蛋白酶和酶工程

1.蛋白质工程：在研究蛋白质结构与功能关系的基础上，利用基因工程技术或化学修饰技术将现有蛋白质转化为新蛋白质的现代生物技术。
2. 酶工程：利用酶、细胞器或细胞的特定催化功能，通过适当的反应器工业化生产人类产品或实现特定目的的一门技术科学。
3.酶工程研究的主要内容：1) 化学酶工程 2) 生物酶工程 3) 固定化酶和细胞 4) 酶反应器和传感器 5) 酶的非水相催化作用
4.蛋白质融合：将编码一种蛋白质的部分基因与另一种蛋白质基因重组，或将不同蛋白质基因的片段结合在一起，通过基因克隆和表达产生新的融合蛋白质。
5.蛋白质融合的作用：1）用于分离和纯化表达产物；2）提高表达产物的溶解度；3）提高蛋白质的稳定性。
6.蛋白质晶体学：利用 X 射线衍射技术研究生物大分子结构的工程，是结构生物学的重要组成部分。
8. 靶向突变：通过分子克隆的方法，有针对性地改变特定基因的局部核苷酸序列，通常用于研究蛋白质的功能结构以及修饰目标蛋白质。
10.酶工程的研究范围：
1) 开发和生产各种天然酶；
2) 酶的分离、纯化和鉴定技术；
3) 固定技术；
4) 利用其他生物技术领域进行交叉授粉；
5) 多酶反应器的开发和应用。
11.酶的稳定性和稳定性：
(i) 酶失活的原因：
(1) 酶活性中心的某些特定氨基酸残基被化学修饰，从而使酶失去活性（微观）；
(2）受外界环境影响，酶的活性中心存在空间障碍，使其无法与底物结合；
3) 酶高级结构的变化（螺旋和折叠的变化）；
4) 多肽链断裂（非常强）；
(ii) 稳定酶：
(1）低温保存（酶本身不变性，其他酶不易降解目标蛋白）；
2) 添加盐分（高浓度 (NH4)2SO4）；
3) 添加配体，如底物辅酶；
4) 添加强变性剂（以保护初级结构并在使用时使其恢复活力）；
5) 结晶。
12.微生物作为酶源的优越性：
1) 容易获得酵素所需的酶；
2) 容易获得高产菌株；
3) 生产周期短；
4) 生产成本低；
5) 易于生产管理；
6) 改进微生物酶生产的更多方法。

13.固定化酶：是指酶在一定空间内以阻滞状态存在，可持续进行反应，反应后酶可回收再利用。
14.固定酶的优点：
1) 将固定化酶从产品和底物中分离出来非常容易；
2) 可进行重复的批量反应，并在长时间的连续反应中加载色谱柱；
3) 在大多数情况下能提高酶的稳定性；
4) 可以严格控制酶的反应过程；
(5) 产品溶液中没有酶残留，简化了纯化过程；
6) 与游离酶相比，它更适用于多酶反应；
7) 增加产品产量，提高产品质量； 8) 提高酶的使用效率，降低成本。
15.固定酶的缺点：
1) 固定时会失去酶的活性；
2) 生产成本增加，工厂初期投资巨大；
3) 只能用于可溶性底物，更适用于小分子底物；
4) 与完整的噬菌体相比，不适合多酶反应，尤其是需要辅助因子的反应；
5) 细胞内酶必须经过的分离程序。
16.制备固定化酶的原理：
1) 必须注意保持酶的催化活性和特异性；
2) 固定化应有利于自动化和生产的连续性；
(3）固定化酶应具有最小的空间位阻，尽可能不妨碍煤与底物的接近，以提高产物收率；
4) 酶和载体必须有很强的结合力，这样固定化的酶才能被回收，储存起来便于重复使用；
(5) 固定化酶应具有最大的稳定性，所选载体不应与废品或反应溶液发生化学反应；
(6）固定化酶成本要低，有利于工业化使用。
17.固定酶的方法：
(i) 非共价结合法：
(1）结晶法：适用于酶活性较低的酶，结晶后浓度发生变化，恒定连续使用无损失；
