Qual è l'approccio della chimica computazionale nella ricerca industriale sugli enzimi?
L'articolo presenta i principali metodi di chimica computazionale utilizzati nella ricerca industriale sugli enzimi, in particolare per guidare l'ingegneria enzimatica, tra cui le simulazioni di meccanica molecolare del campo di forza e di dinamica molecolare, la meccanica quantistica e la modellazione combinata meccanica quantistica/meccanica molecolare, la modellazione elettrostatica continua e il docking molecolare. Questi metodi sono riassunti nel testo da due prospettive: da un lato, i concetti di base dei metodi stessi, i risultati dei calcoli originali, le condizioni di applicabilità e i vantaggi e gli svantaggi; dall'altro, le preziose informazioni ottenute dai calcoli per guidare la progettazione di mutanti e librerie di mutanti.
L'applicazione industriale degli enzimi ha una storia centenaria e la catalisi enzimatica è ampiamente utilizzata in diversi settori come l'industria alimentare, l'agricoltura, la medicina e l'industria chimica grazie alla sua elevata efficienza, all'alta specificità e selettività e al rispetto dell'ambiente. [1-2]. Poiché l'ambiente di applicazione industriale è molto diverso da quello in cui vivono gli enzimi in natura, la natura e la funzione catalitica degli enzimi naturali e il loro ambiente di applicazione di solito non corrispondono o non sono ottimali. In questo caso, è necessario modificare la sequenza aminoacidica naturale dell'enzima con l'aiuto dell'ingegneria enzimatica per migliorare le sue prestazioni. [3]. La strategia di ingegneria enzimatica più comunemente utilizzata è la costruzione di librerie di mutazioni per lo screening, cioè l'evoluzione diretta in laboratorio. [4]. Uno dei prerequisiti necessari per un'evoluzione diretta efficace è che la capacità della libreria (cioè il numero di mutanti contenuti nella libreria) della libreria di mutanti sottoposta a screening sia sufficientemente grande rispetto alla proporzione di mutanti potenzialmente benefici nella libreria. La dimensione di una libreria di mutanti è spesso limitata dal metodo di screening, dalle risorse disponibili e da altre condizioni oggettive. Il problema principale è come aumentare la percentuale di mutanti efficaci nella libreria di mutanti. La comprensione approfondita della relazione tra sequenza dell'enzima, struttura e proprietà importanti può aiutare a identificare gli hotspot di mutazione, a limitare la portata della mutazione e a realizzare una progettazione di qualità della libreria di mutanti. I metodi di chimica computazionale sono un mezzo importante per ottenere questa comprensione. È stato dimostrato che le librerie di mutazioni proteiche basate sulla progettazione computazionale possono aumentare la percentuale di mutanti efficaci di diversi ordini di grandezza rispetto alle librerie di mutazioni casuali. [5]. Per alcuni argomenti difficili di ingegneria enzimatica o proteica, il miglioramento sostanziale che la computazione può apportare può essere sufficiente a determinare il successo o il fallimento finale dell'argomento, che non è più limitato al miglioramento dell'efficienza. Infatti, i metodi della chimica computazionale e della biologia computazionale hanno permesso di progettare con successo enzimi artificiali da zero con funzioni catalitiche che gli enzimi naturali non possiedono. Poiché altre recensioni in questo album sono state dedicate ai metodi per la progettazione ottimale automatizzata di sequenze di aminoacidi, questo articolo si concentrerà sui metodi computazionali per la simulazione e l'analisi di enzimi con una data sequenza di aminoacidi. Naturalmente, i ricercatori possono utilizzare questi metodi per studiare separatamente il wild type e i mutanti e poi confrontare i risultati.
Lo studio delle proteine, in particolare degli enzimi, è da tempo un'importante frontiera della ricerca in chimica computazionale. [6-8]. I metodi principali includono le simulazioni di dinamica molecolare (MD classica) basate su campi di forza della meccanica molecolare classica [9], meccanica quantistica (MQ) [10] e metodi combinati di meccanica quantistica/meccanica molecolare (QM/MM) [8,11-12], la previsione di complessi intermolecolari, cioè il docking molecolare (Docking) [13], e modello continuo polarizzabile (PCM) per quantificare gli effetti elettrostatici e del solvente [ 14]. ) come il modello di Poisson-Boltzmann (PB) [14], e alcuni modelli basati su proprietà geometriche. In questo articolo, forniremo una panoramica di ciascuno di questi metodi da due punti di vista: in primo luogo, sui metodi stessi, compresi i principi di base, i risultati computazionali originali, le condizioni di applicabilità, i (potenziali) vantaggi e svantaggi, ecc.e, in secondo luogo, su come utilizzare questi metodi per ottenere informazioni rilevanti per l'ingegneria, come una comprensione più approfondita dei meccanismi cataliticamente rilevanti, previsioni teoriche o spiegazioni dei cambiamenti nelle proprietà o nelle funzioni di diversi mutanti rispetto al wild-type, che possono guidare la progettazione di librerie di mutazioni di alta qualità per l'evoluzione diretta, o la progettazione di librerie di mutazioni di alta qualità, o la progettazione di banche di mutazioni. progettazione di librerie di mutazioni di alta qualità, o il suggerimento di siti di mutazione specifici e tipi di mutazione basati sull'analisi dei risultati computazionali grezzi, ecc.
