Que tipo de macromolécula é uma enzima?
Como todos nós sabemos, os organismos vivos são compostos de células. As enzimas são os catalisadores do metabolismo no corpo humano, e somente quando as enzimas estão presentes é que as reações químicas ocorrem no corpo humano, o metabolismo no corpo pode prosseguir e cada célula pode apresentar todos os tipos de atividades vitais. Quanto mais enzimas no corpo, mais completa e mais saudável é a vida. A maioria das doenças humanas está relacionada à deficiência de enzimas ou ao distúrbio de síntese.
Na verdade, as enzimas são frequentemente encontradas em nossas vidas, como o sabão em pó enriquecido com enzimas, a creatina quinase e outros tipos de indicadores "enzimáticos" no sangue, e assim por diante, que são "enzimas" em todos os lugares. Hoje, vamos dar uma olhada nas enzimas e em suas funções.
O que é uma enzima?
As enzimas são proteínas com alta eficiência e efeitos catalíticos específicos. Quase todas as reações metabólicas no corpo exigem a participação de enzimas, e o controle do metabolismo material é realizado principalmente por meio da regulação da atividade enzimática. Agora está claro que muitas doenças humanas se devem à mutação, redução ou ausência de determinadas enzimas e, portanto, a deficiência ou mutação de enzimas pode causar distúrbios metabólicos e levar a doenças. Um catalisador apenas acelera uma reação química até um ponto de equilíbrio, mas não altera o ponto de equilíbrio.
O mesmo ocorre com as enzimas, embora sejam extremamente eficientes em comparação com os catalisadores não enzimáticos; além disso, as enzimas catalisam somente determinadas reações químicas de substâncias específicas (chamadas de efetores), produzindo determinados produtos sem subprodutos, ou seja, as enzimas têm um grau muito alto de especificidade. A capacidade catalítica de uma enzima é chamada de atividade enzimática, que pode ser medida, e a quantidade de enzima é geralmente expressa em termos de sua atividade. A medição da atividade de determinadas enzimas geralmente ajuda no diagnóstico de doenças, portanto, a enzimologia está muito próxima da etiologia, do diagnóstico e do tratamento de doenças.
A natureza das enzimas
Durante as dinastias Shang e Zhou na China, há registros das atividades de produção de enzimas em microrganismos, como fabricação de cerveja, molho e xarope. No entanto, foi somente no início do século XX que se chegou a uma conclusão sobre a natureza das enzimas; em meados do século XIX, ainda se acreditava que as enzimas tinham de funcionar em organismos vivos; o significado grego original da palavra "enzima" era "em levedura", e foi somente quando se descobriu, em 1897, que extratos de levedura sem células podiam ser fermentados que se percebeu que as enzimas ainda podiam funcionar fora da célula.
Em 1926, J.B. Sumner, um bioquímico americano, purificou a urease e a cristalizou, provando que era uma proteína, o que foi o primeiro a propor o conceito de que as enzimas são proteínas. No entanto, as autoridades acadêmicas da época, com mais objeções, não acreditam que a enzima tenha sido cristalizada, pelo contrário, acham que a cristalização da proteína não está funcionando, enquanto o papel dos poluentes está ligado à natureza desconhecida. Posteriormente, outros cientistas também purificaram e cristalizaram a pepsina, a tripsina e outras hidrolases de proteínas, e também provaram que elas são proteínas; a essência da enzima é uma proteína; essa conclusão é reconhecida pela comunidade científica.
Milhares de enzimas foram descobertas, centenas de enzimas foram purificadas e cristalizadas, bem como analisadas e determinada a estrutura química do primeiro nível da enzima, e foi comprovado que são proteínas. O conceito de que as enzimas são proteínas é tão sólido que seria inadequado chamá-las de enzimas se fossem descobertas macromoléculas com propriedades catalíticas diferentes das proteínas. Portanto, vários ácidos ribonucleicos recém-descobertos com atividade catalítica foram chamados de semelhantes a enzimas.
Especificidade da enzima
Uma das características mais marcantes de uma enzima é a especificidade (ou especificidade) da reação que ela catalisa. Isso se refere tanto à escolha dos efetores da enzima quanto à especificidade da reação que ela catalisa. O grau de especificidade varia de enzima para enzima.
