蛋白质和酶工程的重点是什么？
1.蛋白质工程：在研究蛋白质结构与功能关系的基础上，利用基因工程技术或化学修饰技术将现有蛋白质转化为新蛋白质的现代生物技术。
2. Enzyme engineering: the use of enzymes, organelles or cell-specific catalytic function, through the appropriate reactor industrialized production of human products or to achieve a particular purpose of a technical science.
3. The main content of enzyme engineering research:
1) chemical enzyme engineering
(2) biological enzyme engineering
(3) Immobilized enzymes and cells
(4) Enzyme reactors and sensors
5) Non-aqueous phase catalysis of enzymes
4. Fusion of proteins: recombination of part of the gene encoding one protein to another protein gene, or combination of fragments of different protein genes to produce new fusion proteins by gene cloning and expression.
5. The role of protein fusion:
1) For isolation and purification of expression products;
2) To improve the solubility of expression products;
3) to improve protein stability.
6. Protein crystallography: the engineering of structural studies of biological macromolecules using X-ray diffraction technology, an important part of structural biology.
8. 靶向突变：通过分子克隆的方法，有针对性地改变特定基因的局部核苷酸序列，通常用于研究蛋白质的功能结构以及修饰目标蛋白质。
10.酶工程的研究范围：
1) 开发和生产各种天然酶；
2) 酶的分离、纯化和鉴定技术；
3) 固定技术；
4) 利用其他生物技术领域进行交叉授粉；
5) 多酶反应器的开发和应用。
11.酶的稳定性和稳定性：
(i) 酶失活的原因：
(1) 酶活性中心的某些特定氨基酸残基被化学修饰，从而使酶失去活性（微观）；
(2）受外界环境影响，酶的活性中心存在空间障碍，使其无法与底物结合；
3) 酶高级结构的变化（螺旋和折叠的变化）；
4) 多肽链断裂（非常强）；
(ii) 稳定酶：
(1）低温保存（酶本身不变性，其他酶不易降解目标蛋白）；
2) 添加盐分（高浓度 (NH4)2SO4）；
3) 添加配体，如底物辅酶；
4) Addition of strong denaturants (to protect the primary structure and revive it when used);
5) 结晶。
12.微生物作为酶源的优越性：
1) 容易获得酵素所需的酶；
2) 容易获得高产菌株；
3) 生产周期短；
4) 生产成本低；
5) 易于生产管理；
6) more ways to improve microbial enzyme production.
13. Immobilized enzyme: It refers to the enzyme that exists in a certain space in a blocked state, which can continuously carry out the reaction, and the enzyme can be recycled and reused after the reaction.
14.固定酶的优点：
1) 将固定化酶从产品和底物中分离出来非常容易；
2) 可进行重复的批量反应，并在长时间的连续反应中加载色谱柱；
3) 在大多数情况下能提高酶的稳定性；
4) 可以严格控制酶的反应过程；
(5) 产品溶液中没有酶残留，简化了纯化过程；
6) 与游离酶相比，它更适用于多酶反应；
7) The yield of the product can be increased and the quality of the product can be improved;
8) the efficiency of enzyme use is increased and the cost is reduced.