1
Simulazione di dinamica molecolare (MD) basata sui campi di forza della meccanica molecolare classica (MM)
1.1
Introduzione al metodo
Per il momento non consideriamo i cambiamenti chimici coinvolti nella catalisi enzimatica, ma solo i processi di cambiamento conformazionale dell'enzima, la formazione e la dissociazione di complessi non covalenti tra l'enzima e i reagenti (o i prodotti) dovuti al movimento termico molecolare. Durante questi processi, lo stato elettronico della molecola non cambia (ad esempio, non vengono rotti o creati legami covalenti) e si applica il modello del campo di forze della meccanica molecolare. Il cosiddetto campo di forza della meccanica molecolare è una funzione matematica empirica che esprime la dipendenza dell'energia potenziale di un sistema molecolare dalla configurazione geometrica (cioè dalle coordinate spaziali di tutti gli atomi che compongono il sistema molecolare) (Fig. 1A). In altre parole, se utilizziamo X per rappresentare le coordinate spaziali di tutti gli atomi e VMM (X ) per rappresentare l'energia potenziale del campo di forza molecolare, l'energia potenziale cambia quando la molecola passa da una conformazione all'altra X1 ad un altro X2:
∆VMM = VMM ( X2 ) – VMM ( X1 ).
Secondo la teoria termodinamica, gli atomi di una molecola sono sempre in moto termico, cioè sono in movimento, X è in continua evoluzione nel tempo; inoltre, quando si effettuano osservazioni sperimentali, il campione è sempre costituito da un gran numero di molecole (con l'eccezione degli esperimenti su singola molecola), con molecole diverse in diversi stati conformazionali. Pertanto, da un punto di vista cinetico, dobbiamo considerare i cambiamenti conformazionali nel tempo e, da un punto di vista termodinamico, dobbiamo considerare la distribuzione di probabilità delle molecole con diverse conformazioni. La simulazione di dinamica molecolare (MD) è il modello più semplice per esaminare questi due aspetti delle proprietà (Fig. 1B). Nella simulazione MD, si parte da una conformazione iniziale, si calcola la forza che agisce su ogni atomo in ogni punto temporale in base alla conformazione corrente e alla funzione di energia potenziale (la forza è la derivata negativa della funzione di energia potenziale rispetto alle coordinate degli atomi), si integrano numericamente le equazioni del moto di Newton per ottenere la conformazione al punto temporale successivo e si ripete il processo per ottenere la traiettoria dell'evoluzione della conformazione nel tempo.
In mezzo, si possono utilizzare algoritmi speciali per simulare l'effetto dei fattori ambientali (ad esempio, temperatura, pressione, ecc.) sul movimento molecolare. Secondo il principio termodinamico, quando l'intervallo di tempo è sufficientemente lungo, la distribuzione di probabilità della conformazione della stessa molecola in diversi punti temporali e la conformazione di diverse molecole nello stato di equilibrio termodinamico sono le stesse (cioè, la media temporale è equivalente alla media del sistema). Pertanto, se la simulazione MD viene eseguita per un periodo di tempo sufficientemente lungo, l'insieme delle conformazioni ottenute dalla simulazione può essere utilizzato come campione della distribuzione delle conformazioni molecolari in un particolare stato di equilibrio termodinamico. In base a questo principio, possiamo analizzare proprietà osservabili arbitrarie di un sistema nel suo stato di equilibrio termodinamico basandoci sulle traiettorie temporali ottenute con la MD.