Por exemplo, a urease só catalisa a hidrólise da ureia em CO2 e NH3; a succinato desidrogenase só usa o ácido succínico como efetor; sua especificidade é extremamente rigorosa, o que pode ser chamado de especificidade absoluta; mais enzimas têm um grupo comum ou seletividade de ligação química; A fosfatase, por exemplo, pode catalisar a hidrólise de muitos tipos de compostos contendo ácido fosfórico para remover o ácido fosfórico, e as esterases catalisam a hidrólise da ligação de éster de muitos compostos diferentes, a seleção do menos rigoroso. Isso pode ser chamado de especificidade relativa.
Pode-se observar que a especificidade de diferentes enzimas para a ação de substâncias varia muito, até mesmo a mesma classe de enzimas, devido a diferentes fontes, o grau de especificidade do grau estrito de inconsistência.
Importância das enzimas
O corpo humano e outros organismos passam por milhares de reações químicas diferentes. Todas as atividades, como digestão, absorção, transporte, síntese, secreção, locomoção e reprodução (comumente chamadas de metabolismo de substâncias), baseiam-se em reações químicas. A maioria dessas reações é lenta, mas as enzimas as aceleram para que as várias atividades das quais a vida depende possam ser realizadas em tempo hábil. A grande maioria dessas reações ocorre na célula; cada reação é catalisada por uma enzima diferente; a célula contém milhares de enzimas, segregadas em várias organelas, que catalisam metodicamente as reações críticas para a vida.
Tomemos como exemplo o amido que comemos todos os dias, o amido é digerido no trato digestivo e hidrolisado em glicose pela amilase e outras enzimas catalíticas, enquanto a glicose entra na célula, que também é catalisada por enzimas, e os vários metabolismos da glicose na célula são ainda mais uma série de reações catalisadas por enzimas, que oxidam a glicose em dióxido de carbono e água e fornecem energia, e também podem ser convertidos em outras substâncias, como a gordura. Em comparação com a oxidação da glicose no corpo e sua combustão fora do corpo, embora os produtos sejam o dióxido de carbono e a água, e ambos liberem energia, a oxidação da glicose no corpo é catalisada por enzimas e é realizada em condições amenas, como a temperatura ambiente, e passa por várias etapas e libera gradualmente energia que pode ser facilmente utilizada, o que é extremamente diferente da combustão fora do corpo.
I. No setor de fermentação de alimentos
A fabricação de molho de soja envolve o uso de proteases secretadas pelo Aspergillus oryzae para quebrar as proteínas das matérias-primas e degradá-las em peptídeos, aminoácidos etc., de modo a produzir molho de soja com cor, aroma e sabor. Por exemplo, a protease ácida usada na produção de molho de soja pode compensar a falta de enzima na groselha, promover a decomposição da proteína nas matérias-primas do molho de soja e do vinagre, fortalecer o processo de produção e facilitar a produção em larga escala. Além disso, a hidrólise da protease pode aumentar o teor de nitrogênio aminado na bebida alcoólica do molho de soja, promovendo assim o processo de fermentação e a formação de substâncias aromáticas e de sabor. Ao mesmo tempo, ela também ajuda a melhorar a taxa de utilização de matérias-primas, economizar alimentos, reduzir custos e contribuir para a melhoria da produção e a estabilidade da qualidade do produto.
II. Na fabricação de cerveja
Quando a quantidade de malte é reduzida e os materiais auxiliares são aumentados, a protease suplementar é frequentemente necessária para degradar totalmente as proteínas, e a protease ácida microbiana também é um clarificador de cerveja eficaz.
III. Na produção de curtume
A proteína fibrosa da pele da matéria-prima do curtimento é um componente útil do couro, mas também existem muitas proteínas não fibrosas na lacuna da fibra e na epiderme; o conteúdo dessas proteínas é pequeno; se não forem removidas, o couro acabado se tornará rígido e quebradiço. Portanto, temos que contar com a protease, que é usada no processamento do couro para decompor as proteínas intersticiais; a produção doméstica de preparação de protease neutra e alcalina pode ser usada para a depilação enzimática.
Quatro. Usado na fabricação de gelatina e fibra de colágeno solúvel:
Indústria com pele lixiviada com água de cal, osso e outras matérias-primas no óleo e graxa e proteínas diversas, etc., esse processo consome tempo até vários meses, trabalho intensivo, baixa taxa de gelatina e consumo de energia, com purificação de colágeno por protease, pureza de gelatina, qualidade, uniformidade de massa molecular relativa, arranjo molecular do todo, o ciclo de produção é curto, o rendimento de gelatina é alto.
