Endüstriyel enzim araştırmalarında hesaplamalı kimya yaklaşımı nedir?
Bu makale, moleküler mekanik kuvvet alanı ve moleküler dinamik simülasyonları, kuantum mekaniği ve birleşik kuantum mekaniği/moleküler mekanik modelleme, sürekli elektrostatik modelleme ve moleküler kenetlenme dahil olmak üzere endüstriyel enzim araştırmalarında, özellikle enzim mühendisliğine rehberlik etmek için kullanılan ana hesaplamalı kimya yöntemlerini tanıtmaktadır. Bu yöntemler metinde sırasıyla iki perspektiften özetlenmektedir: birincisi, yöntemlerin temel kavramları, orijinal hesaplamaların sonuçları, uygulanabilirlik koşulları ve avantaj ve dezavantajları; ikincisi ise mutantların ve mutant kütüphanelerinin tasarımına rehberlik etmek için hesaplamalardan elde edilen değerli bilgiler.
Enzimlerin endüstriyel uygulamaları yüz yıllık bir geçmişe sahiptir ve enzim katalizi, yüksek verimliliği, yüksek özgüllüğü ve seçiciliği ve çevre dostu olması nedeniyle gıda, tarım, ilaç ve kimya endüstrisi gibi farklı endüstrilerde yaygın olarak kullanılmaktadır [1-2]. Endüstriyel uygulama ortamı, enzimlerin doğada yaşadıkları ortamdan çok farklı olduğundan, doğal enzimlerin doğası ve katalitik işlevi ile uygulama ortamları genellikle uyuşmaz veya optimal değildir. Bu durumda, enzimin performansını artırmak için enzim mühendisliği yardımıyla enzimin doğal amino asit dizisini değiştirmek gerekir [3]. En yaygın kullanılan enzim mühendisliği stratejisi, tarama için mutasyon kütüphaneleri oluşturmaktır, yani laboratuvar yönlendirmeli evrim [4]. Etkili yönlendirilmiş evrim için gerekli ön koşullardan biri, taramaya tabi tutulan mutant kütüphanesinin kütüphane kapasitesinin (yani kütüphanede bulunan mutantların sayısının) kütüphanedeki potansiyel olarak faydalı mutantların oranına göre yeterince büyük olmasıdır. Bir mutant kütüphanesinin boyutu genellikle tarama yöntemi, mevcut kaynaklar ve diğer nesnel koşullarla sınırlıdır. Temel sorun, mutant kütüphanesindeki etkili mutantların yüzdesinin nasıl artırılacağıdır. Enzim dizisi, yapısı ve önemli özellikleri arasındaki ilişkinin derinlemesine anlaşılması, mutasyon sıcak noktalarının belirlenmesine, mutasyon kapsamının sınırlandırılmasına ve kaliteli mutant kütüphane tasarımının gerçekleştirilmesine yardımcı olabilir. Hesaplamalı kimya yöntemleri, bu anlayışı kazanmanın önemli bir yoludur. Hesaplamalı tasarıma dayalı protein mutasyon kütüphanelerinin, etkili mutantların yüzdesini rastgele mutasyon kütüphanelerine göre birkaç büyüklük sırasına göre artırabildiği gösterilmiştir [5]. Bazı zor enzim mühendisliği veya protein mühendisliği konuları için, hesaplamanın getirebileceği önemli gelişme, konunun nihai başarısını veya başarısızlığını belirlemek için yeterli olabilir ve bu artık verimlilik artışı ile sınırlı değildir. Aslında, hesaplamalı kimya ve hesaplamalı biyoloji yöntemleri, doğal enzimlerin sahip olmadığı katalitik işlevlere sahip yapay enzimlerin sıfırdan tasarlanmasını başarıyla sağlamıştır. Bu albümdeki diğer incelemeler, amino asit dizilerinin otomatik optimum tasarımı için yöntemlere ayrıldığından, bu makale belirli bir amino asit dizisine sahip enzimleri simüle etmek ve analiz etmek için hesaplamalı yöntemlere odaklanacaktır. Elbette, araştırmacılar bu yöntemleri vahşi tip ve mutantları ayrı ayrı incelemek ve ardından sonuçları karşılaştırmak için kullanabilirler.
Proteinlerin, özellikle de enzimlerin incelenmesi, uzun zamandır hesaplamalı kimya araştırmalarının önemli bir sınırı olmuştur [6-8]. Ana yöntemler arasında klasik moleküler mekanik kuvvet alanlarına dayalı moleküler dinamik simülasyonları (klasik MD) yer almaktadır [9], kuantum mekaniği (QM) [10] ve birleşik kuantum mekaniği/moleküler mekanik (QM/MM) yöntemleri [8,11-12], moleküller arası kompleks tahmini, yani moleküler yerleştirme (Docking) [13], ve elektrostatik ve çözücü etkilerini ölçmek için polarize edilebilir süreklilik modeli (PCM) [ 14]. ) Poisson-Boltzmann modeli (PB) gibi [14], ve geometrik özelliklere dayalı bazı modeller. Bu makalede, bu yöntemlerin her birine iki açıdan genel bir bakış sunacağız: birincisi, temel ilkeler, orijinal hesaplama sonuçları, uygulanabilirlik koşulları ve (potansiyel) avantaj ve dezavantajlar vb. dahil olmak üzere yöntemlerin kendileri hakkındaİkincisi, bu yöntemlerin katalitik olarak ilgili mekanizmaların daha iyi anlaşılması, yönlendirilmiş evrim için yüksek kaliteli mutasyon kütüphanelerinin tasarımına veya yüksek kaliteli mutasyon kütüphanelerinin tasarımına veya mutasyon bankalarının tasarımına rehberlik edebilecek vahşi tipe göre farklı mutantların özelliklerindeki veya işlevlerindeki değişikliklerin teorik tahminleri veya açıklamaları gibi mühendislikle ilgili bilgileri elde etmek için nasıl kullanılacağı hakkında. yüksek kaliteli mutasyon kütüphanelerinin tasarımı veya ham hesaplama sonuçlarının analizine dayalı olarak belirli mutasyon bölgelerinin ve mutasyon türlerinin önerilmesi vb.
