Biyo-enzim üretim süreci nedir?

1. Enzim üretimi

Enzimler mikroorganizmalardan, hayvanlardan ve bitkilerden üretilir, ancak ana kaynak mikroorganizmalardır. Mikroorganizmalar bitki ve hayvanlara göre daha fazla avantaja sahip olduğundan, fermantasyon yoluyla enzim üretmek için genellikle mükemmel enzim üreten suşlar seçilir. Fermantasyon suyundaki enzim konsantrasyonunu artırmak için mükemmel suşlar seçilir, genetiği değiştirilmiş bakteriler geliştirilir ve fermantasyon koşulları optimize edilir. Endüstriyel üretim, yüksek sıcaklığa dayanıklı α-amilaz, alkaliye dayanıklı proteaz ve lipaz gibi yeni enzimlerin özel performansına ihtiyaç duyar. Bu nedenle, yeni enzimlerin özel performansını üretmek için suşları araştırmamız ve geliştirmemiz gerekir.

2. Enzim hazırlama

Enzim ayırma ve saflaştırma teknolojisi, mevcut biyoteknoloji "işlem sonrası sürecinin" çekirdeğini oluşturmaktadır. Mikrobiyal hücrelerden ve bunların fermantasyon suyundan veya hayvan ve bitki hücrelerinden ve bunların kültür suyundan enzimlerin ayrılması ve saflaştırılmasında çeşitli ayırma ve saflaştırma tekniklerinin kullanılması, enzim preparatlarının ulusal ekonominin her alanında daha yaygın olarak kullanılmasını sağlamak için farklı saflıktaki yüksek derecede aktif enzim preparatlarından yapılmıştır, enzim preparatlarının aktivitesini, saflığını ve verimini iyileştirmelidir, yeni ayırma ve saflaştırma tekniklerini inceleme ihtiyacı.

3. Enzim ve hücre immobilizasyonu

Enzim ve hücre immobilizasyonu araştırmaları, enzim mühendisliğinin merkezi görevidir. Enzimlerin stabilitesini artırmak, enzim preparatlarını yeniden kullanmak, enzim preparatlarının uygulama aralığını genişletmek, enzimlerin immobilizasyonu için çeşitli immobilizasyon yöntemleri kullanmak, immobilize glikoz izomeraz, immobilize karbamoilaz vb. gibi immobilize enzimlerin hazırlanması, immobilize enzimlerin belirlenmesi ve immobilize enzimlerin çeşitli yönlerinin uygulanması için araştırma geliştirme. İmmobilize enzim hala güçlü bir canlılığa sahiptir. Biyokimya, kimya mühendisliği, mikrobiyoloji, polimerler ve tıp gibi çeşitli alanlar tarafından oldukça değerlidir.

İmmobilize hücreler, immobilize enzimler temelinde geliştirilmektedir. Çeşitli immobilize biyolojik hücreler yapmak için mikrobiyal hücreleri, hayvan hücrelerini ve bitki hücrelerini immobilize etmek için çeşitli immobilizasyon yöntemleri kullanılmaktadır. İmmobilize hücrelerin enzimatik özelliklerinin, özellikle kinetik özelliklerinin incelenmesi ve çeşitli uygulamalarda immobilize hücrelerin araştırılması ve geliştirilmesi, günümüzde enzim mühendisliğinde sıcak bir konudur.

İmmobilizasyon teknolojisi, enzim teknolojisinin modernizasyonunda önemli bir kilometre taşıdır ve endüstriyel uygulamalarda doğal enzimlerin eksikliklerinin üstesinden gelmek ve enzim reaksiyonunun özelliklerini tam olarak oynamak için çığır açan bir teknolojidir. İmmobilizasyon teknolojisinin gelişimi olmadan modern enzim teknolojisinin olamayacağı söylenebilir.