V. Usado para pré-tratamento de tingimento de lã em baixa temperatura:
A lã com tingimento em alta temperatura danificará a resistência da lã e causará facilmente a contração da feltragem da fibra e a ereção do corpo do cabelo. Com o tratamento de protease da lã, o tingimento no ponto de ebulição, a taxa de cor de 2 minutos chega a quase 100%, a cor e o brilho do produto acabado são brilhantes, a sensação é de volume e o teor de água residual no combustível é bastante reduzido.
Para degomagem de seda:
Os tecidos de seda crua devem ser degomados; a cola de seda é uma proteína; nosso país tem usado tradicionalmente o método de sabão alcalino de refino de alta temperatura para degomagem, com muitas deficiências, invasão alcalina do pigmento de seda, fácil de afetar o brilho; com a degomagem de protease, o produto acabado é lubrificado e macio ao toque, brilhante e luminoso, e o tempo de degomagem é curto, a temperatura de operação é baixa e a produtividade é aumentada.
A engenharia genética de enzimas e a biocatálise industrial de engenharia de proteínas na década de 1990, o surgimento da evolução dirigida por proteínas, o desenvolvimento da tecnologia genômica e proteômica. O núcleo da biocatálise industrial é a aplicação de enzimas. Em comparação com a catálise química tradicional, a biocatálise tem as vantagens da especificidade do local e da estereoespecificidade, o que permite que as pessoas realizem a "re-evolução" de acordo com os desejos humanos sem a necessidade de entender a estrutura da enzima, e pode ser usada para clonagem de genes, mutação ou hibridização aleatória, mutação direcionada e construção de bibliotecas de mutação por métodos de PCR propensos a erros. As bibliotecas de mutação podem ser construídas por clonagem, mutação ou hibridização aleatória, mutação direcionada e PCR com tendência a erros, que podem ser combinadas com estratégias de triagem de alto rendimento para melhorar a atividade da enzima, a estabilidade, a estereosseletividade e as propriedades de reação não aquosa.
A xilanase é uma enzima essencial para a degradação da hemicelulose e, na China, usamos o gene de Streptomyces olivaceus para transferi-lo para a levedura Pichia piscine Pichiapastoris a fim de obter uma expressão eficiente. A atividade enzimática foi de 1.200 U/mL e a atividade específica foi de 2.869 U/mg. Ela tem uma resistência muito boa à degradação da protease [3]. Os quatro genes do fungo acidófilo Biospora sp. MEY-1 foram clonados com sucesso em Saccharomyces cerevisiae para expressão heteróloga, e a atividade específica da enzima XYL11 da levedura recombinante foi de 1,8831 U/mg, e a enzima reteve mais de 87% de sua viabilidade a 90 ℃ por 10 minutos. A degradação da xilana da aveia produz principalmente xilose e dissacarídeo de xilana, que tem boa resistência à degradação da protease [8]. O gene produtor de xilana da groselha preta IME-216 foi clonado e expresso em Saccharomyces cerevisiae, e o vigor foi aumentado para 90.000 U/mL [8], e o restante dos mais de 30 genes de xilanase foram expressos em Escherichia coli e outros trabalhos não serão mencionados em detalhes.
As enzimas para rações se tornaram o setor de enzimas de crescimento mais rápido e mais forte no setor de enzimas industriais do mundo. A fitase é um aditivo alimentar para a degradação do ácido fítico em fosfato inorgânico e inositol na ração. O Institute of Feed Research, da Academia Chinesa de Ciências Agrícolas, recombinou o gene da fitase do Aspergillus niger963 em Saccharomyces cerevisiae para obter uma expressão altamente eficiente, e a atividade enzimática atingiu 8×105IU/mL, que foi mais de 3.000 vezes maior do que a do Aspergillus niger original, e foi muito maior do que a dos fungos projetados relatados no exterior [4, 11]. 11], e várias empresas de produção foram estabelecidas na China.
