Qual è il processo di produzione dei bio-enzimi?

1.Produzione di enzimi

Gli enzimi sono prodotti da microrganismi, animali e piante, ma la fonte principale sono i microrganismi. Poiché i microrganismi presentano maggiori vantaggi rispetto alle piante e agli animali, in genere vengono selezionati ceppi eccellenti per la produzione di enzimi attraverso la fermentazione. Per aumentare la concentrazione di enzimi nel brodo di fermentazione, vengono selezionati ceppi eccellenti, sviluppati batteri geneticamente modificati e ottimizzate le condizioni di fermentazione. La produzione industriale richiede prestazioni speciali dei nuovi enzimi, come l'α-amilasi resistente alle alte temperature, la proteasi e la lipasi resistenti agli alcali, ecc. Pertanto, è necessario ricercare e sviluppare ceppi che producano prestazioni speciali di nuovi enzimi.

2. Preparazione dell'enzima

La tecnologia di separazione e purificazione degli enzimi è il cuore dell'attuale "processo di post-trattamento" delle biotecnologie. Utilizzando una varietà di tecniche di separazione e purificazione, da cellule microbiche e il loro brodo di fermentazione, o cellule animali e vegetali e il loro brodo di coltura nella separazione e purificazione degli enzimi, fatto di preparati enzimatici altamente attivi di diversa purezza, al fine di rendere i preparati enzimatici più ampiamente utilizzati in tutti gli aspetti dell'economia nazionale, deve migliorare l'attività dei preparati enzimatici, la purezza e la resa, la necessità di studiare le nuove tecniche di separazione e purificazione.

3.Immobilizzazione di enzimi e cellule

La ricerca sull'immobilizzazione di enzimi e cellule è il compito centrale dell'ingegneria enzimatica. Al fine di migliorare la stabilità degli enzimi, riutilizzare le preparazioni enzimatiche, ampliare la gamma di applicazioni delle preparazioni enzimatiche, utilizzando una varietà di metodi di immobilizzazione per l'immobilizzazione degli enzimi, la preparazione di enzimi immobilizzati, come l'isomerasi del glucosio immobilizzata, la carbamoilasi immobilizzata, ecc, la determinazione degli enzimi immobilizzati e gli enzimi immobilizzati per l'applicazione di vari aspetti dello sviluppo della ricerca. L'enzima immobilizzato ha ancora una forte vitalità. È molto apprezzato da vari campi come la biochimica, l'ingegneria chimica, la microbiologia, i polimeri e la medicina.

Le cellule immobilizzate sono sviluppate sulla base di enzimi immobilizzati. Diversi metodi di immobilizzazione sono utilizzati per immobilizzare cellule microbiche, animali e vegetali per ottenere una varietà di cellule biologiche immobilizzate. Lo studio delle proprietà enzimatiche delle cellule immobilizzate, in particolare delle proprietà cinetiche, e la ricerca e lo sviluppo di cellule immobilizzate in varie applicazioni sono oggi un tema caldo dell'ingegneria enzimatica.

La tecnologia di immobilizzazione è un'importante pietra miliare nella modernizzazione della tecnologia degli enzimi ed è una tecnologia innovativa per superare le carenze degli enzimi naturali nelle applicazioni industriali e per sfruttare appieno le caratteristiche della reazione enzimatica. Si può dire che non esiste una moderna tecnologia degli enzimi senza lo sviluppo della tecnologia di immobilizzazione.

4. Modifica molecolare dell'enzima

Conosciuta anche come modifica molecolare dell'enzima. Per migliorare la stabilità dell'enzima, ridurre l'antigenicità, prolungare l'emivita dei batteri medicinali nell'organismo, si utilizzano vari metodi di modifica per modificare la struttura della molecola dell'enzima, al fine di creare un enzima naturale che non abbia alcune caratteristiche eccellenti (come una maggiore stabilità, l'assenza di antigenicità, la resistenza all'idrolisi delle proteasi, ecc.), e persino creare una nuova attività enzimatica, per espandere l'applicazione dell'enzima, in modo da aumentare il valore dell'applicazione dell'enzima e ottenere maggiori benefici economici e sociali. e sociali.