(2）分解法：将酶制成干粉，分散在水中的不溶相中，即使干粉悬浮在溶剂中，优点：回收较方便，缺点：干粉易吸水，颗粒变大，活性降低，影响酶在有机溶剂中的活力；
(3）物理吸附法：将酶物理吸附在不溶性载体上的方法；优点：酶活性中心不易被破坏，高级结构变化少，酶活性损失小，也适用于固定化细胞；缺点：酶与载体相互作用弱，酶易脱落；
(4）通过离子键与水溶性载体结合；优点：操作简单，条件温和，高级结构和活性中心不会被破坏，也适用于固定化细胞；缺点：载体与酶的结合力较弱，阴离子或阳离子缓冲液的离子浓度影响较大，酶更容易从载体上脱落；
(ii) 化学结合法：
(1）共价结合法：酶与载体共价结合；方法：将载体相关基因激活，然后与酶相关基因发生偶联反应，在载体上的结合力比较强，一般不会因固定底物浓度的变化而改变；缺点：反应条件比较激烈，常导致高层结构的改变，破坏活性中心，只适用于酶的固定化，不适合细胞的固定化；
(2）交联法：就采用多功能试剂或双功能试剂，使酶与酶或微生物与微生物细胞交联固定的方法，一般通过降低交联剂的浓度和反应时间来保持酶的活性；
(iii) 嵌入方法：
(1）网格型：将酶或微生物包埋在细网格状的聚合物凝胶中，这种方法是固定微生物细胞用得较多的方法；优点：不需要与酶蛋白结合反应，酶活性回收率高；
(2）微胶囊型：酶分子被封装在一个胶囊中，聚合物膜是半透膜，这种胶囊是不透水的，可以存在于某些无水有机相中。
18.固定化酶的特性：
(i) 固定后酶活性的变化：
原因何在？1) 在固定过程中，酶分子的空间构象发生变化，甚至影响到活性中心的氨基酸；
固定后，酶分子的空间自由度受到限制，这直接影响了活性中心对底物的空泡效应；
内部扩散阻力使底物分子在接近活性中心时受到阻碍；
嵌入后，酶被一层高分子半透膜包围，大分子底物无法透过膜接近酶；
固定化对酶稳定性的影响：
热稳定性增加；
2) 提高对各种有机试剂和酶试剂的稳定性；
(3) 对不同 pH 值的稳定性、蛋白酶的稳定性、储存稳定性和操作稳定性都有影响；
(4）固定化酶稳定性增强的原因：固定化酶与载体可以多点连接，防止蛋白酶分子拉伸变形；固定化后酶的活力得到缓解，释放出来；抑制酶的自我降解；
(iii) 最佳温度发生变化--升高；
(iv) 最佳 pH 值变化：扩大范围；
(v) Km 的变化（米氏常数的变化 -- 变小，亲和力增加）。
19.固定方法
1) 将辅酶和酶共同固定在同一载体上，可形成一个永久不含额外辅酶的系统；
2) 将辅酶直接固定在酶分子上。
细胞固定化：细胞被限制自由移动，即细胞受到物理、化学和其他因素的约束或限制在一定的空间界限内，但细胞仍保持催化活性，并具有反复连续使用的活力。
1.细胞固定化的优缺点：
优点1) 固定化细胞保持了细胞内酶系的原始状态和自然环境，因此更加稳定；
保持细胞内原有的多酶系统，对于多步催化优势更明显，不需要辅酶再生；
固定化增殖细胞发酵优势更明显；固定化细胞密度高，可增殖，缩短发酵生产周期；发酵稳定性好，可重复较长时间连续使用；发酵液中含生物较少，有利于产品的分离纯化，提高产品质量；
缺点1) 细胞中各种酶的存在会形成不需要的副产品；
细胞膜、细胞壁和载体的存在也会形成扩散限制；
3) 载体形成的孔隙大小会影响聚合物基底的渗透性。
2. 化学修饰：蛋白质的共价结构因加入或去除化学基因而发生改变，我们将这种现象称为化学修饰。