A celulase é um sistema enzimático complexo de múltiplas enzimas, o design irracional é o método atual de evolução dirigida da celulase, a exonuclease de celulose de Aspergillus xylosus e a endonuclease de celulose têm sido utilizadas em fagos para demonstrar a função. No momento, vários genes para celulase alcalina média foram clonados e expressos, que podem ser usados em têxteis e detergentes, e o cultivo otimizado de bactérias de engenharia de endocelulase neutra para uso no setor de papel, com atividade enzimática de até 32.529 U/mL [10], que aumentou 7,8 vezes em relação à cepa original. O gene da celulase multifuncional de Fusarium ampullaia crossean foi expresso em E. coli, e uma linha de celulase de alta atividade específica foi obtida, com boa atividade hidrolítica contra xilana, glicosídeos de dissacarídeos de fibra de p-nitrofenol e carboximetilcelulose [5]. A clonagem do gene Swollenin S38 do Mycobacterium anthropophilum pode estar rompendo as ligações de hidrogênio, que é um componente do sistema de celulase de degradação fúngica [6]. Além disso, pesquisas sobre o sistema enzimático de degradação de lignocelulose do cupim gigante de asa amarela foram realizadas na China
A lipase é uma importante classe de enzimas na biossíntese. Atualmente, a China estabeleceu uma plataforma técnica para a modificação, produção e aplicação de três genes de lipase amadurecidos por meio de projeto racional. A atividade enzimática do Penicillium expansum FS8486 foi aumentada em 317% usando a tecnologia de reorganização de genes [7]. A estrutura de "tampa" da lipase para a mutação direcionada, para obter a lipase de tampa aberta, a atividade específica da enzima aumentou em 5,7 vezes, a eficiência catalítica de duas fases aumentou em 1,8 vezes [8].
A China também construiu as bactérias de engenharia de exibição de superfície, bactérias de engenharia de E. coli, bactérias de engenharia de Picrosporum, plataforma de tecnologia de cultura de alta densidade, atividade de lipase de Pseudohyphae Candida sp. 99-125 alcançou mais de 15.000 U/mL [9]. A lipase clonada de Rhizopus miehei foi expressa com sucesso em duas leveduras Pichia, e a maior atividade enzimática atingiu 18.000 U/mL. A atividade da enzima não diminuiu a 4 ℃ por 6 meses, e o rendimento do biodiesel foi superior a 95% em 12 h [9]. O gene da lipase de Rhizopuschinensis foi clonado com sucesso em Picrosylla, e as duas proteínas chaperonas co-expressas puderam aumentar a atividade da enzima em 30%, e a atividade da enzima atingiu 16.200 U/mL [10-11]. Ao mesmo tempo, também foi realizado o estudo da lipase ligada à célula com boa tolerância a solventes orgânicos e estabilidade térmica.
A amilase é uma enzima industrial muito importante, responsável por 25% do mercado de enzimas. Atualmente, o setor é principalmente de enzimas de alta temperatura, archaea anaeróbica termofílica Thermococcus gênero Thermococcus de boca líquida de águas profundas produziu enzima extracelular de alta temperatura resistente ao calor, a temperatura ideal de 95 ℃, 100 ℃ ainda tem 60% da viabilidade do gene da enzima foi clonada por PCR e foi expressa em E. coli [7]. Duas cepas de bactérias Geobacillus produtoras de amido resistentes ao calor também foram isoladas de Tengchong, Yunnan, e a viabilidade específica foi de 1.320 e 890 U/mg após a purificação [7]. O gene de Bacillus alcalophilus foi clonado por PCR, no qual Bacillus subtilis foi expresso heterologicamente com uma atividade de 450 U/mL [9]. A α-amilase ácida mesofílica, que economiza e reduz o consumo de energia para o processamento de amido, o gene da α-amilase de Bacillus sp. tem homologia 98% com o gene da α-amilase de B. amyliquefaciens [7].
A mananase pertence à hemicelulase e é adequada para a preparação de oligossacarídeos de manana. A empresa de preparação de enzimas Richeng, da cidade de Zhaodong, com a atividade de expressão de β-mananase ácida de bactérias de engenharia de Aspergillus niger de 20.000 U/mL, para o nível atual de cepas de produção de 25 vezes, na posição de liderança de bactérias de engenharia genética de fungos [10]. O mutante de A. tabescens MAN 47 β-mananase com alta temperatura e resistência a ácidos foi obtido por mutação direcionada de embaralhamento de DNA, e a atividade enzimática em alta temperatura de 80 ℃ e pH 4,0 foi 10 vezes maior que a do tipo selvagem. A introdução direcionada de locais de N-glicosilação permitiu a expressão do tipo selvagem e do mutante em A. tabescens, e a estabilidade térmica, a estabilidade ácida e a resistência à protease foram aprimoradas. Três mutantes com atividade de mananase de 3 a 5 vezes maior do que o tipo selvagem também foram obtidos [10-11]. Uma β-1,4-mananase estável ao calor foi clonada de Thermoanaerobacter thermophilus, que teve a maior atividade a 80 ℃ em poços de petróleo de alta temperatura e baixa permeabilidade e contra goma hidroxiguar. A meia-vida dessa enzima é de 46 h [10].