L'MD fornisce un potente strumento computazionale per analizzare in modo completo il processo cinetico dei cambiamenti conformazionali e le importanti distribuzioni quantistiche termodinamiche a risoluzione atomica, particolarmente importanti per chiarire i principi di progettazione e i meccanismi di funzionamento di macchine biomacromolecolari complesse come gli enzimi. Poiché gli attuali metodi sperimentali per l'analisi della struttura macromolecolare possono fornire solo strutture statiche mediate spazio-temporalmente, le simulazioni MD hanno una funzione insostituibile nella ricerca in materia. Con questa premessa, lo stesso strumento MD è ancora in fase di continuo miglioramento e perfezionamento. Dal punto di vista metodologico, le principali limitazioni del MD derivano da due aspetti: in primo luogo, l'accuratezza del modello del campo di forza molecolare; in secondo luogo, il tempo di simulazione limitato rende difficile realizzare il campionamento completo dello spazio conformazionale. Per quanto riguarda il primo problema, il campo di forza molecolare è stato notevolmente migliorato negli ultimi anni e l'accuratezza della descrizione termodinamica dell'equilibrio conformazionale delle macromolecole biologiche, in particolare dei sistemi proteici, è stata aumentata, riuscendo a simulare con successo una varietà di molecole proteiche dal processo di ripiegamento della testa alla struttura naturale. [15-16]. In termini di tempo di simulazione, grazie allo sviluppo dell'hardware e del software dei computer, è ora possibile realizzare simulazioni dell'ordine dei microsecondi per sistemi di dimensioni usuali (ad esempio, molecole di enzimi di centinaia di residui in soluzione acquosa) utilizzando hardware di calcolo convenzionale (ad esempio, i server multi-core utilizzati dal gruppo). Su questa scala temporale è possibile osservare processi come l'apertura e la chiusura di domini strutturali o regioni ad anello. Se sono disponibili maggiori risorse di calcolo, si possono realizzare anche simulazioni dirette di processi come il legame/dissociazione del substrato. Per studiare i processi su scale temporali al di là della portata della simulazione (ad esempio, cambiamenti funzionali su larga scala di proteine allosteriche, ecc. [17], a condizione che l'utente abbia una conoscenza più approfondita della teoria MD.
Attualmente, la maggior parte delle applicazioni di simulazione MD copre scale temporali da nanosecondi a microsecondi e il campionamento dello spazio conformazionale è per lo più limitato alle vicinanze della struttura iniziale (per le proteine a singolo dominio, di solito si tratta dell'aumento e della diminuzione strutturale dello spostamento della radice media quadrata (RMS) nell'intervallo di 3-4 Å). Pertanto, è necessario utilizzare una struttura iniziale ragionevole come input per l'MD affinché i risultati della simulazione siano significativi. Nella maggior parte dei casi, come strutture iniziali per l'MD si utilizzano strutture cristalline determinate sperimentalmente o strutture basate sulla modellazione comparativa di proteine omologhe. Quando si simulano complessi enzima-substrato, è spesso necessario modellare la struttura iniziale del complesso basandosi sulla struttura dell'enzima vuoto o dell'enzima in complesso con altre molecole, utilizzando il docking molecolare o sostituendo direttamente altre piccole molecole (ad esempio, inibitori) nella struttura cristallina con il substrato. Le simulazioni MD richiedono anche la costruzione di un campo di forza molecolare che rappresenti tutte le unità chimiche del sistema. Quando il sistema da simulare include una piccola molecola come substrato, spesso accade che il campo di forza molecolare standard fornito nel pacchetto software MD non copra la piccola molecola come substrato. In questo caso, è possibile utilizzare uno strumento software in grado di generare automaticamente campi di forza per piccole molecole. [18-19]. I file dei campi di forza devono essere controllati manualmente e utilizzati per brevi prove di simulazione prima di utilizzare i campi di forza generati automaticamente per lunghe simulazioni MD.
Fig. 1 Campo di forza della meccanica molecolare (A) e simulazione di dinamica molecolare (B)
Fig. 1 Campo di forza della meccanica molecolare (A) e simulazione di dinamica molecolare (B)
1.2
Applicazione alla ricerca sugli enzimi
Le informazioni ottenute dalle simulazioni MD possono essere applicate in diversi modi per guidare le modifiche di ingegneria enzimatica [20]. Ad esempio, confrontando le simulazioni MD a temperatura ambiente e ad alta temperatura, è possibile prevedere quali regioni della molecola dell'enzima hanno probabilmente la stabilità strutturale più sensibile alla temperatura ambiente. L'introduzione di mutazioni puntiformi della prolina, di legami disolfuro, ecc. in queste regioni potrebbe potenzialmente migliorare la resistenza al calore dell'enzima. [21-24]. Un'altra strategia per migliorare la stabilità consiste nel progettare mutanti che formino un maggior numero di legami idrogeno e sale in superficie. [25-26]. Prima di convalidare sperimentalmente tali mutanti, il wild-type e i mutanti possono essere simulati in parallelo per valutare teoricamente se la mutazione può ottenere l'effetto desiderato. [27-28]. Oltre che per la temperatura, il MD può essere utilizzato per analizzare l'effetto delle variazioni del pH ambientale, dei solventi, ecc. sulla conformazione delle proteine e sulla loro stabilità. [29-30].