1
Klasik moleküler mekanik kuvvet alanlarına (MM) dayalı moleküler dinamik simülasyonu (MD)
1.1
Yönteme giriş
Şimdilik enzim katalizine dahil olan kimyasal değişiklikleri değil, sadece enzim konformasyonel değişiklikleri, moleküler termal hareket nedeniyle enzim ve reaktanlar (veya ürünler) arasındaki kovalent olmayan komplekslerin oluşumu ve ayrışması süreçlerini dikkate alıyoruz. Bu işlemler sırasında molekülün elektronik durumu değişmez (örneğin, kovalent bağlar kopmaz veya oluşturulmaz) ve moleküler mekanik kuvvet alanı modeli geçerlidir. Moleküler mekanik kuvvet alanı, bir moleküler sistemin potansiyel enerjisinin geometrik konfigürasyona (yani, moleküler sistemi oluşturan tüm atomların uzamsal koordinatları) bağımlılığını ifade eden ampirik bir matematiksel fonksiyondur (Şekil 1A). Başka bir deyişle, eğer X tüm atomların uzaysal koordinatlarını temsil etmek ve VMM (X ) moleküler kuvvet alanı potansiyel enerjisini temsil etmek için, molekül bir konformasyondan diğerine geçerken potansiyel enerji değişir. X1 diğerine X2:
∆VMM = VMM ( X2 ) – VMM ( X1 ).
Termodinamik teoriye göre, bir moleküldeki atomlar her zaman termal hareket halindedir, yani, X zamanla sürekli değişir; dahası, deneysel gözlemler yaptığımızda, örnek her zaman farklı konformasyonel durumlardaki farklı moleküllerle birlikte çok sayıda molekülden oluşur (tek moleküllü deneyler hariç). Bu nedenle, kinetik bir bakış açısıyla, zaman içindeki konformasyonel değişiklikleri ve termodinamik bir bakış açısıyla, farklı konformasyonlara sahip moleküllerin olasılık dağılımını dikkate almamız gerekir. Moleküler dinamik simülasyonu (MD), özelliklerin bu iki yönünü incelemek için en basit modeldir (Şekil 1B). MD simülasyonunda, bir başlangıç konformasyonundan başlarız, mevcut konformasyona ve potansiyel enerji fonksiyonuna (kuvvet, potansiyel enerji fonksiyonunun atomların koordinatlarına göre negatif türevidir) dayalı olarak her bir zaman noktasında her bir atoma etki eden kuvveti hesaplarız, bir sonraki zaman noktasındaki konformasyonu elde etmek için Newton'un hareket denklemlerini sayısal olarak entegre ederiz ve zaman içindeki konformasyon evriminin yörüngesini elde etmek için işlemi tekrarlarız.
Bu arada, çevresel faktörlerin (örn. sıcaklık, basınç, vb.) moleküler hareket üzerindeki etkisini simüle etmek için özel algoritmalar kullanılabilir. Termodinamik prensibe göre, zaman aralığı yeterince uzun olduğunda, aynı molekülün farklı zaman noktalarındaki konformasyonunun olasılık dağılımı ve termodinamik denge durumundaki farklı moleküllerin konformasyonu aynıdır (yani, zaman ortalaması sistem ortalamasına eşdeğerdir). Bu nedenle, MD simülasyonu yeterince uzun bir süre boyunca gerçekleştirilirse, simülasyondan elde edilen konformasyonlar kümesi, belirli bir termodinamik denge durumundaki moleküler konformasyonların dağılımının bir örneği olarak kullanılabilir. Bu prensibe dayanarak, MD ile elde edilen zaman yörüngelerine dayanarak termodinamik denge durumundaki bir sistemin keyfi gözlemlenebilir özelliklerini analiz edebiliriz.