A lacase é uma polifenol oxidase contendo cobre, enzima ligninolítica, que também pode catalisar a síntese de fenóis, aminas aromáticas e oligômeros. A atividade de expressão do gene da lacase clonado de Tanya ruderalis em Saccharomyces cerevisiae foi de 9,03 U/mL, três vezes maior do que a da cepa original [5]. A lacase de Panus rudis de gramínea selvagem foi transformada em levedura Picros para secreção e expressão, e a atividade específica da enzima foi de 16,17 U/mg, que foi 4,4 vezes aumentada por mutação direcionada e mutação aleatória [7]. A nova lacase bacteriana marinha foi submetida à mutagênese direcionada de aminoácidos, e a meia-vida do mutante foi estendida em 3 vezes, e a proteína solúvel foi aumentada em 244% em comparação com a anterior à otimização. O rendimento da fermentação foi 7,9 vezes maior do que o do tipo selvagem [10]. A atividade enzimática da lacase de uma cepa de fungo tropical de podridão branca atingiu 11.400 U/L (método guaiacol) [7].
A pululanase, também conhecida como thaumatin polysaccharidase, é uma enzima de desestruturação que quebra as ligações α-1,6-glicosídicas. Thermococcus sp. HJ21 produz Pullulanase extracelular de alta temperatura com uma temperatura ideal de 95 ℃, e a atividade da enzima ainda é superior a 50% a 100 ℃ por 2 h [7]. O gene para essa enzima foi clonado por PCR. O Anoxy bacillus sp. p28 foi clonado na sequência do gene da purulanase e o plasmídeo recombinante foi construído. Transformado em E. coli, o produto foi uma única maltotriose, uma Pullulanase tipo I. O gene da purulanase do Bacillus sp. anaeróbico resistente ao calor isolado da fonte termal de Tengchong foi introduzido no Bacillus subtilis e expresso. 60 ℃ e 48 h ainda mantiveram mais de 50% de viabilidade, e a atividade da enzima extracelular foi de 42 U/mL, o que representou um aumento de 40 vezes na viabilidade da expressão [10]. Por meio da tecnologia de recombinação e nocaute gênico, a Nanjing Bestjie Bioengineering Company modificou o gene da Pullulanase do Bacillus selvagem e criou uma enzima composta com glucoamilase, que pode preparar glicose com valor DE acima de 96,5, e o nome comercial é série High DEX, que pode satisfazer a produção de glicose e atingir o nível internacional [10].
A penicilina acilase é a principal enzima do setor de antibióticos β-lactâmicos. A China entrou com sucesso na indústria de antibióticos de síntese de enzimas, penicilina acilase por mutagênese para obter uma viabilidade de cepa mutante de 820 U/mL [2]. A clonagem do gene da penicilina acilase de Bacillus megaterium foi expressa em Bacillus subtilis com uma viabilidade de 30 U/mL [4]. A penicilina acilase foi secretada e expressa em Bacillus subtilis a 864 U/L, o que foi 144 vezes maior do que o rendimento do produtor do tipo Bacillus selvagem A. faecalis [5]. A penicilina acilase de B. faecalis foi secretada e expressa em E. coli, e a atividade enzimática da cultura aprimorada da bactéria projetada foi superior a 2.000 U/L. A acilase do ácido 7-amino cefalosporânico (GL-7-ACA acilase) pode transformar a cefalosporina C e foi expressa em E. coli, com a maior atividade enzimática de até 266 U/L [5], e a penicilina acilase de Bacillus megaterium imobilizada no vetor Eupergitc produziu 30 lotes de transformações sucessivas. A enzima foi imobilizada com o vetor Eupergitc e produzida em 30 lotes consecutivos sem diminuição da atividade [6].
