1. A naringináz enzimaktivitás kimutatási módszere
1-1 Spektrofotométeres módszer
A para-nitrofenol spektrofotometriás módszer p-nitrofenol- α-ramnosidot ( pNP- α- Rha ) és p-nitrofenol-β-D-glükopiranozidot ( pNP- β-Glu ) használ szubsztrátként az α-ramnosidáz és β-glükozidáz enzimaktivitásának kimutatására. Li Ping a p-nitrofenol spektrofotométeres módszert alkalmazta, a kísérletben Aspergillus niger β-glükozidázt adtak a p-nitrofenol -β-glükozid ( pNPG ) oldatához enzimatikus hidrolízis céljából, és az abszorbancia értékét 400 nm ultraibolya hullámhosszon mérték. Az abszorbancia értéke alapján pedig kiszámították a β -glükozidáz enzimaktivitását. Ez a módszer erős szubsztrátspecifitással rendelkezik, de a standard szubsztrát drága, és a naringináz enzimaktivitása az élelmiszerekben lévő glikozidok hidrolizálására nem határozható meg, ezért ez a módszer nem alkalmas az enzimaktivitás kimutatására a naringináz ipari nagyüzemi előállításában.
A Davis spektrofotométeres módszer elve az, hogy a naringin enyhén lúgos körülmények között kromogén reakcióba léphet a 90% dietilénglikollal, és a sárga naringin-kalkon termelődése 420 nm hullámhosszú ultraibolya fényben kimutatható. A mért abszorbanciaérték alapján kiszámítható a szubsztrát naringin maradék mennyisége, majd számítással megkapható a naringináz aktivitás. Wang Weina és munkatársai egy továbbfejlesztett Davis-módszert alkalmaztak, szubsztrátként naringint használtak, és az Aspergillus niger FFCC 848 folyékony fermentációval előállított naringinázt adtak hozzá az enzimatikus hidrolízishez. Az abszorbanciát 420 nm-es ultraibolya fényben mérték, majd kiszámították az enzimaktivitást. Az enzimaktivitás mérésére szolgáló Davis spektrofotométeres módszer egyszerű a működéshez, gyors sebességgel rendelkezik, így ezt a módszert széles körben használják a fermentációval termelt naringináz és az immobilizált naringináz aktivitásának eeal time kimutatására.
1-2 Nagy teljesítményű folyadékkromatográfia
A nagy teljesítményű folyadékkromatográfia ( HPLC) elve az, hogy a HPLC képes pontosan meghatározni és mennyiségileg elemezni a szubsztrát naringint, a köztes termék purunint és a végtermék naringenint a teljes hidrolízisfolyamat során, majd kiszámítani az enzimaktivitást. Chen Yuelong és mások HPLC-t használtak a naringin, az arbutin, a miricetin és termékeik retenciós idejének meghatározására, és teljes elválasztást értek el 1,5-nél nagyobb felbontással, és hatékonyan nyomon követték a naringináz hatását több glikozidra a hidrolízisfolyamatban, ugyanakkor az enzimaktivitást pontosan meghatározták. A HPLC-módszer előnye a nagy pontosság és a szennyeződések interferenciájának elkerülése, de a Davis-módszerrel összehasonlítva ez a módszer hosszabb detektálási idővel és bonyolultabb művelettel rendelkezik.
1-3 Javított módszer a naringináz enzimaktivitás meghatározására
A továbbfejlesztett Davis-módszer alkalmazásával: 0,8 ml 0,8 g-L-1 A 40 mg immobilizált naringinázt (vagy 0,2 ml szabad naringinázt) tartalmazó reakciórendszerbe pH 4,5 pufferrel készített naringinin oldatot adtunk. Helyezzük 50 ℃-os állandó hőmérsékletű vízfürdőbe 30 percre. Vegyünk 0,1 mL-t a reakció enzimes hidrolízis oldatából, és adjunk hozzá 5 mL dietilénglikolt (90% térfogatfrakció) és 0,1 mL NaOH oldatot (4 mol-L-1) a csövekbe, és 10 percig állni hagyjuk, miután egyenletesen összekevertük őket. Mérjük meg a kevert oldat abszorbanciáját 420 nm-en.
A naringináz enzim aktivitásának meghatározása (U) : pH 4,5, 50 ℃ mellett 1 enzimaktivitási egység az az enzimmennyiség, amely 1 μg naringin percenkénti lebontásához szükséges. Az enzimaktivitás aránya ( U-g-1 vagy U-mL-1) meghatározása: pH 4,5, 50 ℃, 1 g immobilizált naringináz (vagy 1 ml szabad naringináz) által mutatott enzimaktivitás. A relatív enzimaktivitás kiszámítása a következő képlet szerint történik :
A standard görbe meghatározása: a standard glikozid naringin oldat tömegkoncentrációja 0, 0,4, 0,8, 1,2, 1,6 g - L-1, majd 0,1 mL oldatot vettünk 5 mL dietilénglikollal (90% , v/v) és 0,1 mL nátrium-hidroxid-oldattal ( 4 mol-L-1). Miután az elegyet egyenletesen összekevertük és 10 percig állni hagytuk, a kevert oldat fényelnyelési értékét 420 nm-en megmértük, és ennek megfelelően megrajzoltuk a standard görbét.