3.影响蛋白质官能团反应性的因素：1）微区的极性：2) 氢键效应；3) 静电效应；4) 位阻效应。
4.酶蛋白功能水平高反应性：指蛋白侧链基因与个别试剂能发生快速反应。
5.影响高反应性的因素：1）蛋白质功能的 pK 值发生变化；2）蛋白质功能基团的反应性增强；3）试剂通过静电相互作用和正确方向吸引试剂；4）试剂与靠近修饰位点的蛋白质区域之间的立体化学适应。
6.改性剂反应性的决定因素：1) 选择性吸附；2) 静电作用；3) 位阻因素；4) 催化因素：5) 微区极性（局部环境的极性）。
7.控制修饰反应的特异性：
(i) 试剂的选择：
(1) 氨基酸的修饰有几种情况：
a.修改所有氨基而不修改其他基因；
b. 通过反修饰对α-氨基进行修饰；
c.修饰具有催化活性的氨基；d.改变蛋白质的带电状态和溶解度，改变蛋白质的带电状态要选择在中性条件下能携带最大电荷的试剂，改变蛋白质的溶解度反应是在水中进行的，选择的化学试剂为水溶性的；3）定量测定反应产物；4）考虑试剂的粒度：选择的试剂粒度越小越便于修饰，不会引起蛋白质构象的大的改变；
选择反应条件：
反应条件不会导致蛋白质发生不可逆变性；
反应条件的选择有利于对蛋白质进行特定修饰；
(三）反应特异性：1）可利用蛋白质中某些基因的特异性；2）选择不同的反应 pH 值；3）利用某些产物的不稳定性；4）亲和标记；5）差异标记：在体系中存在酶分子、底物、抑制剂时；6）利用蛋白质状态的差异。
8.亲和试剂：又称位点特异性抑制剂，试剂作用于被作用位点上的基因，不与被作用位点外的其他基因发生作用，这类修饰剂称为亲和试剂。
9.亲和性标记：亲和试剂一般具有与底物相似的结构，对酶的活性位点具有高度的亲和性，可对活性位点上的氨基酸残基进行共价标记，这类化学修饰标记的特异性亲和性，也称为不可逆抑制的特异性。
10. 固定酶：在一定空间上，处于封闭状态，可发生连续作用，最后循环使用。
11. 固定化如何通过以下三种效应影响酶的稳定性：1) 形成空间障碍；2) 形成扩散限制；3) 多点共价连接。
12. 稳定方法：
(i) 固定化（化学结合、嵌入法等）：1）产生空间障碍：抑制化学失活；2）产生扩散限制：将酶嵌入多孔颗粒内部，底物先接触多孔颗粒表面，再扩散到内部与酶作用，不受底物浓度控制；3）多点共价连接：将酶多点共价连接到载体表面，或用双功能试剂将酶交联，或降低酶的浓度将酶包裹在载体中，紧密的孔隙可以使酶的构象更加稳固，从而防止酶的构象从折叠状态过度到拉伸状态。
13.核糖核酸酶：是对具有催化活性的 RNA 的描述，其化学本质是核糖核酸具有酶的催化功能，底物可以是不同的分子，也可以是同一 RNA 分子的某些部分。
天然核酸酶：（a）剪切型核酸酶（催化切割自体和异体 RNA，核酸内切酶）：1）锤头型核酸酶；2）发夹型核酸酶；3）蛋白质-RNA 复合酶；（b）剪接型核酸酶：包括Ⅰ群内含子和Ⅱ群内含子；实现 RNA 的自剪切；具有核酸内切酶和连接酶的活性。
15.体外筛选：从一个由随机排列的 RNA 或 DNA 分子构建的大容量随机分子库开始，筛选出极少量具有特定功能的分子。
16.适配体能与有机物或蛋白质等配体特异高效结合的 RNA 或 DNA 片段分别称为 RNA aptamers 或 DNA aptamers。