4. Enzim moleküler modifikasyonu

Enzim moleküler modifikasyonu olarak da bilinir. Enzimin stabilitesini iyileştirmek, antijenisiteyi azaltmak, vücuttaki tıbbi bakterilerin yarı ömrünü uzatmak için, enzim molekülünün yapısını değiştirmek için çeşitli modifikasyon yöntemleri kullanarak, doğal bir enzim oluşturmak için bazı mükemmel özelliklere sahip değildir (daha yüksek stabilite, antijenisite yok, proteaz hidrolizine direnç vb.) ve hatta enzim uygulamasının değerini artırmak ve daha büyük ekonomik ve sosyal faydalar elde etmek için enzim uygulamasını genişletmek için yeni bir enzim aktivitesi yaratır. ve sosyal faydalar.

Enzim moleküler modifikasyonu iki açıdan gerçekleştirilebilir:

(1) Enzim molekül yapısı genini değiştirmek için protein mühendisliği teknolojisini kullanarak, makul bir birincil yapıya ve uzay yapısına sahip mükemmel özelliklere ve yüksek aktiviteye sahip yeni enzimi (mutant enzim) elde etmeyi beklemek.

(2) Enzim proteinlerinin birincil yapısının kimyasal veya enzimatik modifikasyonu veya yan zincir grubunun kimyasal modifikasyonu ile enzim molekülünün kimyasal modifikasyonu. Enzimatik özellikleri değiştirmek için. Bu enzimler özellikle enzimolojideki temel araştırmalarda ve tıpta faydalıdır.

Enzim üretiminde kullanılan mikroorganizmalar filamentli mantarlar, mayalar ve bakteriler olmak üzere üç ana grupta toplanmaktadır. Bazı önemli endüstriyel enzimlerin suşları ve kullanım alanları aşağıda listelenmiştir:

Amilaz

Amilazlar nişastayı hidrolize ederek macun kıvamında malt oligosakkaritleri ve maltoz üretir. Üretimde Bacillus cinsinden Bacillus subtilis ve Bacillus licheniformis ile derin fermantasyon hakimdir ve bu sonuncusu ısıya dayanıklı enzimler üretir. Aspergillus ve Rhizopus suşları ile derin ve yarı katı fermantasyonlar da gıda işleme için kullanılmaktadır [6]. Amilazlar temel olarak şeker üretiminde, tekstil haşıl sökmede, fermantasyon hammaddelerinin işlenmesinde ve gıda işlemede kullanılır. Glukoamilaz, nişastayı glukoza hidrolize edebilir ve günümüzde neredeyse tamamen Aspergillus niger'in derin fermantasyonu ile üretilmektedir ve şeker üretiminde, alkol üretiminde ve fermantasyon hammaddelerinin işlenmesinde kullanılmaktadır.

Proteaz

Suşların kullanımı ve en çok çeşidin üretimi. Liken şekilli basil, kısa küçük basil ve basil subtilis ile bakteriyel proteazın derin fermantasyon üretimi; streptomyces, Aspergillus ile nötr proteazın derin fermantasyon üretimi ve deri tüy giderme, kürk yumuşatma, ilaç, gıda endüstrisi için kullanılan Aspergillus asidik proteaz; Trichoderma spp. ile bazı bakteriler, orijinal buzağının midesinden çıkarılan peynir mayası yerine peynir üretiminde peynir mayasının yarı katı fermantasyon üretiminde.

Glikoz izomeraz

70'li yıllarda hızla gelişen bir tür. Streptomyces hücreleri ilk olarak derin fermantasyonla elde edilir ve immobilizasyondan sonra glikoz çözeltisi, gıda endüstrisinde sakaroz yerine kullanılabilen yaklaşık 50% fruktoz içeren bir şuruba dönüştürülür. Amilaz, glukoamilaz ve glukoz izomeraz vb. ile mısır nişastasının şurup haline getirilmesi gelişmekte olan şeker endüstrilerinden biri haline gelmiştir.