15.固定酶的缺点：
1) 固定时会失去酶的活性；
2) 生产成本增加，工厂初期投资巨大；
3) 只能用于可溶性底物，更适用于小分子底物；
4) 与完整的噬菌体相比，不适合多酶反应，尤其是需要辅助因子的反应；
5) 细胞内酶必须经过的分离程序。
16.制备固定化酶的原理：
1) 必须注意保持酶的催化活性和特异性；
2) 固定化应有利于自动化和生产的连续性；
(3) The immobilized enzyme should have the smallest spatial site resistance, as far as possible not to hinder the proximity of the coal and the substrate, in order to improve the product yield;
4) 酶和载体必须有很强的结合力，这样固定化的酶才能被回收，储存起来便于重复使用；
(5) 固定化酶应具有最大的稳定性，所选载体不应与废品或反应溶液发生化学反应；
(6）固定化酶成本要低，有利于工业化使用。
17.固定酶的方法：
(i) 非共价结合法：
(1）结晶法：适用于酶活性较低的酶，结晶后浓度发生变化，恒定连续使用无损失；
(2）分解法：将酶制成干粉，分散在水中的不溶相中，即使干粉悬浮在溶剂中，优点：回收较方便，缺点：干粉易吸水，颗粒变大，活性降低，影响酶在有机溶剂中的活力；
(3）物理吸附法：将酶物理吸附在不溶性载体上的方法；优点：酶活性中心不易被破坏，高级结构变化少，酶活性损失小，也适用于固定化细胞；缺点：酶与载体相互作用弱，酶易脱落；
(4）通过离子键与水溶性载体结合；优点：操作简单，条件温和，高级结构和活性中心不会被破坏，也适用于固定化细胞；缺点：载体与酶的结合力较弱，阴离子或阳离子缓冲液的离子浓度影响较大，酶更容易从载体上脱落；
(ii) 化学结合法：
(1）共价结合法：酶与载体共价结合；方法：将载体相关基因激活，然后与酶相关基因发生偶联反应，在载体上的结合力比较强，一般不会因固定底物浓度的变化而改变；缺点：反应条件比较激烈，常导致高层结构的改变，破坏活性中心，只适用于酶的固定化，不适合细胞的固定化；
(2）交联法：就采用多功能试剂或双功能试剂，使酶与酶或微生物与微生物细胞交联固定的方法，一般通过降低交联剂的浓度和反应时间来保持酶的活性；
(iii) 嵌入方法：
(1）网格型：将酶或微生物包埋在细网格状的聚合物凝胶中，这种方法是固定微生物细胞用得较多的方法；优点：不需要与酶蛋白结合反应，酶活性回收率高；
(2）微胶囊型：酶分子被封装在一个胶囊中，聚合物膜是半透膜，这种胶囊是不透水的，可以存在于某些无水有机相中。
18.固定化酶的特性：
(i) 固定后酶活性的变化：
原因
(1) The spatial conformation of the enzyme molecule changes during immobilization, even affecting the amino acids in the active center;
固定后，酶分子的空间自由度受到限制，这直接影响了活性中心对底物的空泡效应；
内部扩散阻力使底物分子在接近活性中心时受到阻碍；
嵌入后，酶被一层高分子半透膜包围，大分子底物无法透过膜接近酶；
固定化对酶稳定性的影响：
热稳定性增加；
2) 提高对各种有机试剂和酶试剂的稳定性；
(3) 对不同 pH 值的稳定性、蛋白酶的稳定性、储存稳定性和操作稳定性都有影响；
(4）固定化酶稳定性增强的原因：固定化酶与载体可以多点连接，防止蛋白酶分子拉伸变形；固定化后酶的活力得到缓解，释放出来；抑制酶的自我降解；
(iii) 最佳温度发生变化--升高；
(iv) 最佳 pH 值变化：扩大范围；
(v) Km 的变化（米氏常数的变化 -- 变小，亲和力增加）。
19.固定方法
1) 将辅酶和酶共同固定在同一载体上，可形成一个永久不含额外辅酶的系统；
2) 将辅酶直接固定在酶分子上。
20. cell immobilization: cells that are restricted from free movement, i.e., the cells are physically and chemically constrained or limited to certain spatial boundaries, but the cells still retain catalytic activity and have the viability to be used repeatedly and continuously.
1.细胞固定化的优缺点：
优点1) 固定化细胞保持了细胞内酶系的原始状态和自然环境，因此更加稳定；
保持细胞内原有的多酶系统，对于多步催化优势更明显，不需要辅酶再生；
固定化增殖细胞发酵优势更明显；固定化细胞密度高，可增殖，缩短发酵生产周期；发酵稳定性好，可重复较长时间连续使用；发酵液中含生物较少，有利于产品的分离纯化，提高产品质量；
缺点1) 细胞中各种酶的存在会形成不需要的副产品；
细胞膜、细胞壁和载体的存在也会形成扩散限制；
3) 载体形成的孔隙大小会影响聚合物基底的渗透性。
2. 化学修饰：蛋白质的共价结构因加入或去除化学基因而发生改变，我们将这种现象称为化学修饰。
3.影响蛋白质官能团反应性的因素：1）微区的极性：2) 氢键效应；3) 静电效应；4) 位阻效应。
4.酶蛋白功能水平高反应性：指蛋白侧链基因与个别试剂能发生快速反应。
5. Factors affecting hyperreactivity:
1) Alteration of the pK value of the protein function;
2) Greater reactivity of the functional group of the protein;
3) Electrostatic interactions to attract reagents and orient them appropriately;
4) stereochemical adaptation between the reagent and the protein region close to the modification site.