MD, konformasyonel değişikliklerin kinetik değişim sürecini ve önemli mikroskobik kuantum termodinamik dağılımlarını atomik çözünürlükte kapsamlı bir şekilde analiz etmek için güçlü bir hesaplama aracı sağlar; bu, özellikle enzimler gibi karmaşık biyomakromoleküler makinelerin tasarım ilkelerini ve çalışma mekanizmalarını aydınlatmak için önemlidir. Makromoleküler yapı analizi için mevcut deneysel yöntemler yalnızca uzaysal-zamansal olarak ortalaması alınmış statik yapılar sağlayabildiğinden, MD simülasyonları ilgili araştırmalarda yeri doldurulamaz bir işleve sahiptir. Bu öncül altında, MD aracının kendisi hala sürekli iyileştirme ve geliştirme sürecindedir. Metodolojik olarak, MD'nin ana sınırlamaları iki açıdan gelir: birincisi, moleküler kuvvet alanı modelinin doğruluğu; ve ikincisi, sınırlı simülasyon süresi, konformasyonel uzayın tam örneklemesini gerçekleştirmeyi zorlaştırır. İlk sorun için, moleküler kuvvet alanı son yıllarda büyük ölçüde geliştirilmiş ve biyolojik makromoleküllerin, özellikle protein sistemlerinin konformasyonel dengesinin termodinamik tanımının doğruluğu artırılmış, kafa katlama sürecinden doğal yapıya kadar çeşitli protein moleküllerini başarıyla simüle etmiştir. [15-16]. Simülasyon süresi açısından, bilgisayar donanımı ve yazılımının gelişmesi sayesinde, geleneksel bilgisayar donanımı (örneğin, grup tarafından kullanılan çok çekirdekli sunucular) kullanılarak normal büyüklükteki sistemler (örneğin, sulu çözeltideki yüzlerce kalıntıdan oluşan enzim molekülleri) için mikrosaniye mertebesinde simülasyonlar gerçekleştirmek artık mümkündür. Bu zaman ölçeğinde, yapısal alanların veya halka bölgelerinin açılması ve kapanması gibi süreçler gözlemlenebilir. Daha fazla hesaplama kaynağı mevcutsa, substrat bağlanması/ayrılması gibi süreçlerin doğrudan simülasyonları da gerçekleştirilebilir. Simülasyonun erişemeyeceği zaman ölçeklerindeki süreçleri incelemek için (örneğin, allosterik proteinlerin büyük ölçekli fonksiyonel değişiklikleri, vb), gelişmiş örnekleme yöntemleri kullanılabilir [17], Kullanıcının MD teorisi hakkında daha derinlemesine bilgi sahibi olması şartıyla.
Şu anda, çoğu MD simülasyon uygulaması nanosaniyeden mikrosaniyeye kadar olan zaman ölçeklerini kapsamaktadır ve konformasyonel uzayın örneklenmesi çoğunlukla başlangıç yapısının çevresiyle sınırlıdır (tek alanlı proteinler için, genellikle 3-4 Å aralığında kök-ortalama-kare (RMS) yer değiştirmesinin yapısal yükselişi ve düşüşüdür). Bu nedenle, simülasyon sonuçlarının anlamlı olabilmesi için MD'ye girdi olarak makul bir başlangıç yapısının kullanılması gerekir. Çoğu durumda, deneysel olarak belirlenen kristal yapılar veya homolog proteinlerin karşılaştırmalı modellemesine dayanan yapılar MD için başlangıç yapıları olarak kullanılır. Enzim-substrat komplekslerini simüle ederken, genellikle boş enzimin veya diğer moleküllerle kompleks halindeki enzimin yapısına dayanan kompleksin başlangıç yapısını, moleküler yerleştirme kullanarak veya kristal yapıdaki diğer küçük molekülleri (örn. inhibitörler) doğrudan substratla değiştirerek modellemek gerekir. MD simülasyonları ayrıca sistemdeki tüm kimyasal birimleri tasvir eden bir moleküler kuvvet alanının oluşturulmasını gerektirir. Simüle edilecek sistem substrat olarak küçük bir molekül içerdiğinde, MD yazılım paketinde sağlanan standart moleküler kuvvet alanının substrat olarak küçük molekülü kapsamaması sıklıkla karşılaşılan bir durumdur. Bu durumda, küçük moleküller için otomatik olarak kuvvet alanları oluşturabilen araç yazılımları kullanılabilir [18-19]. Kuvvet alanı dosyaları manuel olarak kontrol edilmeli ve uzun MD simülasyonları için otomatik olarak oluşturulan kuvvet alanları kullanılmadan önce kısa simülasyon denemeleri için kullanılmalıdır.
Şekil. 1 Moleküler mekanik kuvvet alanı (A) ve moleküler di̇nami̇k si̇mülasyon (B)
Şekil 1 Moleküler mekanik kuvvet alanı (A) ve moleküler dinamik simülasyonu (B)
1.2
Enzim araştırmalarına uygulama
MD simülasyonlarından elde edilen bilgiler, enzim mühendisliği modifikasyonlarını yönlendirmek için farklı şekillerde uygulanabilir [20]. Örneğin, oda sıcaklığı ve yüksek sıcaklık MD simülasyonlarını karşılaştırarak, enzim molekülünün hangi bölgelerinin ortam sıcaklığına karşı en hassas yapısal kararlılığa sahip olabileceğini tahmin etmek mümkündür. Bu bölgelere prolin nokta mutasyonlarının, disülfit bağlarının vb. eklenmesi, enzimin ısı direncini potansiyel olarak artırabilir [21-24]. Kararlılığı artırmak için bir başka strateji de daha fazla yüzey hidrojeni ve tuz bağı oluşturan mutantlar tasarlamaktır [25-26]. Bu tür mutantları deneysel olarak doğrulamadan önce, mutasyonun istenen etkiyi sağlayıp sağlayamayacağını teorik olarak değerlendirmek için vahşi tip ve mutantlar paralel olarak simüle edilebilir [27-28]. MD, sıcaklığa ek olarak, çevresel pH, çözücüler vb. değişikliklerin protein konformasyonu ve stabilitesi üzerindeki etkisini analiz etmek için de kullanılabilir [29-30].