A D-aminoácido oxidase pode catalisar a produção de D-aminoácidos para produzir os cetoácidos e a amônia correspondentes; essa enzima e a acilase do ácido 7-aminocefalosporânico (7-ACA acilase) produzem em duas etapas a importante matéria-prima das cefalosporinas, o ácido 7-aminocefalosporânico (7-ACA). Um Picrosporum spp. recombinante altamente expresso foi construído usando a D-aminoácido oxidase expressa por levedura metanólica, e a viabilidade da fermentação atingiu 8.000-1.000 U/L em tanques de 14 L [5]. A D-aminoácido oxidase expressa por fusão de levedura Picot com uma viabilidade de 1.700 U/L foi construída [5], e dois tipos de GL-7-ACA acilases recombinantes também foram construídos, com cepas constitutivas de até 1.500 U/L e cepas induzíveis de até 900 U/L, e a taxa de conversão das enzimas imobilizadas atingiu 97% [5]. O gene da D-aminoácido oxidase de Saccharomyces cerevisiae foi transferido para E. coli com um vigor de expressão de 23,3 U/mL [5] .
A D-aminoácido oxidase foi imobilizada e transformada na resina epóxi Amberzyme por 14 lotes sem diminuição da viabilidade [6]. A P-hidroxifenilglicina é um intermediário importante na semissíntese de antibióticos β-lactâmicos, que pode ser preparado por meio da preparação catalítica em duas etapas da Amberzyme e da D-carbamoil hidrolase, e a solubilidade foi aumentada em 6 vezes em E. coli por mutação aleatória da D-carbamoil hidrolase[6], e a expressão recombinante de E. coli com baixa solubilidade da D-carbamoil hidrolase, e a co-expressão de chaperonas moleculares aumentou a solubilidade da expressão em cerca de 3 vezes[7].
A redução assimétrica da carbonil redutase de compostos carbonílicos é amplamente usada para a preparação de álcoois quirais. O etil (S)-4-cloro-3-hidroxibutirato foi preparado pela carbonil redutase de Streptomyces azureus. Sua bactéria recombinante, E. coli BL21, preparou etil (S)-4-cloro-3-4-fenilbutirato e metil (S)-o-cloromandelato com conversão e valores de ee de mais de 99% Os valores de ee enantiomérico e os rendimentos dos produtos de expressão homóloga do gene da carbonil redutase de levedura de padeiro foram aumentados. Uma nova carbonilredutase do tipo (S) foi clonada do genoma de pseudo-hifas quase lisas, e a bactéria recombinante E. coliBL 21 conseguiu preparar (S)-fenilglicol com uma pureza óptica de 99,1% e um rendimento de 89,6% [8,11].
A β-glucosidase é um componente importante do sistema de celulase, que pode hidrolisar a celobiose e a celobiose solúvel em glicose e ligantes correspondentes, hidrolisar ligações β-glicosídicas e sintetizar novos derivados de açúcar. A β-glucosidase de Aspergillus suisse, por meio de nocaute gênico e mutação de aminoácidos, a atividade enzimática do mutante foi 143 vezes maior do que a do tipo selvagem [9]. O gene da β-glicosidase de Sphingobacterium neoformans foi expresso com sucesso em E. coli, que pode converter glicosídeos de isoflavona para produzir os glicosídeos correspondentes [10]. A expressão heteróloga da β-glucosidase no trato intestinal do cupim de leite de Taiwan E. coli usando um sistema de expressão procariótica resultou em um aumento de 2,6 vezes na atividade da enzima mutante em comparação com a enzima do tipo selvagem. Ela também melhorou a tolerância à glicose e a estabilidade térmica [10]. A β-glicosidase de Penicillium obliquum foi geneticamente modificada, e três cepas de expressão foram obtidas por transformação, e a atividade da enzima foi aumentada em 3,4 a 3,7 vezes em comparação com a da cepa original [10], e o gene da β-glicosidase resistente ao calor foi isolado de uma bactéria priônica não descompetente e clonado em E. coli, e a atividade da enzima foi aumentada em 17 vezes [4]. Uma β-glicosidase tolerante à glicose foi selecionada de um macrogenoma marinho e clonada em E. coli para expressão eficiente, e concentrações de glicose abaixo de 400 mmol/L promoveram a enzima, e até 1.000 mmol/L de concentração de glicose, a atividade da enzima foi 50% [8,11]. A reorganização do DNA e a mutagênese direcionada foram usadas para melhorar a estabilidade da β-glucosidase, e a meia-vida de inativação por calor a 61 ℃ dos quatro mutantes foi aumentada em 14,16, 68 e 44 vezes em comparação com o tipo selvagem. A resistência ao calor foi significativamente melhorada [8].