6. determinants of modifier reactivity:
1) selective adsorption;
2) Electrostatic interactions;
3) Site resistance factors;
4) catalytic factors:
5) microzone polarity (polarity of the local environment).
7. control of modification reaction specificity:
(i) 试剂的选择：
(1) 氨基酸的修饰有几种情况：
a.修改所有氨基而不修改其他基因；
b. 通过反修饰对α-氨基进行修饰；
c. modification of amino acids with catalytic activity; d. change the charged state and solubility of proteins, change the charged state of proteins to choose reagents that can carry the maximum charge under neutral conditions, change the solubility of proteins the reaction is carried out in water, the choice of chemical reagents for the water-soluble; 3) quantitative determination of the reaction product; 4) consideration of the size of the reagent: the choice of reagent size is smaller to facilitate the modification, not to cause large changes in the conformation of the protein;
选择反应条件：
反应条件不会导致蛋白质发生不可逆变性；
反应条件的选择有利于对蛋白质进行特定修饰；
(iii) reaction specificity: 1) can use the specificity of some genes in the protein; 2) choose different reaction pH; 3) use some product instability; 4) affinity labeling; 5) differential labeling: in the system there are enzyme molecules, substrates, inhibitors exist; 6) use the difference in protein state.
8.亲和试剂：又称位点特异性抑制剂，试剂作用于被作用位点上的基因，不与被作用位点外的其他基因发生作用，这类修饰剂称为亲和试剂。
9.亲和性标记：亲和试剂一般具有与底物相似的结构，对酶的活性位点具有高度的亲和性，可对活性位点上的氨基酸残基进行共价标记，这类化学修饰标记的特异性亲和性，也称为不可逆抑制的特异性。
10. 固定酶：在一定空间上，处于封闭状态，可发生连续作用，最后循环使用。
11. how immobilization affects enzyme stability through the following three effects:
1) producing spatial barriers;
2) Producing diffusion restrictions;
3) multipoint covalent attachment.
12. 稳定方法：
(i) immobilization (chemical binding, embedding method, etc.): 1) generating spatial barriers: inhibiting chemical inactivation; 2) generating diffusion limitations: embedding the enzyme inside the porous particles, where the substrate contacts the surface of the porous particles before diffusing into the interior to interact with the enzyme, uncontrolled by the concentration of the substrate; 3) multipoint covalent linkage: linking the enzyme covalently to the surface of the carrier at multiple points, or cross-linking the enzyme with a bifunctional reagent or lowering the enzyme to be encapsulated in the carrier The tight pore can make the enzyme conformation more solid, thus preventing the enzyme conformation from folding state to stretching state excessively.
13.核糖核酸酶：是对具有催化活性的 RNA 的描述，其化学本质是核糖核酸具有酶的催化功能，底物可以是不同的分子，也可以是同一 RNA 分子的某些部分。
14. natural nucleases: (a) shear-type nuclease (catalyze the cutting of self and heterogeneous RNA, nucleic acid endonuclease): 1) hammerhead nuclease; 2) hairpin nuclease; 3) protein-RNA complex enzyme; (b) splicing nuclease: including group Ⅰ intron and group Ⅱ intron; to achieve self-scissoring of RNA; with the activity of nucleic acid endonuclease and ligase.