Stabiliteye ek olarak MD, substrat bağlanması/ürün salınımı ile ilişkili konformasyonel dinamikleri önemli ölçüde etkileme potansiyeline sahip sıcak nokta kalıntılarını tahmin etmek için uygulanmış ve substrat seçiciliğini, reaksiyon seçiciliğini, ürün salınım hızını vb. değiştirebilecek mutasyonların veya mutant kütüphanelerinin tasarlanması için bir temel sağlamıştır. [31-32]. MD ile substrat/reaksiyon seçiciliğini incelemenin yollarından biri, farklı (başlangıç yapılarına) sahip enzim-substrat komplekslerinin simülasyon sonuçlarını karşılaştırmak ve daha yüksek afiniteye (veya daha yüksek reaktiviteye) sahip substrat veya yapısal durumları tahmin etmektir. Afiniteyi (veya reaktiviteyi) hesaplamak için titiz bir nicel yöntem serbest enerji hesaplamalarıdır [33-34]. Serbest enerji hesaplamalarının hesaplama açısından yoğun doğası nedeniyle, mevcut uygulamaların çoğu tahmin için nitel yöntemler kullanmaktadır: göreceli yakınlığın nitel ayrımı, küçük molekül-makromolekül komplekslerinin yapısının kararlılığına, ortalama moleküller arası etkileşim enerjisine vb. dayanabilirken, reaktivitenin nitel ayrımı katalitik ve reaktif fonksiyonel grupların göreceli geometrik konfigürasyon dağılımlarına vb. dayanmaktadır. [35]. Bu tür nitel ayrımcılığın sonuçları, yönlendirilmiş evrimsel dizilerin kütüphanelerini tasarlamak için bir temel olarak kullanılabilir. Buna ek olarak, MD simülasyonları substrat bağlanma/ürün ayrışma gözeneği etrafındaki sıcak nokta kalıntılarını analiz etmek için de kullanılabilir [36-37]. Bu tür bir uygulama, küçük moleküllerin proteinlerden ayrışması için ayrışma yollarının simülasyonunu içerir ve yetersiz simülasyon zaman ölçekleriyle ilgili zorluklar varsa, bunlar gelişmiş örnekleme teknikleri kullanılarak aşılabilir [38-39].
2
Kuantum mekaniği (QM) ve birleşik kuantum mekaniği/moleküler mekanik (QM/MM) modelleri
2.1
Yönteme giriş
Kovalent bağ oluşturma ve kırma, elektron transferi ve farklı elektronik durumlar arasındaki sıçramalar gibi enzim katalizindeki kimyasal adımları simüle etmek için kuantum mekaniksel (QM) modeller gereklidir. Günümüzde, hesaplamalı kimyada yaygın olarak kullanılan QM modelleri ab initio ( ab initio ), yoğunluk-fonksiyonel teori (DFT) ve yarı ampirik yöntemler [40]. Bunlar arasında, yarı ampirik yöntemler hesaplama açısından en az pahalı olanlardır. Ancak, bunlar ilk prensiplere dayanmayan yöntemlerdir ve hesaplama sonuçlarının güvenilirliği büyük ölçüde belirli sistem ve probleme bağlıdır. Hem ab initio hem de DFT yöntemleri ilk-prensip yöntemleridir ve evrenseldir. Pratik DFT modelleri ab initio hesaplamalarından daha fazla ampirik teorik yaklaşımlar içerebilir, ancak DFT elektron korelasyon enerjilerini çok yüksek hesaplama verimliliği ile ele alabilir. Buna ek olarak, birçok kimyasal reaksiyon problemi için, reaksiyon süreci sırasındaki enerji değişiklikleri gibi temel parametreler için en iyi DFT modellerinin hesaplama hataları zaten yaklaşık 1 kcal/mol kadar küçüktür ve sonuçlar belirli bir katalitik mekanizmanın veya reaksiyon yolunun kimyasal sağlamlığını belirlemek için bir temel olarak kullanılmak için yeterlidir.
Bir molekülün geometrik konfigürasyonu verildiğinde, enerjisi QM kullanılarak hesaplanabilir. Bu, tek nokta hesaplaması olarak bilinir (yani, geometrik konfigürasyon uzayında yalnızca bir noktayla ilgilenir.) QM modeli daha çok moleküler geometrilerin optimizasyonu için, yani bir başlangıç konfigürasyonundan ardışık değişikliklerden sonra yerel olarak kararlı bir yapı (komşu yapılardan daha düşük enerjili) bulmak veya reaktanları ürünlere bağlayan en düşük enerjili yolları ve yollar boyunca geçiş durumlarını bulmak için kullanılır. Bu hesaplamalar, farklı geometrik konfigürasyonların dikkate alınması ve karşılaştırılması gerektiğinden ve tipik olarak onlarca ila binlerce tek nokta hesaplamasının yapılması gerektiğinden hesaplama açısından yoğundur. Hesaplama çabasından tasarruf etmek için yaygın bir strateji, önce sınırlı doğruluğa sahip verimli QM modelleri kullanarak çok çeşitli reaksiyon yolu aramalarını optimize etmek ve ardından aranan en düşük enerji konfigürasyonuna / yoluna yakın daha yüksek doğruluklu modeller kullanarak konfigürasyon optimizasyonunu tamamlamak veya tek nokta hesaplamaları yapmaktır.