17.筛选适配体方案：1）化学合成一个 DNA 分子库，在分子链上的某个位置引入完全随机或部分变异的顺序，分子的两端是固定的顺序，依次进行 PCR 扩增；2）经过几轮 PCR 扩增后，体外转录形成一个随机有序的 RNA 库；3）这些 RNA 分子通过与靶分子结合的亲和层析柱，根据 RNA 与靶分子结合能力的大小将其区分开来，结合能力强的 RNA 分子最后被洗脱下来；4）洗脱下来的 RNA 分子经过反转录、PCR 扩增、转录后，在进行下一个筛选周期，经过 5 到 10 个周期后，得到富含与靶分子亲和力高的 RNA 分子的文库。
18.核酸酶筛选过程：1）通过转录随机序列的 RNA 来构建随机 DNA 文库；2）随机文库中具有催化活性的分子可以催化底物并进行共价连接；3）反应产物通过固定在底物 RNA 5'端的顺序互补配对的寡核苷酸亲和柱，选择性吸附随机文库中那些可以催化连接反应的 RNA 分子；4）经过高盐洗脱：反转录、PCR 扩增、转录，进入下一轮筛选；5）在下一轮筛选周期中，通过易错 PCR 将突变以一定频率引入活性分子中，从而提高筛选得到的随机文库的分子多选择性；6）经过几轮筛选，具有催化活性的 RNA 分子被富集，活性相对较低的分子被淘汰。
脱氧核糖核酸酶：利用体外分子进化技术合成的具有催化功能的单链 DNA 片段，具有高效的催化活性和结构识别能力。
1.体外选择法：1）人工合成DNA分子，无需转录和反转录，直接进行PCR扩增；2）获得单链DNA分子：PCR扩增将生物素与引物连接，PCR产物通过生物素蛋白的亲和柱，实现正负链的分离；3）引入二价金属离子作为辅助因子；4）在DNA中引入一些额外的功能基团，以靶向这些脱氧核糖核酸酶。
2.脱氧核糖核酸酶的分类： （裂解 RNA 的脱氧核糖核酸酶） （裂解 DNA 的脱氧核糖核酸酶） （具有激酶活性的脱氧核糖核酸酶） （具有连接酶功能的脱氧核糖核酸酶） （催化卟啉环己基金属螯合反应）
反义核酸：一种 DNA 或 RNA 分子，与 mRNA 分子结合，形成空间位点屏障，除了降解 mRNA 外，还阻止其与核糖体结合，从而翻译成蛋白质。
4. 合理设计酶分子：利用生物化学、晶体学、光谱学等各种方法研究天然酶或实际变异性，以获得酶分子特征。空间结构。结构与功能的关系以及氨基酸残基等信息，然后以此为基础进行酶的改造。
5.酶分子的非合理设计：不需要酶分子结构的准确信息，通过随机突变、基因重组、空白筛选等方法，对酶分子进行改造，定向选择所需性质的突变酶。
6.酶分子的定向进化：即酶分子的发展方向，是从一种或多种已有的亲代酶（天然的或人工获得的）出发，通过基因突变或重组，构建人工突变酶库，通过筛选，最终获得具有某种领先期望特性的进化酶。定向进化=随机突变+正向重组+选择（或筛选）。
7.易出错的 PCR：在使用 Taq 酶对目的基因进行 PCR 扩增时，通过调整反应条件，如增加 Mg2+ 浓度、添加 Mn 离子、改变体系中 dNTP 的浓度等，改变 Taq 酶的突变频率，从而以一定的频率随机向目的基因导入突变，构建突变库，再筛选或筛选出所需的突变体。
8.连续易错 PCR：利用一次 PCR 扩增得到的突变基因作为下一次 PCR 扩增的模板，连续反复地进行随机诱变，使每次后的小突变累积起来，产生重要的有意突变。
9.DNA 重组：将不同基因中获得的阳性突变结合起来，形成新的突变基因库，也称为有性 PCR。
10.DNA 重组操作：从阳性突变基因库中分离出的DNA片段被脱氧核糖核酸酶Ⅰ随机切割，得到随机片段，在不加引物的情况下经过几个PCR循环，在PCR循环过程中，随机片段互为模板和引物进行扩增，直至得到全长基因，从而导致不同基因的片段之间发生重组，亲本中的有意突变发生重组。进行重组。