2. A naringináz enzimoldat elkészítése
A 4 ℃-on tárolt Aspergillus niger FFCC uv-11-et átvittük a ferde táptalajra, és az érett spórákat állandó hőmérsékleten, 30 ℃-on 96 órán át történő tenyésztéssel nyertük. Ezután a spórákat steril normál sóoldattal mostuk 0,9% tömegfrakcióval. 600 nm-en mértük a spóraszuszpenzió abszorbancia értékét (OD600 érték), steril sóoldattal az OD600 értékét 0,200-ra állítottuk be. És ezután a spóraszuszpenzió térfogatfrakciója 10% beoltási mennyiség 100 ml fermentációs közeghez (250 ml-es kúpos lombik), A kapott fermentációs levet 4 ℃ és 6000 r-min centrifugáltuk.-1 10 percig hűtött centrifugában. Ezután a szívószűrőn keresztül kapjuk a felülúszó folyadék szükséges naringin enzim enzim folyadékot. Hűtsük le 4 ℃-on a későbbi felhasználásig.
3. A kitozán immobilizált naringináz enzim előállítása
Vegyünk 3,0 g kitozánt, 100 ml 2% ecetsavas oldat térfogatfrakciójával feloldottuk, hogy 0,3 g - L-1 kitozán kolloid oldatot, 20 percig szonikáztuk a légbuborékok eltávolítása érdekében, és hagytuk, hogy teljesen feloldódjon. A kitozán kolloid oldatot cseppenként fecskendeztük be egy tűvel 0,5 g - L-1 NaOH-kondenzátum (1000 ml), hogy sima pelletet képezzen. Hagyjuk állni szobahőmérsékleten 3 órán át, majd a pelleteket többször mossuk desztillált vízzel semlegesre, és a vizet szűrőpapírral felszívtuk, hogy megkapjuk a kitozán mikrogömböket. 0,4 g kitozán mikrogömböt megmértünk, 0,4 ml 6% térfogatrésszel rendelkező glutaraldehidet adtunk hozzá, és a mikrogömböket ismételten desztillált vízzel mostuk, amíg állandó hőmérséklet és 25 ℃ 150 r-min rezgés után nem volt glutaraldehid a mikrogömbök felületén.-1 A térhálósított kitozán mikrogömböket szűrőpapírral történő szárítással nyertük.
Azt mondta, 0,4 g kitozán mikrogömbök, adjunk hozzá 0,4 mL tag száma hitelek 6% glutaraldehid, 150 r - min-1 25 ℃ hőmérsékleten oszcilláció 2 óra elteltével többször mosott desztillált vízzel mikro- gömb felületére nem pentil-dialdehid és szűrőpapír szárítjuk, hogy keresztkötésű kitozán mikrogömbök. Vegyünk 4 ml naringináz enzimoldatot, adjuk hozzá 0,4 g térhálósított kitozán mikrogömbhöz, rázzuk állandó 25 ℃ hőmérsékleten, 150 r-min-1 2 órán keresztül, majd tegye hűtőszekrénybe 4 ℃-on 4 órára adszorpciós csatolásra. Öblítse le a hordozó felületén visszamaradt enzimoldatot pH 4,5 pufferrel, szívja fel a vizet a szűrőpapírra, hogy immobilizált naringinázt kapjon, és tárolja hűtőszekrényben 4 ℃-on későbbi felhasználásra.
4. Mágneses szilícium-alapú kitozán ( MSC) mikrogömbök előállítása
A mágneses szilícium alapú nanorészecskék ( MS) előállítási folyamata az 1. ábrán látható.
1. ábra Mágneses szilícium alapú nanorészecskék előállításának vázlata
( 1) Először is, a mágneses Fe3O4 nanorészecskéket citromsavval módosított kémiai ko-precipitációs módszerrel állítottuk elő, és a kísérleti eljárás a következő: 2,25 g FeCl3-6H2O és 1,61 g FeSO4-7H2O-t adunk 100 ml ionmentesített vízzel töltött háromnyakú lombikba, a rendszer hőmérsékletét nitrogéngázzal 85 ℃-ra melegítettük. Keverjük 1000 r-min alatt-1 és gyorsan öntsünk rá 10 ml tömény ammóniavizet. Miután az oldat megfeketedik, adjunk hozzá 153 mg nátrium-citrátot. A 30 perces reakció után válasszuk szét a termelést mágnessel, és mossuk a szilárd fázist többször deionizált vízzel és etanollal. A Fe3O4 a kapott nanorészecskéket későbbi felhasználás céljából megszárítják.