15.体外筛选：从一个由随机排列的 RNA 或 DNA 分子构建的大容量随机分子库开始，筛选出极少量具有特定功能的分子。
16.适配体能与有机物或蛋白质等配体特异高效结合的 RNA 或 DNA 片段分别称为 RNA aptamers 或 DNA aptamers。
17.筛选适配体方案：1）化学合成一个 DNA 分子库，在分子链上的某个位置引入完全随机或部分变异的顺序，分子的两端是固定的顺序，依次进行 PCR 扩增；2）经过几轮 PCR 扩增后，体外转录形成一个随机有序的 RNA 库；3）这些 RNA 分子通过与靶分子结合的亲和层析柱，根据 RNA 与靶分子结合能力的大小将其区分开来，结合能力强的 RNA 分子最后被洗脱下来；4）洗脱下来的 RNA 分子经过反转录、PCR 扩增、转录后，在进行下一个筛选周期，经过 5 到 10 个周期后，得到富含与靶分子亲和力高的 RNA 分子的文库。
18.核酸酶筛选过程：1）通过转录随机序列的 RNA 来构建随机 DNA 文库；2）随机文库中具有催化活性的分子可以催化底物并进行共价连接；3）反应产物通过固定在底物 RNA 5'端的顺序互补配对的寡核苷酸亲和柱，选择性吸附随机文库中那些可以催化连接反应的 RNA 分子；4）经过高盐洗脱：反转录、PCR 扩增、转录，进入下一轮筛选；5）在下一轮筛选周期中，通过易错 PCR 将突变以一定频率引入活性分子中，从而提高筛选得到的随机文库的分子多选择性；6）经过几轮筛选，具有催化活性的 RNA 分子被富集，活性相对较低的分子被淘汰。
19. Deoxyribonuclease: a catalytic single-stranded DNA fragment synthesized using in vitro molecular evolution techniques has efficient catalytic activity and structure recognition.
1. In vitro selection methods: 1) synthesize DNA molecules artificially without transcription and reverse transcription, and amplify them directly by PCR; 2) obtain single-stranded DNA molecules: PCR amplification is performed by attaching a biotin to the primer, and passing the PCR product through the affinity column of biotin proteins for the separation of positive and negative strands; 3) introduce divalent metal ions as cofactors; 4) introduce some additional functional groups into the DNA to increase the structure recognition and structure recognition ability of the deoxyribonucleases. additional functional groups into the DNA to increase the structural and functional affinity.
2.脱氧核糖核酸酶的分类： （裂解 RNA 的脱氧核糖核酸酶） （裂解 DNA 的脱氧核糖核酸酶） （具有激酶活性的脱氧核糖核酸酶） （具有连接酶功能的脱氧核糖核酸酶） （催化卟啉环己基金属螯合反应）
反义核酸：一种 DNA 或 RNA 分子，与 mRNA 分子结合，形成空间位点屏障，除了降解 mRNA 外，还阻止其与核糖体结合，从而翻译成蛋白质。
4. 合理设计酶分子：利用生物化学、晶体学、光谱学等各种方法研究天然酶或实际变异性，以获得酶分子特征。空间结构。结构与功能的关系以及氨基酸残基等信息，然后以此为基础进行酶的改造。
5.酶分子的非合理设计：不需要酶分子结构的准确信息，通过随机突变、基因重组、空白筛选等方法，对酶分子进行改造，定向选择所需性质的突变酶。
6. Directed evolution of enzyme molecules: that is, the development direction of enzyme molecules; it is to start from one or more existing parent enzymes (natural or artificially obtained), to construct an artificial mutant enzyme library through mutation or recombination of genes, and to ultimately obtain the evolutionary enzymes with certain characteristics of the leading expectations through screening. Directed evolution = random mutation + forward recombination + selection (or screening).
7. Error-prone PCR: When using Taq enzyme for PCR amplification of the target gene, the mutation frequency of Taq enzyme is changed by adjusting the reaction conditions, such as increasing the concentration of Mg2+, adding Mn ions, changing the concentration of dNTP in the system, etc., so as to randomly introduce mutations to the target gene at a certain frequency to construct a mutation library, and then select or screen the required mutants.
