Quali sono le caratteristiche e le applicazioni dei vari enzimi delle materie prime IVD?

La reazione a catena della polimerasi (PCR) è una tecnica di biologia molecolare utilizzata per amplificare specifici frammenti di DNA, considerata come una replicazione del DNA al di fuori dell'organismo, grazie alla quale minuscole quantità di frammenti di DNA vengono amplificate in misura tale da poter essere facilmente identificate e riconosciute.

Per le reazioni di PCR, gli "enzimi" svolgono un ruolo cruciale e ogni tipo di "enzima" ha un'attività e una funzione diverse. Quali tipi di enzimi esistono? E quali sono le applicazioni nel campo degli IVD?

DNA polimerasi

Definizione: È un tipo di enzima che utilizza il DNA come modello, si replica dall'estremità 5-terminale a quella 3-terminale del DNA e catalizza la polimerizzazione delle molecole di dNTP substrato per formare DNA figlia.

Attività e ruoli principali: catalizzare la sintesi del DNA. 1, polimerizzazione. 2, 3, → 5, attività esonucleasica - ruolo di correzione 3, 5, → 3, attività esonucleasica - ruolo di riparazione per escissione 4, ruolo di idrolisi dei pirofosfati 5, scambio di pirofosfati.

Le polimerasi del DNA comuni nel campo degli IVD includono: Enzima Taq hot-start, che utilizza una modifica chimica per chiudere l'attività dell'enzima Taq prima che il sistema di reazione venga riscaldato a 70°C, inibendo così l'amplificazione non specifica. DNA polimerasi ad alta fedeltà, contenente un centro di polimerizzazione e un centro di clivaggio; il centro di polimerizzazione ha un'attività polimerasica 5′-3′, responsabile della polimerizzazione; il centro di clivaggio ha un'attività esonucleasica 3′-5′ (nota anche come attività di correzione), responsabile dell'escissione dei nucleotidi non appaiati. (nota anche come attività di correzione), responsabile dell'escissione dei nucleotidi non appaiati.

trascrittasi inversa

Definizione: Enzima che utilizza l'RNA come modello e sintetizza un singolo filamento di DNA complementare al modello di RNA nella direzione 5′-3′.

Principali attività e ruoli: 1. Attività di DNA polimerasi diretta dall'RNA. 2. Attività della RNasi H. 3. Attività della DNA polimerasi diretta dal DNA.

Applicazione nel campo degli IVD: 1, reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa (RT-PCR) 2, costruzione di librerie di cDNA 3, sequenziamento dell'RNA 4, RT-qPCR , 2019 I reagenti del sistema di rilevamento degli acidi nucleici della Nuova Corona configurati, si uniranno inevitabilmente alla trascrittasi inversa. Questo perché i virus a RNA devono essere trascritti in modo inverso in DNA per poter eseguire le reazioni di PCR.

RNA polimerasi

Definizione: una catena di DNA o RNA come modello di polimerasi, perché nella cellula con le informazioni genetiche di trascrizione del DNA, noto anche come trascrittasi.

Principali attività e ruoli: 1, con il DNA come modello; 2, catalizza la sintesi degli acidi nucleici attraverso reazioni di polimerizzazione; 3, fa sì che i nucleotidi formino legami 3,→5,-fosfodiestere; 4, trascrive la sequenza del modello in direzione 5′-3′ secondo il principio dell'appaiamento complementare delle basi.

Le polimerasi dell'RNA più comuni nel campo degli IVD includono la polimerasi dell'RNA T7, che catalizza specificamente il processo di formazione dell'RNA nella direzione 5'→3′. Attualmente, nella diagnostica in vitro, la tecnologia SAT prevede l'applicazione della T7 RNA polimerasi per l'amplificazione dell'RNA. Questa tecnologia è stata ampiamente utilizzata nella rilevazione di agenti patogeni, nello screening dei virus del sangue e nella rilevazione di microbi ambientali.

Proteinasi K

Definizione: La proteinasi K è un potente enzima proteolitico isolato dalla Candida albicans ed è un reagente chiave per l'estrazione del DNA.

Funzione principale: degradare le proteine di membrana e le proteine legate al DNA e favorire la liberazione del DNA. Applicazione in ambito IVD: per l'isolamento e l'estrazione di plasmidi, DNA genomico e RNA. Nella rilevazione degli acidi nucleici virali, la proteinasi K può scindere e inattivare le proteine del capside virale, liberando al contempo il genoma virale per completare l'estrazione degli acidi nucleici.

Enzima UDG

Definizione: alias uracil-DNA glicosilasi, nota anche come uracil -N- glicosilasi o UNGasi. È la struttura chimica che forma i monomeri di DNA e RNA e codifica le informazioni genetiche.

Funzione: Controllo efficiente della contaminazione residua da PCR. Applicazione in IVD: I reagenti PCR per i test clinici contengono l'enzima UDG per prevenire la contaminazione.

Endonucleasi

Definizione: classe di enzimi che riconoscono una specifica sequenza nucleotidica e scindono il legame fosfodiestere tra due desossiribonucleotidi in un sito specifico di ciascuna catena.

Ruolo: ne esistono 3 tipi: tipo 1: sia la modifica che la scissione di riconoscimento, il sito di scissione è lontano dalla sequenza di riconoscimento. tipo 2: solo la scissione di riconoscimento, il sito di scissione è la sequenza di riconoscimento. tipo 3: sia la modifica che la scissione di riconoscimento, il sito di scissione e la sequenza di riconoscimento sono più vicini.