Şu anda, birinci prensip QM yöntemlerinin tüm enzim molekülüne uygulanması hesaplama açısından yoğundur, temel olarak tek nokta hesaplamalarıyla sınırlıdır ve hala pratiklikten yoksundur. QM/MM modeli (Şekil 2) büyük moleküller için yaygın olarak kullanılmaktadır [11]. Bu modelde, moleküler sistem en az iki kısma ayrılır: kimyasal reaksiyona doğrudan dahil olan kısım QM modeli ile ele alınır ve geri kalanı moleküler mekanik (MM) ile ele alınır. QM-MM sınırlarını ve etkileşimlerini ele almak için birkaç farklı strateji vardır [41]. İlk prensip QM/MM modellerinde, QM hesaplamaları MM'den çok daha maliyetlidir. bu nedenle, QM bölgesinin geometrisini tahmin etmek veya simüle etmek için çoğunlukla konformasyonel optimizasyon yöntemleri kullanılır ve MM kısmını örneklemek için moleküler dinamik simülasyonları kullanılabilir [42]. Bu, hesaplama sonuçlarının sistemin QM bölgesinin başlangıç yapısına daha duyarlı olabileceği anlamına gelir. Bu durumda, güvenilir sonuçlar elde etmek için farklı başlangıç yapı modelleriyle hesaplamalar yapılması gerekir. Eğer yarı ampirik yöntemler [43] veya ampi̇ri̇k valans baği teori̇leri̇ [44-45] QM kısmı için kullanılır , daha uzun QM/MM MD örneklemesi ile konformasyonel uzayı daha tam olarak keşfetmek ve başlangıç yapısının etkisini azaltmak mümkün olabilir.
Şekil. 2 Kuantum mekaniksel (QM)/Moleküler Mekanik (MM) modeller
Şekil 2 Kuantum mekanik (QM)/moleküler mekanik (MM) modeli.
2.2
Yöntemin uygulanması
Her ikisi de QM modeli [10] ve QM/MM modeli [41] enzim katalizli reaksiyonların kimyasal mekanizmalarının teorik olarak tahmin edilmesi ve test edilmesi için yaygın olarak kullanılmaktadır. Elde edilen sonuçlar, hangi anahtar kalıntıların kimyasal reaksiyon sürecine katıldığını ayırt etmemize, reaksiyonun hız sınırlayıcı adımını bulmamıza, reaksiyon ara ürünlerinin ve geçiş durumlarının yapısını modellememize, enzim ortamıyla nasıl etkileşime girdiklerini analiz etmemize vb. yardımcı olabilir. QM küme modeli ile karşılaştırıldığında, QM/MM modeli, kimyasal reaksiyon merkezlerinin bulunduğu enzim ortamını daha gerçekçi bir şekilde simüle edebilir.QM/MM, enzim katalizinin kimyasal mekanizmasını teorik olarak tahmin etmek / test etmek ve çevresel amino asit kalıntılarının katalitik süreç üzerindeki olası etkilerini analiz etmek ve tahmin etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. [46]. Prensip olarak, bu sonuçlar katalitik aktiviteyi arttırmak ve özgüllüğü veya seçiciliği değiştirmek amacıyla yönlendirilmiş evrim mutasyon kütüphanelerinin tasarımına rehberlik etmek için kullanılabilir. Daha zorlu bir çalışma, QM veya QM/MM öngörülen geçiş durumu yapı modellerinden sıfırdan yeni aktif merkezlerin tasarımına dayanan tamamen yeni yapay enzimler elde etmek olacaktır [47].
3
Elektrostatik sürekli ortam modellemesi
3.1
Yöntemin Prensibi
Enzim katalizi neredeyse her zaman belirli bir çözelti ortamında gerçekleştirilir. Çözücü etkilerinin enzim özellikleri üzerinde çok önemli bir etkisi vardır. Kimyasal işlemlerin çözücü etkilerini hesaplamak için kullanılan modeller iki kategoriye ayrılır: her bir çözücü molekülünün ve içindeki her bir atomun modele açıkça dahil edildiği moleküler mekanik kuvvet alanları veya QM modelleri gibi açık çözücü modelleri; ve örtük çözücü veya sürekli ortam modelleri [48], burada çözücü molekülleri ve atomları modele dahil edilmez ve çözücü etkilerini ele almak için "çözücü ortalama alanları" kullanılır. çözücü moleküllerini ve atomlarını içermeyen, ancak çözücü etkilerini "çözücü ortalama alanı" olarak adlandırılan bir modelle ele alır. Açık çözücü modelinin avantajı, çözünen ve çözücüyü tamamen tutarlı bir şekilde ele alabilmesi ve çözünen-çözücü hidrojen bağı, tuz bağı vb. gibi belirli etkileşimleri gerçekçi bir şekilde modelleyebilmesidir. Dezavantajı ise çözücü moleküllerinin sayısının fazla ve hesaplama açısından yoğun olmasıdır. Ayrıca, çözücü stokastik yükselmesi sistemin toplam enerjisine önemli ölçüde katkıda bulunur ve yükselmenin etkisini ortadan kaldırmak için uzun simülasyon örnek ortalaması yapılmalıdır. Gizli çözücü modeli, çözücünün ortalama etkisini tasvir eder ve çözücünün termodinamik yükseliş ve düşüşünün ortalaması alınmıştır.
İşlemin basitliği için, genellikle polar olmayan çözücü etkisini (hidrofobik etki) gizli çözücü modelindeki polar çözücü etkisinden ayırırız. Deneyimler, polar olmayan bir çözünenin serbest çözünme enerjisinin çözücünün erişilebilir yüzey alanı (SASA) ile orantılı olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, bu bileşen için genellikle SASA solvasyon modeli kullanılır. Bu modeldeki parametreler, SASA'yı hesaplamak için gereken atomik yarıçapları, çözücü molekülünün yarıçapını (su molekülleri için 1,4 Å) ve SASA ile orantılı solvasyon serbest enerjisi için bir orantı sabitini içerir. Bu parametreler genellikle küçük moleküllerin çözünme serbest enerjisinin deneysel değerlerine uydurularak belirlenir.