A galactosidase, também conhecida como lactase, decompõe a lactose em glicose e grupos galactosil e pode sintetizar oligossacarídeos. A β-galactosidase, uma enzima transglicosilante eficiente, foi obtida da lama do fundo do mar pelo método macrogenômico, foi solubilizada e expressa em E. coli, tolerou solventes orgânicos e sintetizou oligo-galactose em rendimentos de até 51,6% [9]. A α-galactosidase de Aspergillus é solidamente fermentada com uma atividade enzimática de 305 UI/g [6]. A β-galactosidase de Sulfolobus solfataricus P2 foi modificada molecularmente para construir um mutante, e a enzima mutante, F441Y, produziu oligogalactose com um rendimento de 61%, que foi cerca de 10% maior do que o tipo selvagem [9].
A nitrila hidratase tem aplicações importantes na síntese de amidas, ácidos carboxílicos e seus derivados, catalisando a produção de acrilamida a partir da acrilonitrila, com uma viabilidade de fermentação de até 6.000 unidades internacionais em Nocardia sp. YS-2002, que é expressa em E. coli e Picrosporum [5].
A inulinase é uma enzima hidrolítica que hidrolisa a ligação β-2,1-D-frutofrutose-frutosídeo da inulina para produzir oligofrutose, e é dividida em dois tipos: endonuclease e exonuclease. O gene da endonuclease de inulina de Aspergillus niger foi clonado na levedura Bichiria para obter uma expressão eficiente, e a atividade da enzima recombinante chegou a 128 U/mL, atingindo o nível internacional [9].
A alginato sintase, alginato amplamente utilizado na área de alimentos, medicina e indústria leve, pode ser usada para produzir alginato a partir da maltose pelo método de enzima única, por meio do projeto racional de moléculas de enzima e da tecnologia de embaralhamento de DNA de duas cepas GRAS e duas bactérias termofílicas clonadas para os genes da alginato sintase e realizada com sucesso a expressão de alta eficiência, e foi realizada na produção industrial [5].
A protease neutra é amplamente utilizada na produção industrial, o plasmídeo recombinante do gene Npr do Bacillus subtilis AS1398 foi transferido para o B. subtilisAS 1398 para obter uma bactéria recombinante com várias cópias, e a estabilidade do plasmídeo da bactéria recombinante foi mantida em 100% por 30 gerações consecutivas, e o nível de expressão da protease foi aumentado em mais de uma vez, atingindo 24.000-28.000 U/mL [10]. A cepa de B. subtilis com virulência nematicida eficiente foi otimizada para cultura a fim de obter uma atividade de protease de até 12.379 U/mL, que foi 5 vezes maior do que antes da otimização, e o sistema de expressão de B. subtilis WB600 foi aplicado para construir uma biblioteca de mutação aleatória a fim de obter um mutante estável ao calor, que foi usado como base para o biocida [8]. A metaloproteinase de matriz humana está intimamente relacionada à metástase tumoral, e a enzima foi clonada e expressa com sucesso em E. coli, o que estabelece a base para o estudo do mecanismo da enzima e da metástase tumoral e a busca por inibidores específicos da enzima [5].
A glucanase é uma hidrolase, dividida em endonuclease e exonuclease, que é usada na produção de cerveja e na adição de ração. O gene da β-1,3-1,4-glucanase de Penicillium thermophilum foi clonado em um vetor de expressão procariótica e transfectado para a expressão induzida de E. coli BL 21 com uma atividade enzimática de 240 U/mL [8], e o gene da endonuclease β-1,3-glucanase de Streptomyces sp. S27 foi expresso com eficiência em E. coli, que hidrolisa polissacarídeos de kombucha, etc., e pode inibir fungos patogênicos e produtores de toxinas [8]. O gene da endoglucanase de Aspergillus longum foi introduzido em Picrosporum para ser expresso, e a atividade enzimática da bactéria recombinante III atingiu 110 U/mL, que foi otimizada para aumentar em 50% [8]. Mutação pontual extremamente resistente ao calor Thermotogamaritima endoglucanase Cell-12B, a temperatura ideal da enzima de 95 ℃, 90 ℃ ainda manteve 70% vivo.