Oltre alla stabilità, il MD è stato applicato per prevedere i residui hotspot che hanno il potenziale di influenzare significativamente le dinamiche conformazionali associate al legame con il substrato e al rilascio del prodotto, fornendo una base per la progettazione di mutazioni o librerie di mutanti che possono alterare la selettività del substrato, la selettività della reazione, la velocità di rilascio del prodotto, ecc. [31-32]. Uno dei modi per studiare la selettività substrato/reazione con il MD è quello di confrontare i risultati della simulazione di complessi enzima-substrato con strutture diverse (iniziali) e prevedere substrato o stati strutturali con maggiore affinità (o maggiore reattività). Un metodo quantitativo rigoroso per calcolare l'affinità (o la reattività) è il calcolo dell'energia libera. [33-34]. A causa della natura computazionalmente intensiva dei calcoli dell'energia libera, la maggior parte delle applicazioni attuali utilizza metodi qualitativi per la previsione: la discriminazione qualitativa dell'affinità relativa può basarsi sulla stabilità della struttura dei complessi piccola-molecola-macromolecola, sull'energia media di interazione intermolecolare, ecc. mentre la discriminazione qualitativa della reattività si basa sulle distribuzioni relative della configurazione geometrica dei gruppi funzionali catalitici e reattivi, ecc. [35]. I risultati di questa discriminazione qualitativa possono essere utilizzati come base per la progettazione di librerie di sequenze ad evoluzione diretta. Inoltre, le simulazioni MD possono essere utilizzate anche per analizzare i residui hotspot intorno al poro di legame substrato/dissociazione prodotto. [36-37]. Questo tipo di applicazione prevede la simulazione di percorsi di dissociazione di piccole molecole dalle proteine, e se ci sono difficoltà con scale temporali di simulazione insufficienti, queste possono essere superate utilizzando tecniche di campionamento potenziato [38-39].
2
Modelli di meccanica quantistica (MQ) e meccanica quantistica/molecolare combinata (MQ/MM)
2.1
Introduzione al metodo
Per simulare le fasi chimiche della catalisi enzimatica, come la creazione e la rottura di legami covalenti, il trasferimento di elettroni e i salti tra stati elettronici diversi, sono necessari modelli di meccanica quantistica (QM). Attualmente, i modelli QM comunemente utilizzati nella chimica computazionale sono classificati in diversi tipi, come quelli ab initio ( ab initio ), teoria del funzionale della densità (DFT) e metodi semi-empirici. [40]. Tra questi, i metodi semiempirici sono i meno costosi dal punto di vista computazionale. Tuttavia, sono metodi non di primo principio e l'affidabilità dei risultati computazionali dipende fortemente dal sistema e dal problema specifico. Sia i metodi ab initio che quelli DFT sono metodi di primo principio e sono universali. I modelli DFT pratici possono contenere approssimazioni teoriche più empiriche rispetto ai calcoli ab initio, ma la DFT può gestire le energie di correlazione elettronica con un'efficienza computazionale molto elevata. Inoltre, per molti problemi di reazione chimica, gli errori di calcolo dei migliori modelli DFT per parametri chiave come le variazioni di energia durante il processo di reazione sono già ridotti a circa 1 kcal/mol e i risultati sono sufficienti per essere utilizzati come base per determinare la solidità chimica di un particolare meccanismo catalitico o percorso di reazione.
Data la configurazione geometrica di una molecola, la sua energia può essere calcolata con il modello QM. Il modello QM è più spesso utilizzato per l'ottimizzazione delle geometrie molecolari, cioè per trovare una struttura localmente stabile (con un'energia più bassa rispetto alle strutture vicine) dopo cambiamenti successivi da una configurazione iniziale, o per trovare i percorsi a più bassa energia che collegano i reagenti ai prodotti e gli stati di transizione lungo i percorsi. Questi calcoli sono intensivi dal punto di vista computazionale, poiché devono essere considerate e confrontate diverse configurazioni geometriche e in genere devono essere eseguiti da decine a migliaia di calcoli a punto singolo. Una strategia comune per risparmiare lo sforzo computazionale consiste nell'ottimizzare dapprima un'ampia gamma di percorsi di reazione utilizzando modelli QM efficienti con un'accuratezza limitata, per poi completare l'ottimizzazione della configurazione utilizzando modelli di maggiore accuratezza in prossimità della configurazione/percorso a più bassa energia ricercata, oppure eseguire calcoli a punto singolo.