Polar çözücü etkilerini dikkate almak için en yaygın kullanılan modeller, çözücü tarafından işgal edilen bölgeyi belirli bir dielektrik sabitine (su için 78,4) sahip sürekli bir ortam olarak ve çözünen bölgeyi düşük dielektrik sabitine (genellikle 2-8 değerinde) veya vakuma (dielektrik sabiti 1) sahip bir ortam tarafından işgal edilmiş olarak ele alır (Şekil 3A). Sürekli ortam, çözünen bölgedeki yük dağılımı tarafından üretilen elektrostatik alan tarafından polarize edilir ve ortaya çıkan polarize yük dağılımı da çözünen bölgede çözünen yüke etki eden bir elektrostatik alan oluşturur. Polarize yükler tarafından üretilen elektrik alanına reaksiyon alanı denir. Bu nedenle, elektrostatik sürekli ortam modeli reaksiyon alanı modeli olarak da bilinir. Çözücü bölgesinde serbest iyon bulunmayan sürekli ortam modelinde, uzay elektrostatik potansiyeli ile uzay yük dağılımı arasındaki ilişki Poisson denklemini karşılar. Serbest iyonlar içeren bir çözelti ortamı için, iyonların uzaysal dağılımı uzaysal elektrostatik potansiyelden etkilenir. Bu faktör göz önüne alındığında, uzaysal elektrostatik potansiyel ile uzaysal yük dağılımı arasındaki ilişki Poisson-Boltzmann denklemini (PB denklemi) karşılar.PB denklemi, elektrostatik potansiyel dağılımı ile üç boyutlu uzayda yük ve dielektrik dağılımı arasındaki ilişkiye ilişkin kısmi diferansiyel bir denklemdir ve sayısal olarak çözülebilir. Enzimler gibi makromoleküler sistemler için PB denklemini çözmek için en yaygın sayısal yöntem, toplu olarak FDPB modeli olarak adlandırılan sonlu fark yöntemidir (FD) (Şekil 3B) [14]. FDPB ile çözünen maddenin uzay yükü dağılımına dayalı olarak elektrostatik potansiyeli üç boyutlu olarak hesaplamak mümkündür ve bu da elektrostatik serbest enerji gibi diğer özelliklerin hesaplanmasına olanak sağlar. Küçük molekül sistemleri için QM hesaplamalarında, reaksiyon alanı genellikle moleküler yüzeydeki yüzey yükü dağılımı tarafından üretilen elektrik alanı ile eşdeğer olarak değiştirilir ve ilgili modele polarize edilebilir sürekli ortam (PCM) modeli denir.
Polar çözücü etkilerini hesaba katmak için en yaygın kullanılan model, çözücü tarafından işgal edilen bölgeyi belirli bir dielektrik sabitine (su için 78,4) sahip sürekli bir ortam olarak ele alırken, çözünen bölge düşük dielektrik sabitine (genellikle 2-8 değerinde) veya vakuma (dielektrik sabiti 1) sahip bir ortam tarafından işgal edilmiş gibi ele alınır (Şekil 3A). Sürekli ortam, çözünen bölgedeki yük dağılımı tarafından üretilen elektrostatik alan tarafından polarize edilir ve ortaya çıkan polarize yük dağılımı da çözünen bölgede çözünen yüke etki eden bir elektrostatik alan oluşturur. Polarize yükler tarafından üretilen elektrik alanına reaksiyon alanı denir. Bu nedenle, elektrostatik sürekli ortam modeli reaksiyon alanı modeli olarak da bilinir. Çözücü bölgesinde serbest iyon bulunmayan sürekli ortam modelinde, uzay elektrostatik potansiyeli ile uzay yük dağılımı arasındaki ilişki Poisson denklemini karşılar. Serbest iyonlar içeren bir çözelti ortamı için, iyonların uzaysal dağılımı uzaysal elektrostatik potansiyelden etkilenir. Bu faktör göz önüne alındığında, uzaysal elektrostatik potansiyel ile uzaysal yük dağılımı arasındaki ilişki Poisson-Boltzmann denklemini (PB denklemi) karşılar.PB denklemi, elektrostatik potansiyel dağılımı ile üç boyutlu uzayda yük ve dielektrik dağılımı arasındaki ilişkiye ilişkin kısmi diferansiyel bir denklemdir ve sayısal olarak çözülebilir. Enzimler gibi makromoleküler sistemler için PB denklemini çözmek için en yaygın sayısal yöntem, toplu olarak FDPB modeli olarak adlandırılan sonlu fark yöntemidir (FD) (Şekil 3B) [14]. FDPB ile çözünen maddenin uzay yükü dağılımına dayalı olarak elektrostatik potansiyeli üç boyutlu olarak hesaplamak mümkündür ve bu da elektrostatik serbest enerji gibi diğer özelliklerin hesaplanmasına olanak sağlar. Küçük moleküler sistemlerin QM hesaplamalarında, reaksiyon alanı genellikle molekülün yüzeyindeki yüzey yükü dağılımı tarafından üretilen elektrik alanı ile eşdeğer olarak değiştirilir ve ilgili model polarize edilebilir sürekli ortam (PCM) modeli olarak adlandırılır.