( 2) Ezután szol-gél módszerrel mágneses szilícium alapú nanorészecskéket (MS) állítottunk elő, amelyeket az 1. ábra mutat. A kísérleti lépések a következők: 0,1 g Fe3O4 nanorészecskéket egyenletesen eloszlattuk egy kevert oldatban, amely 40 ml vízmentes etanolt, 10 ml desztillált vizet és 1,2 ml tömény ammóniavizet tartalmazott. 300 r-min keverési körülmények között-1, Fe3O4 nanorészecskéket adtunk a 30 ml vízmentes etanolban diszpergált TEOS-hoz (0,4 ml), és a szilícium alapú nanorészecskék reakcióját 12 órán keresztül végeztük szobahőmérsékleten. A termékeket többször mostuk vízmentes etanollal és desztillált vízzel, hogy mágneses szilícium-dioxid alapú nanorészecskéket (MS) kapjunk, amelyeket a későbbi felhasználás céljából megszárítottunk.
Az MSC mikrogömböket emulziós térhálósítási módszerrel állítottuk elő, amint azt a 2. ábra mutatja. A kísérleti lépések a következők voltak: Az 5,0% térfogattömegű ecetsavoldatban oldott kitozánnal készített 2,5% tömegtömegű 10 ml kitozánoldathoz egyenletesen eloszlatva 0,125 g mágneses szilícium-dioxid nanorészecskéket (MS), majd a kitozánoldatot cseppenként hozzáadtuk egy 60 ml folyékony paraffinviaszt és 1,8 ml twain 80-at tartalmazó emulzióhoz. Miután 30 percig kevertettük 40 ℃-os vízfürdő és 800 r-min feltételekkel-1， hozzáadunk 2,0 mL glutaraldehidet és 1 órán át reagálunk, majd a rendszer pH-ját 1 mol-L-1 NaOH-val, és a reakciót 1 órán át folytattuk. A termékeket többször mostuk petróleuméterrel, etanollal és desztillált vízzel, hogy MSC mikrogömböket kapjunk, amelyeket vákuumban szárítottunk a későbbi felhasználás céljából.
2. ábra Mágneses szilícium alapú kitozán mikrogömbök előállításának vázlata
5. Epoxi alapú mágneses szilícium alapú kitozán mikrogömbök előállítása ( MSCE)
0,5 g szárított, a 4. módszerrel előállított MSC mikrogömböt lemértünk, és egy 50 ml-es Erlenmeyer-lombikba adtuk. Ezután 2,0 ml NaOH-oldatot, epikrolohidrin-oldatot és NaBH4 oldatot adtunk a lombikba egy bizonyos koncentrációban. A reakciót pedig egy bizonyos ideig állandó hőmérséklet-ingadozással végeztük. Az MSCE előállításának reakciómechanizmusa a 3. ábrán látható.
3. ábra Az epoxi alapú mágneses szilícium alapú kitozán mikrogömbök előállításának elve
Az aktiválás után az aktivált mikrogömböket többször desztillált vízzel mossuk, amíg a felületen nem maradnak szabad OH- és epoxicsoportok, hogy epoxi alapú mágneses szilícium alapú kitozán mikrogömböket ( MSCE) kapjunk. A kimutatási módszer a következő: vegyünk 3,0 ml mosási felülúszót, és adjunk hozzá 1~2 csepp fenolftaleint. Rázogatás után, ha nem változott pirosra, akkor az azt jelenti, hogy nincs szabad OH- az MSCE-vel; vegyünk 3,0 mL mosási felülúszót, és adjunk hozzá 3,0 mL 1,3 mol-L-1 nátrium-tioszulfát és 1 ~ 2 csepp fenolftalein, ha az oldat nem vált vörösre rázás után, ez azt jelenti, hogy nincsenek szabad epoxi csoportok MSCE-vel. Az epoxicsoport kimutatásának reakcióegyenlete a következő:
6 MSCE immobilizált naringináz enzim előállítása
5,0 g 5. módszerrel készített MSCE-t adtunk 50 ml naringináz enzimoldathoz egy bizonyos pH-értékkel, és a reakciót állandó hőmérsékletű vízfürdő alatt oszcilláltuk, amint azt a 4. ábra mutatja. A reakciót követően a mikrogömböket többször mostuk pufferoldattal, amíg a mikrogömbök felületén nem találtunk szabad naringinázt. A mikrogömböket Brinella-tölcsérrel lecsapoltuk, hogy MSCE immobilizált naringináz enzimet kapjunk, amelyet 4 ℃-on hűtöttünk a későbbi felhasználásra.
4. ábra Az MSCE immobilizált naringináz enzim előállításának elve
Lépjen kapcsolatba velünk most!
Ha szüksége van Price-ra, kérjük, töltse ki elérhetőségét az alábbi űrlapon, általában 24 órán belül felvesszük Önnel a kapcsolatot. Ön is küldhet nekem e-mailt info@longchangchemical.com munkaidőben ( 8:30-18:00 UTC+8 H.-Szombat ) vagy használja a weboldal élő chatjét, hogy azonnali választ kapjon.