La modifica molecolare degli enzimi può essere effettuata sotto due aspetti:

(1) Utilizzare la tecnologia dell'ingegneria proteica per modificare il gene della struttura della molecola dell'enzima, prevedendo di ottenere un nuovo enzima (enzima mutante) con caratteristiche eccellenti ed elevata attività, dotato di una struttura primaria e di una struttura spaziale ragionevoli.

(2) Modifica chimica o enzimatica della struttura primaria delle proteine enzimatiche, o modifica chimica della molecola enzimatica con modifica chimica del gruppo della catena laterale. Al fine di modificare le proprietà enzimatiche. Questi enzimi sono particolarmente utili nella ricerca di base in enzimologia e in medicina.

I microrganismi utilizzati nella produzione di enzimi sono funghi filamentosi, lieviti e batteri in tre gruppi principali, principalmente batteri aerobi. Di seguito sono elencati i ceppi e gli usi dei principali enzimi industriali:

Amilasi

Le amilasi idrolizzano l'amido per produrre oligosaccaridi di malto e maltosio. La produzione è dominata dalla fermentazione profonda con Bacillus subtilis e Bacillus licheniformis del genere Bacillus, quest'ultimo produce enzimi resistenti al calore. Le fermentazioni profonde e semisolide con ceppi di Aspergillus e Rhizopus sono utilizzate anche per la lavorazione degli alimenti [6] . Le amilasi sono utilizzate principalmente nella produzione di zucchero, nella sbozzimatura dei tessuti, nel trattamento delle materie prime di fermentazione e nella lavorazione degli alimenti. La glucoamilasi è in grado di idrolizzare l'amido in glucosio, oggi quasi interamente prodotto dalla fermentazione profonda di Aspergillus niger, ed è utilizzata nella produzione di zucchero, di alcol e nel trattamento delle materie prime di fermentazione.

Proteasi

L'uso di ceppi e la produzione di più varietà. Con il bacillo lichenico, il bacillo piccolo e corto e il bacillo subtilis per la produzione in fermentazione profonda di proteasi batterica; con lo streptomyces, l'Aspergillus per la produzione in fermentazione profonda di proteasi neutra e l'Aspergillus per la produzione di proteasi acida, utilizzate per la depilazione delle pelli, l'ammorbidimento delle pellicce, i prodotti farmaceutici e l'industria alimentare; con il Trichoderma spp. alcuni dei batteri per la produzione in fermentazione semisolida di caglio per la fabbricazione del formaggio al posto del caglio estratto dallo stomaco del vitello originario.

Glucosio isomerasi

Una specie sviluppatasi rapidamente negli anni '70. Le cellule di Streptomyces vengono prima ottenute per fermentazione profonda e, dopo l'immobilizzazione, la soluzione di glucosio viene convertita in uno sciroppo contenente circa 50% di fruttosio, che può essere utilizzato nell'industria alimentare al posto del saccarosio. Con l'amilasi, la glucoamilasi e l'isomerasi del glucosio, ecc. l'amido di mais viene trasformato in sciroppo.

Selezione dei sistemi di espressione
1 Sistema di espressione di E. coli
È preferibile un sistema di espressione ①pET
② L'espressione e la purificazione delle proteine ricombinanti possono essere eseguite utilizzando tag solubilizzati; la MBP è preferita come prima scelta.
③ Preferibile pET24 o pET28 (se è necessaria la purificazione) con BL21(DE3), terreno TB 37° crescita fino a 1-1,5 OD, 18 ℃ crescita per 1 ora fino a 3 OD , 0,5 mM IPTG induzione per 19 ore fino a 10 OD.
④ Misure di salvataggio per l'alta espressione e la bassa solubilità: raffreddamento fino a 15 ℃; cambio del terreno di coltura con 2xYT o ZYP5052 (autoindotto), cambio dell'ospite di espressione; troncamento dei residui N-terminali e/o C-terminali di 2-10 aminoacidi; espressione mediante fusione con proteine altamente solubili, come MBP; induzione chimica di chaperoni molecolari, coesprimendo chaperoni molecolari/proteine interagenti o fornendo ligandi.
⑤ Vantaggi e svantaggi del sistema di espressione di E. coli
Vantaggi: più conveniente, più efficace
Svantaggi: debole capacità di espressione della secrezione; difficoltà nella formazione di legami disolfuro; nessuna modificazione post-traduzionale.