Attualmente, l'applicazione dei metodi QM di primo principio all'intera molecola dell'enzima è computazionalmente intensa, fondamentalmente limitata ai calcoli a singolo punto e manca ancora di praticità. Il modello QM/MM (Fig. 2) è comunemente utilizzato per molecole di grandi dimensioni. [11]. In questo modello, il sistema molecolare è diviso in almeno due parti: la parte direttamente coinvolta nella reazione chimica è trattata con il modello QM, mentre il resto è trattato con la meccanica molecolare (MM). Esistono diverse strategie per gestire i confini e le interazioni tra MQ e MM. [41]. Nei modelli QM/MM di primo principio, i calcoli QM sono molto più costosi di quelli MM. Pertanto, i metodi di ottimizzazione conformazionale sono utilizzati principalmente per la regione QM per prevedere o simulare la sua geometria, mentre le simulazioni di dinamica molecolare possono essere utilizzate per campionare la parte MM. [42]. Ciò significa che i risultati del calcolo possono essere più sensibili alla struttura iniziale della regione QM del sistema. In questo caso, sono necessari calcoli con diversi modelli di struttura iniziale per ottenere risultati affidabili. Se i metodi semiempirici [43] o teorie empiriche del legame di valenza [44-45] sono utilizzati per la parte di MQ , è possibile esplorare meglio lo spazio conformazionale e ridurre l'effetto della struttura iniziale con un campionamento MD QM/MM più lungo.
Fig. 2 Meccanica quantistica (MQ)/Molecolare Meccanica (MM) modelli
Fig. 2 Modello meccanico quantistico (QM)/molecolare (MM).
2.2
Applicazione del metodo
Entrambi il modello QM [10] e il modello MQ/MM [41] sono stati ampiamente utilizzati per la previsione teorica e la verifica dei meccanismi chimici delle reazioni catalizzate dagli enzimi. I loro risultati possono aiutarci a individuare quali residui chiave partecipano al processo di reazione chimica, a trovare il passo limitante della reazione, a modellare la struttura degli intermedi di reazione e degli stati di transizione, ad analizzare come interagiscono con l'ambiente enzimatico, ecc. Rispetto al modello QM a cluster, il modello QM/MM è in grado di simulare più realisticamente l'ambiente enzimatico in cui si trovano i centri di reazione chimica. QM/MM è stato ampiamente utilizzato per prevedere/testare teoricamente il meccanismo chimico della catalisi enzimatica e per analizzare e prevedere i possibili effetti dei residui aminoacidici ambientali sul processo catalitico. [46]. In linea di principio, questi risultati possono essere utilizzati per guidare la progettazione di librerie di mutazioni per l'evoluzione diretta con l'obiettivo di migliorare l'attività catalitica e alterare la specificità o la selettività. Uno studio più impegnativo consisterebbe nell'ottenere enzimi artificiali completamente nuovi, basati sulla progettazione di nuovi centri attivi partendo da modelli di struttura di stati di transizione previsti dalla MQ o dalla MQ/MM. [47].
3
Modellazione elettrostatica dei mezzi continui
3.1
Principio del metodo
La catalisi enzimatica avviene quasi sempre in uno specifico ambiente di soluzione. Gli effetti dei solventi hanno un'influenza cruciale sulle proprietà degli enzimi. I modelli per calcolare gli effetti dei solventi nei trattamenti chimici si dividono in due categorie: modelli a solvente esplicito, ad esempio nei campi di forza della meccanica molecolare o nei modelli QM, in cui ogni molecola di solvente e ogni atomo in essa contenuto sono esplicitamente inclusi nel modello; e modelli a solvente implicito o a mezzo continuo. [48], dove che non include le molecole e gli atomi del solvente e che tratta gli effetti del solvente con i cosiddetti "campi medi del solvente". che non include le molecole e gli atomi del solvente, ma tratta gli effetti del solvente con un cosiddetto "campo medio del solvente". Il vantaggio del modello a solvente esplicito è che è in grado di trattare il soluto e il solvente in modo pienamente coerente, modellando realisticamente interazioni specifiche come il legame idrogeno soluto-solvente, il legame salino e così via. Lo svantaggio è che il numero di molecole di solvente è elevato e richiede un elevato sforzo computazionale. Inoltre, l'aumento stocastico del solvente contribuisce in modo significativo all'energia totale del sistema e per eliminare l'effetto dell'aumento è necessario eseguire una lunga media dei campioni di simulazione. Il modello a solventi nascosti rappresenta l'effetto di mediazione del solvente e l'aumento e la diminuzione termodinamica del solvente sono stati mediati.
Per semplicità di trattazione, nel modello a solventi nascosti siamo soliti separare l'effetto del solvente non polare (effetto idrofobico) da quello del solvente polare. L'esperienza ha dimostrato che l'energia libera di solvatazione di un soluto non polare è proporzionale alla sua superficie accessibile al solvente (SASA). Pertanto, per questo componente viene spesso utilizzato il modello di solvatazione SASA. I parametri di questo modello includono i raggi atomici necessari per calcolare la SASA, il raggio della molecola di solvente (1,4 Å per le molecole di acqua) e una costante di proporzionalità per l'energia libera di solvatazione proporzionale alla SASA. Questi parametri sono generalmente determinati adattando i valori sperimentali dell'energia libera di solvatazione di piccole molecole.