İfade Sistemlerinin Seçimi
1 E. coli ifade sistemi
①pET ifade sistemi tercih edilir
② Protein rekombinant ekspresyonu ve saflaştırması, çözünürleştirilmiş etiketler kullanılarak gerçekleştirilebilir, MBP ilk tercih olarak tercih edilir.
③ BL21(DE3) ile tercih edilen pET24 veya pET28 (saflaştırma gerekiyorsa), TB ortamı 1-1,5 OD'ye kadar 37° büyüme, 3 OD'ye kadar 1 saat boyunca 18 ℃ büyüme, 10 OD'ye kadar 19 saat boyunca 0,5 mM IPTG indüksiyonu.
④ Yüksek ekspresyon ve düşük çözünürlük için kurtarma önlemleri: 15 ℃'ye kadar soğutma; ortamı 2xYT veya ZYP5052 (kendi kendine indüklenen) olarak değiştirme, ekspresyon konağını değiştirme; N-terminal ve/veya C-terminal 2-10 amino asit kalıntılarının kesilmesi; MBP gibi yüksek çözünürlüklü proteinlerle füzyon yoluyla ekspresyon; moleküler şaperonları kimyasal olarak indükleme, moleküler şaperonları/etkileşen proteinleri birlikte eksprese etme veya ligandlar sağlama.
⑤ E. coli ekspresyon sisteminin avantajları ve dezavantajları
Avantajları: en uygun, en etkili
Dezavantajları: zayıf salgılama ifade yeteneği; disülfit bağı oluşumunda zorluk; post-translasyonel modifikasyon yok

2 Maya Ekspresyon Sistemi (Picrosporum)
Avantajları: eksojen genlerin kararlı entegrasyonu; alkol oksidaz geninin promotörü güçlüdür ve ekspresyon metanol tarafından sıkı bir şekilde düzenlenebilir; rekombinant proteinler hücre içi veya hücre dışı formlarda ifade edilebilir; ökaryotik ekspresyon sistemlerinde ortak olan post-translasyonel modifikasyon fonksiyonlarını içerir; kullanımı kolay ticari ana bilgisayarlar / vektörler vardır; amplifikasyonu kolaydır ve fermantasyon yoğunluğu son derece yüksektir.
Dezavantajları: benzersiz post-translasyonel işleme biçimi; aşırı glikozilasyon sorunu.

3 İlk seçenek literatürde bildirilen ifade sistemi, ikinci seçenek E. coli sistemi ve E. coli'deki ifadenin inaktif olması durumunda maya sistemi kullanılır. İfade sistemini belirlemek için genin kaynağına göre, gen artı saflaştırmayı kolaylaştırmak için afinite etiketleri.

Enzim modifikasyonu
①Rasyonel tasarım: kodlayıcı gen değişikliği ve rekombinasyon ifade testindeki protein yapısı ve işlevi bilgilerine dayanır.
Prosedür: öncelikle BRENDA veri tabanından enzim yapısını elde edin, ardından enzim yapısını değiştirin ve Alphafold2 ile enzim yapısını tahmin edin, ardından PyMOL yazılımı ile enzim ve ligand molekülü arasında docking analizi yapın ve son olarak, yeni enzim yapısına göre, gen dizilerini yönlü olarak mutasyona uğratın ve ardından yeni bir enzim elde etmek için rekombinant olarak ifade edin (enzimin termal stabilitesini, katalitik verimliliğini ve substrat spesifikliğini iyileştirmek için).
② Akılcı olmayan tasarım: kodlama dizilerinin yüksek frekanslı mutasyonu veya rekombinasyonu ve rekombinant ifade ve yüksek verimli test

Ab initio tasarım süreci: 1. Kuvvet alanı geliştirme ve örnekleme algoritması 2. Yüksek verim testi 3. Yapı tanımlama

Proteinlerin yönlendirilmiş evrimi
①Orijinal genleri seçin
②Çeşitlilik gen mutasyon kütüphanesi oluşturmak
③ Birden fazla mutasyona uğramış geni vektörlere bağlayın ve bunları sırasıyla ilgili suşlarda ifade edin
Tarama yoluyla yüksek kaliteli bir mutant gen seçin ve ardından mutant geni büyük miktarlarda ifade edin.