2 Sistema di espressione del lievito (Picrosporum)
Vantaggi: integrazione stabile di geni esogeni; il promotore del gene dell'alcol ossidasi è forte e l'espressione può essere strettamente regolata dal metanolo; le proteine ricombinanti possono essere espresse in forma intracellulare o extracellulare; contiene funzioni di modificazione post-traduzionale comuni ai sistemi di espressione eucariotici; esistono host/vettori commerciali, facili da usare; facile da amplificare e la densità di fermentazione è estremamente elevata.
Svantaggi: forma unica di elaborazione post-traslazionale; problema dell'eccessiva glicosilazione.

3 La prima scelta è il sistema di espressione riportato in letteratura, la seconda scelta è il sistema E. coli e il sistema lievito viene utilizzato se l'espressione in E. coli è inattiva. In base alla fonte del gene per determinare il sistema di espressione, il gene è dotato di tag di affinità per facilitare la purificazione.

Modifiche enzimatiche
①Progettazione razionale: basata sulle informazioni relative alla struttura e alla funzione della proteina sul cambiamento del gene codificante e sul test di espressione della ricombinazione.
Procedura: in primo luogo, si ottiene la struttura dell'enzima dalla banca dati BRENDA, poi si modifica la struttura dell'enzima e si prevede la struttura dell'enzima con Alphafold2, quindi si esegue l'analisi di docking tra l'enzima e la molecola di ligando con il software PyMOL e infine, in base alla nuova struttura dell'enzima, si mutano le sequenze geniche in senso direzionale e poi si esprime ricombinatamente per ottenere un nuovo enzima (per migliorare la stabilità termica, l'efficienza catalitica e la specificità del substrato dell'enzima).
② Progettazione irrazionale: mutazione o ricombinazione ad alta frequenza di sequenze codificanti, espressione ricombinante e test high-throughput

Processo di progettazione ab initio: 1. sviluppo del campo di forza e dell'algoritmo di campionamento 2. test ad alto rendimento 3. identificazione della struttura

Evoluzione diretta delle proteine
①Selezionare i geni originali
②Esistenza di una libreria di mutazioni geniche della diversità
③ Collegare più geni mutati in vettori ed esprimerli rispettivamente nei ceppi corrispondenti
④ Selezionare un gene mutante di alta qualità mediante screening, quindi esprimere il gene mutante in grandi quantità.

Metodi di generazione di librerie di geni mutanti
① Mutazione casuale in vivo ad alta frequenza: utilizzo di E. coli XL1-Red come ospite per la replicazione genica (sistema di riparazione del danno al DNA difettoso)
Coltivato fino allo stadio di plateau, si verifica in media una mutazione di una base in 2Kb.
Kit di mutagenesi casuale: tasso di mutazione 0,1 -1,6% /PCR, equivalente a 1-16 mutazioni di base/gene.
③ Mutagenesi di saturazione punto per punto

Evoluzione naturale: Mutazione spontanea, ricombinazione, selezione naturale
Evoluzione agricola: mutazione spontanea, allevamento, screening
Evoluzione in laboratorio: tasso di mutazione accelerato, riproduzione molecolare, screening

Rimescolamento del DNA
Strategia sperimentale di ingegneria proteica
①Selezionare il gene di partenza per stabilire un sistema di inattivazione e/o un metodo di screening.
Se la relazione struttura-funzione è nota, adottare prima il metodo di progettazione razionale.
③Fine-tuning delle mutazioni casuali e screening high-throughput
④ Progettare da zero solo se non esiste un gene di partenza adatto.