O ácido N-acetilneuramínico é um dos ácidos salivares mais importantes nos organismos vivos, e a cadeia de açúcar do ácido salivar está envolvida em muitos processos vitais. O ácido CMP-salivar promove a regeneração das células neuronais, e a modificação da base do gene da sintetase do ácido CMP-salivar resultou em uma expressão altamente eficiente em E. coli, com a expressão da enzima representando 26,5% da proteína total e a atividade enzimática de 100 U/L, que foi 850 vezes maior do que a da cepa inicial [4]. A enzima de desintoxicação de aflatoxina é uma oxigenase, e o gene foi construído por tecnologia recombinante para ser expresso em fermentação de alta densidade em Saccharomyces cerevisiae, e a enzima foi responsável por 56% da proteína total, e a quantidade de expressão atingiu 814,5 mg/L [6]. O plasmídeo recombinante do gene de mutação da enzima foi introduzido em E. coli para amplificar e transferir para Saccharomyces cerevisiae, e uma biblioteca de mutações foi estabelecida, e a atividade enzimática do mutante A1773 foi aumentada em 5 vezes. O mutante A1242 apresentou um aumento de 3,5 vezes na resistência a altas temperaturas. O mutante DS1474, com uma atividade enzimática específica de 56 U/mg, e o mutante DS896, com uma atividade enzimática específica de 44 U/mg [9], foram aprovados como produtos enzimáticos para desintoxicação em rações.
A infecção pelo fungo Aspergillus fumigatus é um problema difícil para a saúde humana, o estudo sistemático do genoma do Aspergillus fumigatus, mais de 50 genes relacionados à via de glicosilação foram clonados do Aspergillus fumigatus, quitinase, fosfomanano isomerase, O-manosiltransferase, α-1,4-N-acetilglucosaminiltransferase, α-glucosidase I e genes CMP-salivaril sintetase, o mecanismo de glicosilação fúngica para entender, desenvolver drogas geneticamente modificadas e infecções antifúngicas [6].
A L-asparaginase tem um efeito terapêutico claro sobre a leucemia, por meio da tecnologia de recombinação de DNA, o fragmento de anticorpo de cadeia única específico da L-asparaginase e a enzima para construir uma proteína de fusão para melhorar a estabilidade da enzima in vivo, a atividade da enzima de engenharia recombinante E. coli AS 1357 aumentou até 228 U/mL, o que é comparável à bactéria selvagem mais de 50 vezes. O gene da esterase foi transferido para a E. coli pelo método macrogenômico, e a bactéria de engenharia construída melhorou o vigor, com a quantidade de expressão de 200 mg/L, o vigor da enzima de até 180 U/mg, e a estabilidade térmica a 60 ℃ foi melhorada em 144 e 196 vezes em comparação com a do tipo selvagem, e foi obtida uma nova esterase mutante degradadora de pesticidas poliéster que poderia degradar clorpirifós, deltametrina, deltametrina e flucitrinas [9].
A pectinase alcalina foi produzida por fermentação de levedura Picher recombinante, e a maior produção de enzima foi de 1.315 U/mL em um fermentador de 1 t [8]. A atividade de pectinase da cultura de Aspergillus niger EIM-6 foi otimizada para 30.231 U/mL [8,11]. O gene da Pseudomonas salicilato hidroxilase clonado em E. coli expressou duas enzimas degradadoras de naftaleno que degradam o ácido salicílico, o ácido acetilsalicílico, o ácido sulfossalicílico, o salicilaldeído, o m-nitrobenzaldeído, o ácido 5-clorossalicílico, o octanal e o o-nitrobenzaldeído [5].
Os ésteres de organofosforados são uma classe de compostos altamente tóxicos usados como inseticidas, herbicidas ou agentes nervosos. A hidrolase de éster de organofosfato de Pseudomonas aeruginosa foi clonada e expressa de forma recombinante em E. coli por mutação de aminoácidos, o que aumentou a capacidade de hidrólise de ésteres de organofosfato em cerca de 7.000 vezes [10].
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| Composto Glucoamilase | 9032-08-0 |
| Pullulanase | 9075-68-7 |
| Xilanase | 37278-89-0 |
| Celulase | 9012-54-8 |
| Naringinase | 9068-31-9 |
| β-Amilase | 9000-91-3 |
| Glucose oxidase | 9001-37-0 |
| alfa-Amilase | 9000-90-2 |
| Pectinase | 9032-75-1 |
| Peroxidase | 9003-99-0 |
| Lipase | 9001-62-1 |
| Catalase | 9001-05-2 |
| TANNASE | 9025-71-2 |
| Elastase | 39445-21-1 |
| Urease | 9002-13-5 |
| DEXTRANASE | 9025-70-1 |
| L-Láctico desidrogenase | 9001-60-9 |
| Malato desidrogenase | 9001-64-3 |
| Colesterol oxidase | 9028-76-6 |