Şekil. 3 Elektrostatik süreklilik modeli (A) ve sonlu fark Poisson-Boltzmann (FDPB) yöntem (B)
Şekil 3 Elektrostatik süreklilik modeli (A) ve sonlu fark Poisson-Boltzmann (FDPB) yöntemi (B).
3.2
Yöntemin uygulanması
Süreklilik modelinin önemli uygulamalarından biri, enzim moleküllerindeki yüklü amino asit yan zincir gruplarının protonasyon durumunu incelemektir. PROPKA yazılımı, farklı protonlama durumları için elektrostatik serbest enerjiyi hesaplamak üzere PB denklemini çözerek her ayrışabilir grubun pKa değerini tahmin eder [50]. Bir enzim molekülünün yüzey elektrostatik potansiyel dağılımı, enzimin substrat seçiciliğini etkileyen önemli bir faktördür. Bir enzim molekülünün uzaysal yapısı ve protonlama durumu göz önüne alındığında, bir enzim molekülünün yüzey elektrostatik potansiyel dağılımı, amino asit kalıntılarındaki mutasyonların veya çevresel pH'daki değişikliklerin, iyonik konsantrasyondaki değişikliklerin vb. yüzey elektrostatik potansiyeli üzerindeki etkisini de tahmin eden FDPB yöntemi ile hesaplanabilir. [14].
QM küme modeli ile enzim katalizinin kimyasal adımlarını incelerken, ortamın reaksiyon bölgesi üzerindeki elektrostatik etkisini simüle etmek için genellikle PCM modelini kullanmak gerekir. Reaksiyon süreci yük dağılımında önemli değişiklikler içeriyorsa, sürekli bir ortam kullanılmadan yapılan vakum QM hesaplamalarının sonuçları makul değildir ve hatta hatalı nitel sonuçlara yol açabilir. QM/MM modelinde, reaksiyon merkezi genellikle MM tarzında ele alınan çözünebilir moleküllerle çevrilidir ve genellikle sürekli ortam reaksiyon alanını dikkate almaya gerek yoktur. Bununla birlikte, sistemin net yükü reaksiyondan önce ve sonra değişirse (örneğin, redoks potansiyeli hesaplamaları), sistem sınırının dışındaki çözelti ortamının reaksiyonun serbest enerjisine katkısının dikkate alınması gerekebilir ve bu durumda QM/MM sonuçları sürekli ortam modeli kullanılarak düzeltilebilir.
Verimlilik ve doğruluğu dengeleyen bir yöntem olarak MM/PBSA, protein-protein ve protein-küçük molekül komplekslerinin afinitesini analiz etmek için kullanılabilir [49]. Hata iptalini sağlamak için, bir konformasyon koleksiyonu elde etmek üzere komplekslerin açık çözücü moleküler dinamik simülasyonlarını gerçekleştirmek; her bir kompleks konformasyonu için sırasıyla kompleksin bütününün ve kompleksi oluşturan her bir monomerin MM/PBSA enerjisini hesaplamak; ve bütünün MM/PBSA enerjisi ile tüm konformasyon için monomerlerinki arasındaki farkın ortalamasını kullanarak bağlanma serbest enerjisini yaklaşık olarak hesaplamak gelenekseldir. Bu yöntem, substrat afinitesini etkileyen sıcak nokta kalıntılarını analiz etmek için kullanılabilir ve ayrıca mutantlardaki substrat seçiciliği değişikliklerini tahmin etmek için de kullanılabilir.
4
Diğer yöntemler
4.1
Moleküler Yerleştirme
Yerleştirme, bir monomerin yapısına dayalı olarak bir kompleksin yapısını (ve afinitesini) tahmin etmeye yönelik hesaplama sürecini ifade eder. Küçük molekül-protein kenetlenmesi, ilaçların yapı tabanlı sanal taraması için merkezi bir araçtır ve bunun için çeşitli algoritmalar geliştirilmiştir [13]. Bu algoritmalar ve modeller substrat-enzim komplekslerinin kenetlenmesine de uygulanabilir. Sanal ilaç taraması, çok sayıda farklı küçük molekülün dikkate alınmasını gerektirir ve hesaplama verimliliği nedeniyle, reseptörün (veya sadece yan zincirin) yapısal değişiklikleri genellikle moleküler kenetlenme hesaplamalarında dikkate alınmaz. Sanal taramanın aksine, substrat-enzim kenetlenme çalışmalarında genellikle sadece bir veya birkaç farklı substrat dikkate alınır ve enzimdeki yapısal değişiklikler prensipte daha tam olarak hesaba katılabilir. Bunu başarmanın en kolay yolu, MD gibi konformasyonel örnekleme yöntemleri ile substrata ayrı ayrı yerleştirilen çeşitli enzim yapıları elde etmektir. Substrat-enzim kenetlenmesinde, kenetlenme sonuçlarını taramak/değerlendirmek için substrat ve katalitik fonksiyonel grupların göreceli uzamsal düzenlemesini kullanmak da genellikle mümkündür.