Mutant gen kütüphaneleri oluşturma yöntemleri
①In vivo yüksek frekanslı rastgele mutasyon: gen replikasyon konağı olarak E. coli XL1-Red kullanımı (kusurlu DNA hasar onarım sistemi)
Plato aşamasına kadar yetiştirildiğinde, ortalama 2Kb'de 1 baz mutasyonu meydana gelir.
②Rastgele Mutajenez kiti: mutasyon oranı 0,1 -1,6% /PCR, 1-16 baz mutasyonuna/gen'e eşdeğer
③ Noktadan noktaya doygunluk mutagenezi

Doğal Evrim: Kendiliğinden Mutasyon, Rekombinasyon, Doğal Seçilim
Tarımsal evrim: spontane mutasyon, ıslah, tarama
Laboratuvar evrimi: hızlandırılmış mutasyon oranı, moleküler ıslah, tarama

DNA Karıştırma
Protein mühendisliği deneysel stratejisi
① Bir inaktivasyon sistemi ve/veya bir tarama yöntemi oluşturmak için başlangıç genini seçin.
② Yapı-fonksiyon ilişkisi biliniyorsa, önce rasyonel tasarım yöntemini benimseyin.
③Rastgele mutasyon ince ayarı ve yüksek verimli tarama
④Sadece uygun bir başlangıç geni yoksa sıfırdan tasarlayın.

Protein Araştırma Teknikleri
1 Protein ayrıştırma ve saflaştırma ile ilgili fiziksel ve kimyasal özellikler
Moleküler boyut (diyaliz, ultrafiltrasyon, jel filtrasyon, santrifüjleme)
②Moleküler şekil (gradyan santrifüjleme, elektroforez)
(iii) Yüklü özellikler (elektroforez, iyon değişim kromatografisi)
(iv) Çözünürleştirme özellikleri (tuzlama, organik çözücü çökeltisi)
⑤ Ligandlara spesifik bağlanmadaki farklılıklar (immünoafinite kromatografisi, biyoafinite kromatografisi, metal şelat afinite kromatografisi)
(vi) Adsorpsiyon özellikleri (hidrofobik kromatografi)
(vii) denatürasyon ve denatürasyon (ürenin denatürasyonu ve denatürasyonu)

2 Protein ifade sistemi
① Bakteriyel ekspresyon sistemi: kısa döngü, yüksek verimlilik, düşük maliyet, ancak post-translasyonel modifikasyon yok. Temel olarak prokaryotik proteinlerin, basit ökaryotik proteinlerin üretimi için kullanılır.
İfade vektörü seçimi: pet serisi, pGEX serisi, PQE30......
İfade suşlarının seçimi: BL21(DE3), Rosetta, M15......
İndüksiyon koşulları: IPTG konsantrasyonu, sıcaklık ve zaman süresi
Saflaştırma: Ni-NTA (His etiketi), Strep boncukları, GST.....

② Maya ekspresyon sistemi: kısa döngü, yüksek verimlilik, düşük maliyet, post-translasyonel modifikasyon mevcuttur. Uygunsuz glikozilasyon, yüksek mannoz modifikasyonu olacaktır. Temel olarak hücre içi/sekretuar proteinler, disülfit bağlayıcı proteinler, glikozile proteinler üretmek için kullanılır.