I modelli più comunemente utilizzati per considerare gli effetti dei solventi polari trattano la regione occupata dal solvente come un mezzo continuo con una costante dielettrica specifica (78,4 per l'acqua) e la regione del soluto come occupata da un mezzo con una bassa costante dielettrica (comunemente valutata a 2-8) o dal vuoto (costante dielettrica di 1) (Fig. 3A). Il mezzo continuo viene polarizzato dal campo elettrostatico generato dalla distribuzione di carica nella regione del soluto e la distribuzione di carica polarizzata che ne risulta genera a sua volta un campo elettrostatico nella regione del soluto che agisce sulla carica del soluto. Il campo elettrico generato dalle cariche polarizzate è chiamato campo di reazione. Pertanto, il modello elettrostatico a mezzo continuo è noto anche come modello a campo di reazione. Nel modello a mezzo continuo, senza ioni liberi nella regione del solvente, la relazione tra il potenziale elettrostatico dello spazio e la distribuzione della carica nello spazio soddisfa l'equazione di Poisson. In un ambiente di soluzione contenente ioni liberi, la distribuzione spaziale degli ioni è influenzata dal potenziale elettrostatico spaziale. Considerando questo fattore, la relazione tra il potenziale elettrostatico spaziale e la distribuzione spaziale della carica soddisfa l'equazione di Poisson-Boltzmann (equazione PB). L'equazione PB è un'equazione differenziale parziale che riguarda la relazione tra la distribuzione del potenziale elettrostatico e la distribuzione della carica e del dielettrico nello spazio tridimensionale e può essere risolta numericamente. Il metodo numerico più comune per risolvere l'equazione PB per sistemi macromolecolari come gli enzimi è il metodo delle differenze finite (FD), indicato collettivamente come modello FDPB (Figura 3B). [14]. Con FDPB è possibile calcolare il potenziale elettrostatico in tre dimensioni sulla base della distribuzione di carica spaziale del soluto, che a sua volta permette di calcolare altre proprietà come l'energia libera elettrostatica. Nei calcoli di MQ per sistemi di piccole molecole, il campo di reazione è spesso sostituito in modo equivalente dal campo elettrico generato dalla distribuzione di carica superficiale sulla superficie molecolare e il modello corrispondente è chiamato modello del mezzo continuo polarizzabile (PCM).
Il modello più comunemente utilizzato per tenere conto degli effetti dei solventi polari tratta la regione occupata dal solvente come un mezzo continuo con una costante dielettrica specifica (78,4 per l'acqua), mentre la regione del soluto è trattata come se fosse occupata da un mezzo con una bassa costante dielettrica (comunemente valutata a 2-8) o dal vuoto (costante dielettrica di 1) (Fig. 3A). Il mezzo continuo viene polarizzato dal campo elettrostatico generato dalla distribuzione di carica nella regione del soluto e la distribuzione di carica polarizzata risultante genera a sua volta un campo elettrostatico nella regione del soluto che agisce sulla carica del soluto. Il campo elettrico generato dalle cariche polarizzate è chiamato campo di reazione. Pertanto, il modello elettrostatico a mezzo continuo è noto anche come modello a campo di reazione. Nel modello a mezzo continuo, senza ioni liberi nella regione del solvente, la relazione tra il potenziale elettrostatico dello spazio e la distribuzione della carica nello spazio soddisfa l'equazione di Poisson. In un ambiente di soluzione contenente ioni liberi, la distribuzione spaziale degli ioni è influenzata dal potenziale elettrostatico spaziale. Considerando questo fattore, la relazione tra il potenziale elettrostatico spaziale e la distribuzione spaziale della carica soddisfa l'equazione di Poisson-Boltzmann (equazione PB). L'equazione PB è un'equazione differenziale parziale che riguarda la relazione tra la distribuzione del potenziale elettrostatico e la distribuzione della carica e del dielettrico nello spazio tridimensionale e può essere risolta numericamente. Il metodo numerico più comune per risolvere l'equazione PB per sistemi macromolecolari come gli enzimi è il metodo delle differenze finite (FD), indicato collettivamente come modello FDPB (Figura 3B). [14]. Con FDPB è possibile calcolare il potenziale elettrostatico in tre dimensioni sulla base della distribuzione di carica spaziale del soluto, che a sua volta permette di calcolare altre proprietà come l'energia libera elettrostatica. Nei calcoli di MQ di piccoli sistemi molecolari, il campo di reazione è spesso sostituito in modo equivalente dal campo elettrico generato dalla distribuzione di carica superficiale sulla superficie della molecola, e il modello corrispondente è chiamato modello del mezzo continuo polarizzabile (PCM).
