato costruito con la tecnologia ricombinante per essere espresso nella fermentazione ad alta densità in Saccharomyces cerevisiae; l'enzima ha rappresentato 56% della proteina totale e la quantità di espressione ha raggiunto 814,5 mg/L [6]. Il plasmide ricombinante del gene di mutazione dell'enzima è stato introdotto in E. coli per essere amplificato e trasferito in Saccharomyces cerevisiae; è stata creata una libreria di mutazioni e l'attività enzimatica del mutante A1773 è stata aumentata di 5 volte. Il mutante A1242 ha mostrato un aumento di 3,5 volte della resistenza alle alte temperature. Il mutante DS1474, con un'attività enzimatica specifica di 56 U/mg, e il mutante DS896, con un'attività enzimatica specifica di 44 U/mg [9], sono stati approvati come prodotti enzimatici per la detossificazione nei mangimi.

L'infezione fungina da Aspergillus fumigatus è un problema difficile per la salute umana, lo studio sistematico del genoma di Aspergillus fumigatus più di 50 geni relativi alla via della glicosilazione, è stato clonato da Aspergillus fumigatus, chitinasi, fosfomannano isomerasi, O-mannosiltransferasi, α-1,4-N-acetilglucosaminiltransferasi, α-glucosidasi I e CMP-salivaryl sintetasi, il meccanismo della glicosilazione fungina per comprendere, sviluppare farmaci geneticamente modificati e infezioni antimicotiche [6].

La L-asparaginasi ha un chiaro effetto terapeutico sulla leucemia; attraverso la tecnologia di ricombinazione del DNA, il frammento di anticorpo a catena singola specifico della L-asparaginasi e l'enzima per costruire una proteina di fusione per migliorare la stabilità dell'enzima in vivo, l'attività dell'enzima ricombinante di E. coli AS 1357 è aumentata fino a 228 U/mL, che è paragonabile al batterio selvatico più di 50 volte. Il gene dell'esterasi è stato trasferito in E. coli con il metodo della macrogenomica e il batterio ingegnerizzato costruito ha migliorato il vigore, con una quantità di espressione di 200 mg/L, un vigore enzimatico fino a 180 U/mg e una stabilità termica a 60 ℃ migliorata di 144 volte e 196 volte rispetto a quella del tipo selvatico; è stato così ottenuto un mutante esterasi mutante di un nuovo pesticida poliestere in grado di degradare clorpirifos, deltametrina, deltametrina e flucitrine [9].
La pectinasi alcalina è stata prodotta dalla fermentazione del lievito Picher ricombinante e la produzione enzimatica più elevata è stata di 1.315 U/mL da un fermentatore di 1 t [8]. L'attività della pectinasi della coltura di Aspergillus niger EIM-6 è stata ottimizzata a 30 231 U/mL [8,11]. Il gene della salicilato idrossilasi di Pseudomonas clonato in E. coli ha espresso due enzimi degradanti il naftalene che degradano l'acido salicilico, l'acido acetilsalicilico, l'acido solfosalicilico, la salicilaldeide, la m-nitrobenzaldeide, l'acido 5-clorosalicilico, l'ottanale e la o-nitrobenzaldeide [5].
Gli esteri degli organofosfati sono una classe di composti altamente tossici utilizzati come insetticidi, erbicidi o agenti nervini. L'idrolasi dell'estere dell'organofosfato di Pseudomonas aeruginosa è stata clonata ed espressa ricombinatamente in E. coli mediante mutazione del sito aminoacidico, che ha aumentato la capacità di idrolisi degli esteri dell'organofosfato di circa 7.000 volte [10].

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Composto Glucoamilasi	9032-08-0
Pullulanase	9075-68-7
Xilanasi	37278-89-0
Cellulasi	9012-54-8
Naringinasi	9068-31-9
β-amilasi	9000-91-3
Glucosio ossidasi	9001-37-0
alfa-amilasi	9000-90-2
Pectinasi	9032-75-1
Perossidasi	9003-99-0
Lipasi	9001-62-1
Catalasi	9001-05-2
TANNASIO	9025-71-2
Elastasi	39445-21-1
Ureasi	9002-13-5
DEXTRANASE	9025-70-1
L-lattico deidrogenasi	9001-60-9
Deidrogenasi malato	9001-64-3
Colesterolo ossidasi	9028-76-6