(iii) Bakteriyofaj ekspresyon sistemi: yüksek gen kapasitesi, protein çözünürlüğü, toksik proteinlerin üretimi için uygun, memelilere benzer post-translasyonel modifikasyonlar. Yetiştirme koşulları serttir ve bazı glikozilasyon modifikasyonlarından yoksundur. Temel olarak membran proteinleri, büyük boyutlu proteinler, viral aşılar, sinyal proteinleri, sitokinler, kinazların üretimi için kullanılır.
Bakulovirüs genomu 38 kb'ye kadar eksojen gen eklenmesi için büyük bir kapasiteye sahiptir.
Bakulovirüsler böcek hücrelerinde üretilir ve memeli hücrelerinde çoğalmazlar.
Avantajları: Bakulovirüsler, birincil ve kök hücreler de dahil olmak üzere memeli hücre hatlarında verimli bir şekilde transdüklenebilir.
Güvenlik (memeli hücrelerinde çoğalmaz) ve gözlemlenebilir sitopatik etkilerin olmaması
Dondurulmuş olarak saklanan önceden transdüklenmiş hücreler de test hazırlama hücreleri olarak kullanılabilir
Taşınabilirlik (farmakolojik olarak ilgili hücre tiplerinin analizi için)
Test geliştirme hızı (stabil hücre hatları oluşturmak için zaman harcamaya gerek yoktur)

④ Memeli ekspresyon sistemleri: uzun döngü süresi, düşük verimlilik, post-translasyonel modifikasyonların varlığı, yüksek protein biyoaktivitesi. Temel olarak karmaşık ökaryotik proteinler, hassas PTM gerektiren proteinler üretmek için kullanılır.
Proteinlerin geçici ifadesi: PEI veya lipozom transfeksiyon reaktifleri
Kararlı hücre hattı geliştirme: Flp-In™ Jump-In™ hücre mühendisliği platformları
İndüklenebilir İfade: Tetrasiklinle düzenlenen ifade
Viral dağıtım aracılı ifade: fonksiyonel analiz için lentiviral ifade sistemi; protein üretimi için adenoviral ifade sistemi

3 Protein Saflaştırma
Proteinleri neden saflaştırmamız gerekir?
İlgilenilen proteinlerin yapısını ve işlevini karakterize etmek.
(ii) Protein regülasyonunu ve protein etkileşimlerini incelemek
③ antikor üretmek
Saflaştırma Yöntemleri
Fiziksel/kimyasal özelliklere göre
Protein boyutu: diyaliz, ultrafiltrasyon, jel filtrasyon kromatografisi
Protein yükü: iyon değişim kromatografisi
Protein hidrofobikliği: hidrofobik etkileşim kromatografisi

Biyolojik özelliklere dayalı: afinite kromatografisi

①Diyaliz
Etkileyen faktörler: diyaliz tüpü MWCO'su; tampon hacmi; diyaliz süresi; diyaliz tamponunun değiştirilme sıklığı

Ultrafiltrasyon
Santrifüj filtrasyon, protein boyutu filtre tüpünün gözenek boyutundan daha küçüktür, tüpün dibine kadar santrifüjlenir.

③ Jel filtrasyon kromatografisi
Farklı boyutlardaki proteinleri ayırın

④ İyon değişim kromatografisi
Katyon değişim kolonu: jel negatif yüklüdür, protein pozitif yüklüdür
Anyon değişim kolonu: jel pozitif yüklüdür, protein negatif yüklüdür
Orta
İnert destek: agaroz, dekstran
Yüklü gruplar: karboksimetil: negatif yüklü, dietilamino: pozitif yüklü
Dengeleyici iyonlar: negatif yüklü gruplar: H+ veya Na+ pozitif yüklü gruplar: OH- veya Cl-
Tuz konsantrasyonunu artırarak veya pH'ı değiştirerek proteinlerin kademeli veya gradyan elüsyonu.

