改造蛋白酶生产菌株
蛋白酶是催化水解蛋白质中肽键的一类酶，广泛存在于动物、植物和微生物中，是工业酶制剂中使用最多的酶制剂之一，约占酶制剂总量的60%。微生物来源的蛋白酶资源丰富、种类繁多、易于生产，成为市场上蛋白酶的主要来源。蛋白酶的商业化生产可追溯到上世纪初，1908年德国人已开始用胰蛋白酶鞣制皮革，1911年美国沃勒斯坦公司生产木瓜蛋白酶作为啤酒的澄清剂。60年代初，荷兰生产的洗涤剂中添加了蛋白酶。此外，还结合实际开展了耐热、耐酸、耐盐蛋白酶生产菌的选育，以及以石油为原料发酵生产碱性蛋白酶的研究。
蛋白酶的种类繁多，分子量大小、空间结构和功能也千差万别，但每个蛋白酶家族仍然保持着高度保守的结构域。目前，已有 100 多种蛋白酶被结晶或高度纯化，其中许多蛋白酶的一级结构和立体结构（三级结构）已被阐明。
2 蛋白酶菌株的改造
构建蛋白酶高效表达的工程菌并优化其酶学特性一直是国内外学者研究的热点，通常采用的手段有：突变育种、原生质体融合、构建基因工程菌、体外定向进化技术等。
2.1 诱变育种和原生质体融合
诱变育种主要是通过辐射诱变或一些化学试剂诱导菌体遗传物质发生突变，从而获得性状优良的突变菌株。例如，蔡万玲等对产酶菌株进行紫外诱变后，其酶活性比原菌株提高了16%。李艳丽等通过Co60定向诱变筛选出中性蛋白酶产酶曲霉ZW-06，其干凝乳酶活性高达15000U/g，比诱变前提高了74%。黄红英等结合低能N+离子注入技术对野生型地衣芽孢杆菌进行4次不同理化手段的诱变，获得一株高产菌株，其粗酶活力为12425.9 U/mL，是出发菌株的17.1倍。
原生质体融合技术是将双亲菌株的细胞去壁进行原生质体融合，从而实现基因组的交换和重组，获得稳定的重组子。例如，潘燕云等人利用原生质体融合方法，将地衣芽孢杆菌2709与含有碱性蛋白酶基因克隆载体pDW2的枯草芽孢杆菌BD105融合，得到高产菌株A16，其发酵产酶量比2709高50%-100%，在摇瓶试验中产酶量可达3万U/mL。
2.2 基因工程细菌的构建
工程菌的构建通常需要合适的表达宿主和表达载体或表达元件。首先将目的基因克隆到表达载体中，得到重组载体，然后转化到表达宿主中，经过筛选，最后得到高产菌株的过程。也可以将外源目的基因片段直接整合到宿主的基因组中，获得高产菌株。
[10月18-20日] 2024年第二届先进酶工程和酶技术应用大会
张敏等将sacB基因的启动子-信号肽序列（sacR）与枯草芽孢杆菌中性蛋白酶基因连接并克隆到载体pHP13中，构建了含有中性蛋白酶基因的诱导表达分泌载体pHP13SN，然后将其转化到枯草芽孢杆菌DB104中，与出发菌株相比，酶活力提高了48%。wangHui等从淀粉芽孢杆菌K11中克隆了中性蛋白酶Banpr，并构建了以淀粉芽孢杆菌K11为表达宿主的重组表达质粒pUB110-Banpr，在摇瓶发酵中酶活力达到8995±250 U/mL，在15 L发酵体系中达到28084±1282 U/mL，远高于工业菌株枯草芽孢杆菌AS.1398的酶活力（8000-10000 U/mL）。(8000-10000 U/mL）。
2.3 改善蛋白酶的特性
随着体外定向进化技术的发展，在不了解目标蛋白质的三维结构信息和作用机理的情况下，通过编码基因随机突变、DNAShuffling 技术和定向筛选，可以获得具有改良或新型功能的蛋白质。
酶的稳定性是商业化成功的关键因素。可以通过引入盐桥、二硫键、芳香族相互作用和增加酶对钙离子的亲和力来提高酶的稳定性，从而通过定向诱变增加分子的硬度。将蛋白酶 BPN' 的 Gly61 或 Ser98 替换为 Cys 或将两者都替换为 Cys，可在不改变催化效率的情况下提高酶的热稳定性。
将枯草杆菌蛋白酶的 Val72 替换为 Ile，Ala92 替换为 Thr，Gly131 替换为 Asp，突变酶在 10°C 下催化底物的活性比野生酶高 2 倍。2005 年，丹麦诺维信公司推出了一种可添加到洗涤剂中的低温蛋白酶 "Polarzyme"。将其加入洗涤剂后，洗涤温度从 60℃和 40℃降至 30℃和 20℃，节省了 60% 的电能，含有低温蛋白酶的洗涤剂 "carecoldwash "的销量增加了 7 倍。
3 外观
蛋白酶已广泛应用于与我们日常生活息息相关的各个领域，这种环境对蛋白酶的生产和表征提出了很高的要求。因此，深入了解蛋白酶的催化机理、空间结构与催化功能的关系，定向改造产酶菌株以满足工业化生产的要求，仍是未来酶工程的发展趋势。此外，除了选育优良菌株外，还应努力尝试构建新的表达体系或多种蛋白酶基因共表达体系，构建更多的蛋白酶表达载体，实现不同组分的有效表达，进一步提高表达量、酶活性和酶稳定性。
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