8.连续易错 PCR：利用一次 PCR 扩增得到的突变基因作为下一次 PCR 扩增的模板，连续反复地进行随机诱变，使每次后的小突变累积起来，产生重要的有意突变。
9.DNA 重组：将不同基因中获得的阳性突变结合起来，形成新的突变基因库，也称为有性 PCR。
10.DNA 重组操作：从阳性突变基因库中分离出的DNA片段被脱氧核糖核酸酶Ⅰ随机切割，得到随机片段，在不加引物的情况下经过几个PCR循环，在PCR循环过程中，随机片段互为模板和引物进行扩增，直至得到全长基因，从而导致不同基因的片段之间发生重组，亲本中的有意突变发生重组。进行重组。
AI-based Biological Component Mining and Modification Topics (September 20-22 \ Jinan)
11.交错延伸法：在 PCR 反应中，传统的退火和延伸合并为一步，反应时间大大缩短，因此只能合成很短的新生链。变性后的新生链作为引物与系统中同时存在的不同模板进行退火反应，然后继续延伸。这一过程不断重复，直到产生全长基因片段，从而产生含有不同模板序列的间隔新生 DNA 分子。这种新生 DNA 分子含有大量突变组合，有利于产生新的酶特性。
12.基因库：将一种生物的基因组 DNA 用限制性内切酶部分消化后，将酶切片段插入载体 DNA 分子中，所有插入载体分子中的基因组 DNA 片段集合起来就包含了这种生物的全部基因组，这也就构成了该生物的基因库。
13. Representativeness of the library: it refers to whether the DNA molecules contained in the library can completely reflect all the possible changes and alterations of the exogenous genes, which is the most important indicator of the quality of the library. It is the most important indicator of the quality of the library. The indicator of the representativeness of the library is the library capacity of the library.
14.文库容量：指构建的原始突变文库中包含的独立重组克隆的数量。
15.用于构建突变文库的载体：（λ 噬菌体载体系统）（质粒载体系统）（哺乳动物细胞表达载体系统）。
16.酶模拟：又称人工酶或酶模型，是一门在分子水平上模拟酶活性位点的形状、大小、微环境等结构特征以及酶的作用机理和立体化学的应用科学。
17.酶模型的（催化基团）和（底物）必须具有相互匹配的立体化学特征，这对形成良好的反应特异性和催化效力相当重要。
18. “Subject-guest” chemistry: The field of chemistry in which the subject (enzyme) and the guest (substrate) form stable complexes through ligand and other secondary bonds is called “subject-guest” chemistry.
19.模拟酶的分类：（a）根据类型：1) 简单酶模型；2) 机械酶模型；3) 简单合成酶类化合物；(b) 按性质分类：1) 主体-客体酶模型；2) 胶束酶模型；3) 肽酶；4) 半合成酶：1) 主体-客体酶模型；2) 胶束酶模型；3) 肽酶；4) 半合成酶；5) 分子印迹酶；6) 抗体酶。
20.抗体酶：抗体的高选择性和酶的高效催化能力的产物，其实质是一类具有催化能力的免疫球蛋白，又称催化抗体，特异性超过酶反应特异性的催化速度，有的还能达到酶的催化速度。
21.分子印迹：制备对某种化合物具有选择性的聚合物的过程，这种化合物称为印迹分子，也称为模板分子。
22.分子印迹法的原理（分子印迹法的制备方法）：1）选择印迹分子的功能单体，使两者发生互补反应；2）在印迹分子--单体络合物周围发生聚合反应；3）通过萃取将印迹分子从聚合物中去除；4）在聚合物内形成一个保留有与印迹分子形状、大小完全相同的空腔，该聚合物可以高选择性地重新结合印迹分子。
23.表面分子印迹的类型：1) 作为载体的无机材料表面的分子印迹；2) 固体材料的表面改性；3) 蛋白质表面印迹。
24.生物印迹：分子印迹的一种，是指以天然生物材料（如蛋白质和糖类）为骨架，在其上进行分子印迹，并生成具有特定识别空穴的印迹分子的过程。
25.生物压印的原理：生物大分子构象的灵活性在无水有机相中被抵消，其构象是固定的，因此模板分子与生物大分子在水溶液中相互作用产生的构象变化只有在移入无水有机相后才能保留。
26.通过生物压印将蛋白质转化为半合成酶：1) 蛋白质部分变性，扰乱起始蛋白质的构象；2) 加入印记分子，使印记分子与部分变形的蛋白质完全结合；3) 印记分子与蛋白质相互作用后，用交联剂使印记蛋白质交联；4) 通过透析去除印记分子。
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