11.交错延伸法：在 PCR 反应中，传统的退火和延伸合并为一步，反应时间大大缩短，因此只能合成很短的新生链。变性后的新生链作为引物与系统中同时存在的不同模板进行退火反应，然后继续延伸。这一过程不断重复，直到产生全长基因片段，从而产生含有不同模板序列的间隔新生 DNA 分子。这种新生 DNA 分子含有大量突变组合，有利于产生新的酶特性。
12.基因库：将一种生物的基因组 DNA 用限制性内切酶部分消化后，将酶切片段插入载体 DNA 分子中，所有插入载体分子中的基因组 DNA 片段集合起来就包含了这种生物的全部基因组，这也就构成了该生物的基因库。
13.文库的代表性：文库中所含的 DNA 分子能否完全反映外源基因可能发生的所有变化和改变，这是衡量文库质量的最重要指标。是衡量文库质量的最重要指标。文库代表性的指标是文库的库容量。
14.文库容量：指构建的原始突变文库中包含的独立重组克隆的数量。
15.用于构建突变文库的载体：（λ 噬菌体载体系统）（质粒载体系统）（哺乳动物细胞表达载体系统）。
16.酶模拟：又称人工酶或酶模型，是一门在分子水平上模拟酶活性位点的形状、大小、微环境等结构特征以及酶的作用机理和立体化学的应用科学。
17.酶模型的（催化基团）和（底物）必须具有相互匹配的立体化学特征，这对形成良好的反应特异性和催化效力相当重要。
18."主客体 "化学主体（酶）和客体（底物）通过配位键和其他次级键形成稳定配合物的化学领域称为 "主体-客体 "化学。
19.模拟酶的分类：（a）根据类型：1) 简单酶模型；2) 机械酶模型；3) 简单合成酶类化合物；(b) 按性质分类：1) 主体-客体酶模型；2) 胶束酶模型；3) 肽酶；4) 半合成酶：1) 主体-客体酶模型；2) 胶束酶模型；3) 肽酶；4) 半合成酶；5) 分子印迹酶；6) 抗体酶。
20.抗体酶：抗体的高选择性和酶的高效催化能力的产物，其实质是一类具有催化能力的免疫球蛋白，又称催化抗体，特异性超过酶反应特异性的催化速度，有的还能达到酶的催化速度。
21.分子印迹：制备对某种化合物具有选择性的聚合物的过程，这种化合物称为印迹分子，也称为模板分子。
22.分子印迹法的原理（分子印迹法的制备方法）：1）选择印迹分子的功能单体，使两者发生互补反应；2）在印迹分子--单体络合物周围发生聚合反应；3）通过萃取将印迹分子从聚合物中去除；4）在聚合物内形成一个保留有与印迹分子形状、大小完全相同的空腔，该聚合物可以高选择性地重新结合印迹分子。
23.表面分子印迹的类型：1) 作为载体的无机材料表面的分子印迹；2) 固体材料的表面改性；3) 蛋白质表面印迹。
24.生物印迹：分子印迹的一种，是指以天然生物材料（如蛋白质和糖类）为骨架，在其上进行分子印迹，并生成具有特定识别空穴的印迹分子的过程。
25.生物压印的原理：生物大分子构象的灵活性在无水有机相中被抵消，其构象是固定的，因此模板分子与生物大分子在水溶液中相互作用产生的构象变化只有在移入无水有机相后才能保留。
26.通过生物压印将蛋白质转化为半合成酶：1) 蛋白质部分变性，扰乱起始蛋白质的构象；2) 加入印记分子，使印记分子与部分变形的蛋白质完全结合；3) 印记分子与蛋白质相互作用后，用交联剂使印记蛋白质交联；4) 通过透析去除印记分子。

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