Fig. 3 Modello di continuum elettrostatico (A) e alla differenza finita di Poisson-Boltzmann (FDPB) metodo (B)
Fig. 3 Modello elettrostatico continuo (A) e metodo di Poisson-Boltzmann alle differenze finite (FDPB) (B).
3.2
Applicazione del metodo
Una delle applicazioni importanti del modello continuo è lo studio dello stato di protonazione dei gruppi carichi delle catene laterali degli amminoacidi nelle molecole degli enzimi. Il software PROPKA predice la pKa di ciascun gruppo dissociabile risolvendo l'equazione di PB per calcolare l'energia libera elettrostatica per diversi stati di protonazione. [50]. La distribuzione del potenziale elettrostatico di superficie di una molecola enzimatica è un fattore importante che influenza la selettività del substrato dell'enzima. Data la struttura spaziale e lo stato di protonazione di una molecola di enzima, la distribuzione del potenziale elettrostatico di superficie di una molecola di enzima può essere calcolata con il metodo FDPB, che prevede anche l'effetto di mutazioni nei residui aminoacidici o di variazioni del pH ambientale, di variazioni della concentrazione ionica, ecc. sul potenziale elettrostatico di superficie. [14].
Quando si studiano le fasi chimiche della catalisi enzimatica con il modello QM a cluster, è spesso necessario utilizzare il modello PCM per simulare l'influenza elettrostatica dell'ambiente sulla zona di reazione. Se il processo di reazione comporta cambiamenti significativi nella distribuzione delle cariche, i risultati dei calcoli QM sotto vuoto senza l'uso di un mezzo continuo non sono ragionevoli e possono persino portare a conclusioni qualitative errate. Nel modello QM/MM, il centro di reazione è generalmente circondato da molecole solubili che vengono trattate in modo MM e non è generalmente necessario considerare il campo di reazione del mezzo continuo. Tuttavia, se la carica netta del sistema cambia prima e dopo la reazione (ad esempio, calcoli del potenziale redox), è probabile che il contributo dell'ambiente della soluzione al di fuori del confine del sistema all'energia libera della reazione debba essere preso in considerazione, e in questo caso i risultati del modello QM/MM possono essere corretti utilizzando il modello del mezzo continuo.
Come metodo che bilancia efficienza e accuratezza, la MM/PBSA può essere utilizzata per analizzare l'affinità di complessi proteina-proteina e proteina-piccola molecola. [49]. Per ottenere l'annullamento dell'errore, è convenzionale eseguire simulazioni di dinamica molecolare in solvente esplicito dei complessi per ottenere un insieme di conformazioni; per ogni conformazione del complesso, calcolare l'energia MM/PBSA del complesso nel suo complesso e di ciascun monomero che lo compone, rispettivamente; e approssimare l'energia libera di legame utilizzando la media della differenza tra l'energia MM/PBSA del complesso e quella dei monomeri per l'intera conformazione. Questo metodo può essere utilizzato per analizzare i residui hotspot che influenzano l'affinità con il substrato e può anche essere usato per prevedere le variazioni di selettività del substrato nei mutanti.
4
Altri metodi
4.1
Docking molecolare
Il docking si riferisce al processo computazionale di previsione della struttura (e dell'affinità) di un complesso basato sulla struttura di un monomero. Il docking tra piccole molecole e proteine è uno strumento centrale per lo screening virtuale dei farmaci basato sulla struttura, per il quale sono stati sviluppati diversi algoritmi. [13]. Questi algoritmi e modelli possono essere applicati anche al docking di complessi substrato-enzima. Lo screening virtuale dei farmaci richiede la considerazione di un gran numero di piccole molecole diverse e, per motivi di efficienza computazionale, le modifiche strutturali del recettore (o solo della catena laterale) spesso non vengono prese in considerazione nei calcoli di docking molecolare. A differenza dello screening virtuale, negli studi di docking substrato-enzima vengono spesso considerati solo uno o più substrati diversi, mentre i cambiamenti strutturali dell'enzima possono in linea di principio essere presi in considerazione in modo più completo. Il modo più semplice per raggiungere questo obiettivo è ottenere diverse strutture enzimatiche con metodi di campionamento conformazionale come l'MD, che vengono agganciate separatamente al substrato. Nel docking substrato-enzima, spesso è anche possibile utilizzare la disposizione spaziale relativa dei gruppi funzionali del substrato e del catalizzatore per esaminare/valutare i risultati del docking.