Tecniche di ricerca sulle proteine
1 Proprietà fisiche e chimiche relative alla separazione e alla purificazione delle proteine
Dimensione molecolare (dialisi, ultrafiltrazione, filtrazione su gel, centrifugazione)
②Forma molecolare (centrifugazione a gradiente, elettroforesi)
(iii) Proprietà cariche (elettroforesi, cromatografia a scambio ionico)
(iv) Proprietà di solubilizzazione (salinizzazione, precipitazione in solvente organico)
⑤ Differenze nel legame specifico ai ligandi (cromatografia di immunoaffinità, cromatografia di bioaffinità, cromatografia di affinità con chelati metallici)
(vi) Proprietà di adsorbimento (cromatografia idrofobica)
(vii) denaturazione e denaturazione (denaturazione e denaturazione dell'urea)

2 Sistema di espressione delle proteine
① Sistema di espressione batterica: ciclo breve, alta efficienza, basso costo, ma nessuna modifica post-traduzionale. Utilizzato principalmente per la produzione di proteine procariotiche e semplici proteine eucariotiche.
Selezione del vettore di espressione: serie pet, serie pGEX, PQE30......
Selezione dei ceppi di espressione: BL21(DE3), Rosetta, M15......
Condizioni di induzione: Concentrazione di IPTG, temperatura e durata del tempo
Purificazione: Ni-NTA (tag His), Strep-beads, GST.....

② Sistema di espressione del lievito: ciclo breve, alta efficienza, basso costo, esiste una modificazione post-traduzionale. Ci sarà una glicosilazione inappropriata, un'elevata modificazione del mannosio. Utilizzato principalmente per produrre proteine intracellulari/secretorie, proteine che legano i disolfuri, proteine glicosilate.

(iii) Sistema di espressione batteriofago: elevata capacità genica, proteina solubile, adatta alla produzione di proteine tossiche, modifiche post-traduzionali simili a quelle dei mammiferi. Le condizioni di coltivazione sono difficili e mancano alcune modifiche glicosilative. Si utilizza principalmente per la produzione di proteine di membrana, proteine di grandi dimensioni, vaccini virali, proteine di segnalazione, citochine, chinasi.
Il genoma del baculovirus ha un'enorme capacità di inserimento di geni esogeni, fino a 38 kb.
I baculovirus sono prodotti in cellule di insetto e non si replicano in cellule di mammifero.
Vantaggi: i baculovirus possono essere trasdotti in modo efficiente in linee cellulari di mammifero, comprese le cellule primarie e staminali.
Sicurezza (non si replica in cellule di mammifero) e assenza di effetti citopatici osservabili
Le cellule pre-trasdotte conservate e congelate possono essere utilizzate anche come cellule di preparazione al test.
Portabilità (per l'analisi di tipi di cellule farmacologicamente rilevanti)
Velocità di sviluppo del test (non è necessario dedicare tempo alla generazione di linee cellulari stabili)

④ Sistemi di espressione mammiferi: lunghi tempi di ciclo, bassa efficienza, presenza di modifiche post-traduzionali, elevata bioattività delle proteine. Utilizzati principalmente per produrre proteine eucariotiche complesse, proteine che richiedono PTM precise.
Espressione transitoria di proteine: Reagenti per la trasfezione di PEI o liposomi
Sviluppo di linee cellulari stabili: Piattaforme per l'ingegneria cellulare Flp-In™ Jump-In™
Espressione inducibile: Espressione regolata dalla tetraciclina
Espressione mediata da virus: sistema di espressione lentivirale per l'analisi funzionale; sistema di espressione adenovirale per la produzione di proteine.

3 Purificazione delle proteine
Perché dobbiamo purificare le proteine?
Caratterizzare la struttura e la funzione delle proteine di interesse.
(ii) Studiare la regolazione delle proteine e le interazioni tra proteine.
③ generare anticorpi
Metodi di purificazione
In base alle proprietà fisico-chimiche
Dimensione delle proteine: dialisi, ultrafiltrazione, cromatografia di filtrazione su gel
Carica delle proteine: cromatografia a scambio ionico
Idrofobicità delle proteine: cromatografia a interazione idrofobica

In base alle proprietà biologiche: cromatografia di affinità

①Dialisi
Fattori d'influenza: MWCO del tubo di dialisi; volume del tampone; tempo di dialisi; frequenza di sostituzione del tampone di dialisi.