⑤ Afinite kromatografisi
Afinite kromatografisi, bir biyomolekül ile başka bir madde arasındaki oldukça spesifik makromoleküler bağlanma etkileşimlerine dayalı olarak biyomolekülleri bir karışımdan ayırma yöntemidir.
Örnekler şunları içerir: antikorlara antijen bağlanması, ligandlara enzim bağlanması, glutatyon ve GST füzyon proteinlerinin bağlanması, biyotin bağlayıcı moleküllere bağlanan anti-biyotin proteinleri ve polihistidin füzyon proteinlerine bağlanan metal iyonları.

Poli-(His)'e bağlı metal iyonları (Ni 2+; Co 2+; Cu 2+) kullanılarak immobilize metal şelat kromatografisi (IMAC) ₆ etiketlenmiş proteinler.

Strep etiketli proteinlerin saflaştırılması
Boncuklar strep etiketli proteinleri spesifik olarak adsorbe edebilir ve daha sonra biotin ile protein boncuklardan elüe edilebilir. (Prensip GST pull down deneyine benzer)

proteinA/protein G afinite kromatografisi
Genetik olarak tasarlanmış protein A ve protein G, memeli IgG'sinin Fc bölgesine spesifik olarak bağlanabilir. Protein A ve protein G'nin kolon materyaline bağlanmasıyla, IgG ve alt sınıfları ve fragmanları afinite kromatografisi ile saflaştırılabilir.
protein A: moleküler ağırlığı 42kDa'dır, spa geni tarafından kodlanır, her biri 3 alfa heliksten oluşan 5 izotipik immünoglobulin bağlayıcı yapısal alana sahiptir.
protein G: spg geni tarafından kodlanan 65 kDa moleküler ağırlığa sahip, antikorun Fc ve Fab segmentlerinin yanı sıra serumdaki albümini de bağlar. Genetik olarak tasarlanmış protein G, albümin için bağlanma bölgesini kaldırır ve sadece protein A'dan daha güçlü olan Fc bağlanma alanını korur. Protein A/protein G, albümini bağlayan genetik olarak tasarlanmış bir proteindir.
proteinA/protein G: genetik olarak tasarlanmış bir bağlayıcı proteindir. Tek başına protein A veya protein G'den daha geniş bir bağlanma aralığına sahip olan 4 protein A ve 2 protein G immünoglobulin bağlama alanından oluşur ve neredeyse tüm türlerden IgG'nin saflaştırılmasına uygulanabilen avantajlarını bir araya getirir.

Saflaştırılmış protein nasıl tanımlanır?
SDS-PAGE; HPLC; kütle spektrometrisi; Western blot; Bağlanma deneyleri; Fonksiyonel deneyler; Yapısal aydınlatma.

4 Elektron mikroskobu
Tek parçacıklı kriyo-elektron mikroskopisi (Tek Parçacık Analizi, SPA)
Kriyo-elektron tomografi mikroskopisi (kriyo-ET)

Şimdi Bize Ulaşın!

Fiyata ihtiyacınız varsa, lütfen aşağıdaki forma iletişim bilgilerinizi doldurun, genellikle 24 saat içinde sizinle iletişime geçeceğiz. Bana e-posta da gönderebilirsiniz info@longchangchemical.com Çalışma saatleri içinde (8:30 - 6:00 UTC+8 Pzt.~Sat.) veya hızlı yanıt almak için web sitesi canlı sohbetini kullanın.

Bileşik Glukoamilaz	9032-08-0
Pullulanase	9075-68-7
Ksilanaz	37278-89-0
Selülaz	9012-54-8
Naringinaz	9068-31-9
β-Amilaz	9000-91-3
Glikoz oksidaz	9001-37-0
Alfa-Amilaz	9000-90-2
Pektinaz	9032-75-1
Peroksidaz	9003-99-0
Lipaz	9001-62-1
Katalaz	9001-05-2
TANNASE	9025-71-2
Elastaz	39445-21-1
Urease	9002-13-5
DEXTRANASE	9025-70-1
L-Laktik dehidrojenaz	9001-60-9
Dehidrojenaz malat	9001-64-3
Kolesterol oksidaz	9028-76-6