Applicazioni nel campo degli IVD: 1, localizzazione del gene e isolamento del gene, 2, analisi della sequenza delle basi molecolari del DNA, 3, editing dell'ingegneria genetica, 4, formazione della mappa fisica del DNA.

Enzima deconiugante

Definizione: utilizzare l'energia fornita dall'idrolisi dell'ATP per sciogliere i legami idrogeno formati dall'appaiamento dei nucleotidi del DNA a doppio filamento per formare DNA a singolo filamento.

Ruolo: svolge un ruolo di catalizzatore della deconvoluzione del DNA o dell'RNA durante la replicazione del DNA o dell'RNA.

Applicazione nel campo degli IVD: Tecnologia di amplificazione isotermica, che utilizza l'enzima deconiugante stabilizzato al calore invece del processo di denaturazione termica della qPCR, per disfare il doppio filamento e prolungare l'amplificazione. Questa tecnica è meno incline all'amplificazione non specifica ed evita anche il processo di innalzamento e abbassamento della temperatura nel ciclo di PCR, richiedendo solo semplici apparecchiature per il rilevamento.

Enzima modificatore

Definizione: Enzima che catalizza l'incorporazione di basi rare nell'RNA o nel DNA, oppure modifica le basi originali per evitare la distruzione da parte delle endonucleasi di restrizione.

Ruolo: Modifica covalente della struttura di altri enzimi in modo che si trasformino tra una forma altamente attiva e una relativamente meno attiva.

Applicazione in IVD: Test dell'attività dell'enzima modificatore degli acidi nucleici 5mC/m6A Il metodo HTMR fornisce una solida evidenza per la scoperta e la valutazione dell'attività di modulatori di piccole molecole che hanno come bersaglio la metilazione del DNA/RNA.

Pirofosfatasi

DEFINIZIONE: enzima che catalizza la conversione di una molecola di pirofosfato in due molecole di ioni fosfato.

Funzione: La pirofosfatasi inorganica stabile al calore è ancora 100% attiva quando viene riscaldata a 100°C per 4 ore, quindi può essere utilizzata nelle reazioni di PCR per eliminare l'inibizione della PCR da parte del pirofosfato inorganico generato e migliorare la replicazione del DNA.

anticorpo taq

Definizione: Anticorpo contro la Taq DNA polimerasi.

Funzione: Durante l'amplificazione PCR, l'anticorpo Taq si lega all'enzima Taq per inibire l'attività della DNA polimerasi prima della denaturazione ad alta temperatura e può efficacemente inibire l'annealing non specifico dei primer e l'amplificazione non specifica causata dal dimero del primer a bassa temperatura.

Applicazione in IVD: L'elevata efficienza di contenimento dell'anticorpo Taq può migliorare la sensibilità di rilevamento del nuovo kit di rilevamento dell'acido nucleico del coronavirus e aiutare il nuovo rilevamento del coronavirus.

Il processo standard di PCR è suddiviso in tre fasi: Denaturazione del DNA, annealing ed estensione. La reazione di inattivazione può avvenire all'inizio della PCR riscaldando a 50°C per 10 minuti o a 95°C per 2 minuti; l'enzima UDG elimina l'amplificazione generata dal DNA contaminante nel sistema di reazione. Successivamente, il DNA modello viene denaturato a DNA a singolo filamento ad alta temperatura. Due primer si annealizzano con due filamenti di DNA modello rispettivamente sotto DNA polimerasi e a temperatura adeguata. L'anticorpo Taq si lega all'enzima Taq per inibire l'attività della DNA polimerasi e inibire l'amplificazione non specifica a basse temperature. L'aggiunta di pirofosfatasi inorganica alla reazione di PCR idrolizza il pirofosfato in ortofosfato, aumentando l'efficienza di amplificazione della reazione.

Nel 2020, a fronte dell'enorme richiesta di test sugli acidi nucleici, la domanda di mercato di reagenti per la diagnostica molecolare è aumentata drasticamente e, di conseguenza, l'industria degli enzimi grezzi si è sviluppata rapidamente. In termini di produzione, a causa dell'elevata soglia tecnica di produzione delle materie prime enzimatiche per i test molecolari, l'attuale mercato nazionale dipende principalmente dalle importazioni. Negli ultimi anni, parallelamente all'aumento del processo di produzione nazionale, sono state quotate diverse imprese di materie prime e anche le categorie di prodotti si sono gradualmente arricchite, ma è innegabile che l'industria nazionale delle materie prime IVD sia ancora nelle prime fasi di sviluppo, la quota di mercato è anche relativamente piccola, il futuro è destinato ad avere un ampio margine di miglioramento.

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Composto Glucoamilasi	9032-08-0
Pullulanase	9075-68-7
Xilanasi	37278-89-0
Cellulasi	9012-54-8
Naringinasi	9068-31-9
β-amilasi	9000-91-3
Glucosio ossidasi	9001-37-0
alfa-amilasi	9000-90-2
Pectinasi	9032-75-1
Perossidasi	9003-99-0
Lipasi	9001-62-1
Catalasi	9001-05-2
TANNASIO	9025-71-2
Elastasi	39445-21-1
Ureasi	9002-13-5
DEXTRANASE	9025-70-1
L-lattico deidrogenasi	9001-60-9
Deidrogenasi malato	9001-64-3
Colesterolo ossidasi	9028-76-6