Ultrafiltrazione
Filtrazione centrifuga, le dimensioni delle proteine sono inferiori alla dimensione dei pori della provetta del filtro e vengono centrifugate sul fondo della provetta.

③ Cromatografia di filtrazione su gel
Separare proteine di dimensioni diverse

④Cromatografia a scambio ionico
Colonna a scambio cationico: il gel è caricato negativamente, la proteina è caricata positivamente
Colonna a scambio anionico: il gel è caricato positivamente, la proteina è caricata negativamente
Medio
Supporto inerte: agarosio, destrano
Gruppi carichi: carbossimetile: carico negativamente, dietilammino: carico positivamente
Equilibrio degli ioni: gruppi carichi negativamente: H+ o Na+ gruppi carichi positivamente: OH- o Cl-
Eluizione graduale o a gradiente delle proteine aumentando la concentrazione salina o cambiando il pH.

⑤ Cromatografia di affinità
La cromatografia di affinità è un metodo di separazione di biomolecole da una miscela basato su interazioni di legame macromolecolare altamente specifiche tra una biomolecola e un'altra sostanza.
Alcuni esempi sono: il legame dell'antigene con gli anticorpi, il legame dell'enzima con i ligandi, il legame del glutatione e delle proteine di fusione GST, il legame delle proteine anti-biotina con le molecole che legano la biotina e il legame degli ioni metallici con le proteine di fusione poli-istidina.

Cromatografia con chelati metallici immobilizzati (IMAC) che utilizza ioni metallici (Ni 2+; Co 2+; Cu 2+) legati a poli-(His) ₆ proteine etichettate.

Purificazione di proteine marcate con Strep
Le microsfere possono adsorbire in modo specifico le proteine con il tag strep, e poi con la biotina la proteina può essere eluita dalle microsfere. (Il principio è simile all'esperimento di pull down della GST).

cromatografia di affinità proteinaA/proteina G
Le proteine A e G geneticamente modificate possono legarsi specificamente alla regione Fc delle IgG di mammifero. Legando la proteina A e la proteina G al materiale della colonna, è possibile purificare le IgG e le loro sottoclassi e frammenti mediante cromatografia di affinità.
proteina A: peso molecolare di 42kDa, codificata dal gene spa, con 5 domini strutturali isotipici che legano le immunoglobuline, ciascuno costituito da 3 alfa-eliche.
proteina G: con un peso molecolare di 65 kDa, codificata dal gene spg, lega i segmenti Fc e Fab dell'anticorpo e l'albumina del siero. La proteina G geneticamente modificata rimuove il sito di legame per l'albumina e mantiene solo il dominio di legame Fc, che è più potente della proteina A. La proteina A/proteina G è una proteina geneticamente modificata che lega l'albumina.
proteinaA/proteina G: è una proteina legante geneticamente modificata. È costituita da 4 domini di legame della proteina A e 2 domini di legame della proteina G, con un intervallo di legame più ampio rispetto alla sola proteina A o alla sola proteina G, e combina i loro vantaggi in uno solo, che può essere applicato alla purificazione delle IgG di quasi tutte le specie.

Come identificare la proteina purificata?
SDS-PAGE; HPLC; spettrometria di massa; Western blot; saggi di legame; saggi funzionali; elucidazione strutturale.

4 Microscopia elettronica
Microscopia crioelettronica a singola particella (Single-ParticleAnalysis, SPA)
Microscopia con tomografia crioelettronica (cryo-ET)

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Composto Glucoamilasi	9032-08-0
Pullulanase	9075-68-7
Xilanasi	37278-89-0
Cellulasi	9012-54-8
Naringinasi	9068-31-9
β-amilasi	9000-91-3
Glucosio ossidasi	9001-37-0
alfa-amilasi	9000-90-2
Pectinasi	9032-75-1
Perossidasi	9003-99-0
Lipasi	9001-62-1
Catalasi	9001-05-2
TANNASIO	9025-71-2
Elastasi	39445-21-1
Ureasi	9002-13-5
DEXTRANASE	9025-70-1
L-lattico deidrogenasi	9001-60-9
Deidrogenasi malato	9001-64-3
Colesterolo ossidasi	9028-76-6