4.2
Geometriye dayalı küçük molekül gözeneklerinin tahmini
Çok sayıda deneysel çalışma, aktif merkezden uzaktaki bazı mutasyonların enzimlerin katalitik performansı üzerinde büyük bir etkiye sahip olabileceğini ortaya koymuştur. Bu bölgelerden bazıları substrat bağlama/ürün salma gözeneğini değiştirerek hareket edebilir ve gözenek boyutu, gözenek etrafındaki kalıntıların fizikokimyasal özellikleri vb. substrat/ürün geçiş hızını değiştirebilir ve substrat seçiciliğini etkileyebilir. Gözenek tahmin yöntemleri, ilgili sıcak kalıntıları bulmak ve yönlendirilmiş evrim kütüphanelerinin tasarımı için bir temel sağlamak için kullanılabilir. Protein yüzey çukurlarını, iç boşlukları, farklı bölgeleri birbirine bağlayan gözenekleri vb. tahmin etmek için çeşitli geometrik yapı tabanlı yöntemler mevcuttur. [51-53]. Bu yöntemler girdi olarak statik mekânsal yapılar kullanmakta ve yüksek hesaplama verimliliği ile tahmini gerçekleştirmek için çoğunlukla geometrik ve grafik teorik yöntemler kullanmaktadır.
4.3
Aktif Merkez Karşılaştırma Yöntemleri
Şu anda, Protein 3D Yapı Veritabanında (PDB) farklı yapı türlerine ve ailelerine sahip enzimlerin büyük miktarda 3D yapı verisi birikmiştir. Farklı enzimleri karşılaştırırsak, genel yapısal dizilimleri benzer olmasa da bazılarının aktif merkezlerinde yüksek derecede benzerlik olduğunu görürüz (tipik örnekler, serin proteazlar tarafından paylaşılan katalitik triad aktif merkezleridir). Aktif merkez yapısı karşılaştırma yöntemi [54-55] olabilir mevcut enzimin aktif merkezine benzeyen diğer enzimlerin aktif merkezlerini otomatik olarak almak için kullanılabilir. Birden fazla benzer aktif merkezin üç boyutlu uzayda bir araya getirilmesi ve farklı aktif merkezler arasındaki benzerlik ve farklılıkların analiz edilmesi, mutasyon bölgesi seçimi için değerli bilgiler sağlayabilir.
5
Özet
Sunumun netliği açısından, yukarıdaki yöntemlere ilişkin tanıtımımız kategorize edilmiştir. Uygulamada, farklı yöntem türleri birbirini dışlamaz. İlgilendiğimiz soruları daha iyi yanıtlamak için birçok şekilde birlikte kullanılabilirler. Örneğin, enzim-substrat kompleksi simülasyonlarında, simülasyonun başlangıç konformasyonunu elde etmek için moleküler yerleştirme kullanılabilir; MD simülasyonlarından elde edilen konformasyon seti, gözenek tahmin analizi, moleküler yerleştirme, QM/MM simülasyonları vb. için kullanılabilir.QM veya QM/MM modellerinden elde edilen geçiş durumlarını içeren MM modelleri oluşturulabilir ve konformasyonel yükselme ve düşmenin kimyasal süreçler üzerindeki etkilerini analiz etmek için uzun süreli klasik MD simülasyonları için veya MD simülasyonlarına dayalı mutantların sanal taramasını gerçekleştirmek için çok sayıda mutantın simülasyonu için kullanılabilir; daha önce bahsettiğimiz MM/PBSA yaklaşımı, MD ve sürekli ortam modellemesinin bir kombinasyonudur, vb.
Proteinler gibi biyomolekül sistemlerinin hesaplamalı kimya yöntemleri ile incelenmesi 40 yılı aşkın bir geçmişe sahiptir. Bu yöntemler, kendilerini sürekli geliştirirken endüstriyel enzim araştırmalarında giderek daha yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. Çin'in hem hesaplamalı kimya hem de endüstriyel enzim mühendisliği alanındaki araştırma ekipleri genişlemekte ve araştırma yetenekleri hızla gelişmektedir. Hesaplamalı kimyanın enzim mühendisliğindeki uygulaması, bu iki disiplinin çapraz kombinasyonu daha da yakınlaştıkça genişleyecek ve derinleşecektir. Protein mühendisliği, yönlendirilmiş evrim ve diğer tekniklerin endüstriyel enzim araştırmaları üzerinde büyük etkisi olmuştur. Hesaplamalı yöntemlerin gelecekteki gelişiminin, özellikle de yeni enzim tasarım yöntemlerinin atılımının, sentetik biyoloji çağında endüstriyel enzim araştırmaları için yeni teknolojik atılımlar getirmesi beklenmektedir.
Şimdi Bize Ulaşın!
Fiyata ihtiyacınız varsa, lütfen aşağıdaki forma iletişim bilgilerinizi doldurun, genellikle 24 saat içinde sizinle iletişime geçeceğiz. Bana e-posta da gönderebilirsiniz info@longchangchemical.com Çalışma saatleri içinde (8:30 - 6:00 UTC+8 Pzt.~Sat.) veya hızlı yanıt almak için web sitesi canlı sohbetini kullanın.
| Bileşik Glukoamilaz | 9032-08-0 |
| Pullulanase | 9075-68-7 |
| Ksilanaz | 37278-89-0 |
| Selülaz | 9012-54-8 |
| Naringinaz | 9068-31-9 |
| β-Amilaz | 9000-91-3 |
| Glikoz oksidaz | 9001-37-0 |
| Alfa-Amilaz | 9000-90-2 |
| Pektinaz | 9032-75-1 |
| Peroksidaz | 9003-99-0 |
| Lipaz | 9001-62-1 |
| Katalaz | 9001-05-2 |
| TANNASE | 9025-71-2 |
| Elastaz | 39445-21-1 |
| Urease | 9002-13-5 |
| DEXTRANASE | 9025-70-1 |
| L-Laktik dehidrojenaz | 9001-60-9 |
| Dehidrojenaz malat | 9001-64-3 |
| Kolesterol oksidaz | 9028-76-6 |