4.2
Previsione dei pori di piccole molecole in base alla geometria
Numerosi studi sperimentali hanno rivelato che alcune mutazioni lontane dal centro attivo possono avere un grande impatto sulle prestazioni catalitiche degli enzimi. Alcuni di questi siti possono agire alterando il poro di legame del substrato/rilascio del prodotto, e la dimensione del poro, le proprietà fisico-chimiche dei residui intorno al poro, ecc. possono modificare la velocità di passaggio del substrato/prodotto e influenzare la selettività del substrato. I metodi di previsione dei pori possono essere utilizzati per trovare residui caldi rilevanti e fornire una base per la progettazione di librerie di evoluzione diretta. Sono disponibili diversi metodi basati sulla struttura geometrica per prevedere i pori della superficie delle proteine, le cavità interne, i pori che collegano regioni diverse, ecc. [51-53]. Questi metodi utilizzano strutture spaziali statiche come input e impiegano principalmente metodi geometrici e grafo-teorici per realizzare la previsione con un'elevata efficienza computazionale.
4.3
Metodi di confronto tra centri attivi
Attualmente, nel Protein 3D Structure Database (PDB) è stata accumulata una grande quantità di dati di struttura 3D di enzimi con diversi tipi e famiglie di struttura. Se confrontiamo diversi enzimi, scopriremo che alcuni di essi presentano un elevato grado di somiglianza nei centri attivi (esempi tipici sono i centri attivi della triade catalitica condivisi dalle serina-proteasi), anche se le sequenze strutturali complessive non sono simili. Il metodo di confronto della struttura del centro attivo [54-55] può possono essere utilizzati per recuperare automaticamente i centri attivi di altri enzimi che sono simili al centro attivo dell'enzima corrente. L'impilamento di più centri attivi simili nello spazio tridimensionale e l'analisi delle somiglianze e delle differenze tra i diversi centri attivi possono fornire informazioni preziose per la selezione del sito di mutazione.
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Sintesi
Per motivi di chiarezza espositiva, la nostra introduzione dei metodi sopra citati è suddivisa in categorie. In pratica, i diversi tipi di metodi non si escludono a vicenda. Possono essere utilizzati in combinazione in molti modi per rispondere meglio alle domande di interesse. Ad esempio, nelle simulazioni di complessi enzima-substrato, il docking molecolare può essere utilizzato per ottenere la conformazione iniziale della simulazione; l'insieme delle conformazioni ottenute dalle simulazioni MD può essere utilizzato per l'analisi della previsione dei pori, il docking molecolare, le simulazioni QM/MM, ecc.I modelli MM che inscrivono gli stati di transizione ottenuti dai modelli QM o QM/MM possono essere costruiti e utilizzati per le simulazioni MD classiche a lungo termine per analizzare gli effetti dell'aumento e della diminuzione conformazionale sui processi chimici, o per la simulazione di un gran numero di mutanti per realizzare uno screening virtuale dei mutanti basato sulle simulazioni MD; l'approccio MM/PBSA, di cui abbiamo già parlato, è una combinazione di MD e modellazione del mezzo continuo, e così via.
Lo studio di sistemi di biomolecole come le proteine con metodi di chimica computazionale ha una storia di oltre 40 anni. Questi metodi sono stati utilizzati sempre più diffusamente nella ricerca industriale sugli enzimi, sviluppandosi continuamente. I gruppi di ricerca cinesi nel campo della chimica computazionale e dell'ingegneria industriale degli enzimi si stanno espandendo e le loro capacità di ricerca stanno rapidamente migliorando. L'applicazione della chimica computazionale nell'ingegneria enzimatica sarà ampliata e approfondita man mano che la combinazione incrociata di queste due discipline diventerà sempre più stretta. L'ingegneria delle proteine, l'evoluzione diretta e altre tecniche hanno avuto un grande impatto sulla ricerca industriale sugli enzimi. Lo sviluppo futuro dei metodi computazionali, in particolare la scoperta di nuovi metodi di progettazione enzimatica, dovrebbe portare a nuove scoperte tecnologiche per la ricerca industriale sugli enzimi nell'era della biologia sintetica.
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| Composto Glucoamilasi | 9032-08-0 |
| Pullulanase | 9075-68-7 |
| Xilanasi | 37278-89-0 |
| Cellulasi | 9012-54-8 |
| Naringinasi | 9068-31-9 |
| β-amilasi | 9000-91-3 |
| Glucosio ossidasi | 9001-37-0 |
| alfa-amilasi | 9000-90-2 |
| Pectinasi | 9032-75-1 |
| Perossidasi | 9003-99-0 |
| Lipasi | 9001-62-1 |
| Catalasi | 9001-05-2 |
| TANNASIO | 9025-71-2 |
| Elastasi | 39445-21-1 |
| Ureasi | 9002-13-5 |
| DEXTRANASE | 9025-70-1 |
| L-lattico deidrogenasi | 9001-60-9 |
| Deidrogenasi malato | 9001-64-3 |
| Colesterolo ossidasi | 9028-76-6 |