O que é o processo de produção de bioenzimas?

1. produção de enzimas

As enzimas são produzidas a partir de microorganismos, animais e plantas, mas a principal fonte são os microorganismos. Como os microrganismos têm mais vantagens do que as plantas e os animais, geralmente são selecionadas excelentes cepas produtoras de enzimas para produzir enzimas por meio da fermentação. Para aumentar a concentração de enzimas no caldo de fermentação, são selecionadas cepas excelentes, são desenvolvidas bactérias geneticamente modificadas e as condições de fermentação são otimizadas. A produção industrial precisa de um desempenho especial de novas enzimas, como a α-amilase resistente a altas temperaturas, a protease e a lipase resistentes a alcalinos etc. Portanto, precisamos pesquisar e desenvolver cepas para produzir um desempenho especial de novas enzimas.

2. preparação da enzima

A tecnologia de separação e purificação de enzimas é o núcleo do atual "processo de pós-tratamento" da biotecnologia. Usando uma variedade de técnicas de separação e purificação, de células microbianas e seu caldo de fermentação, ou células animais e vegetais e seu caldo de cultura na separação e purificação de enzimas, feitas de preparações enzimáticas altamente ativas de pureza diferente, a fim de tornar as preparações enzimáticas mais amplamente usadas em todos os aspectos da economia nacional, é preciso melhorar a atividade das preparações enzimáticas, a pureza e o rendimento, a necessidade de estudar as novas técnicas de separação e purificação.

3. imobilização de enzimas e células

A pesquisa de imobilização de enzimas e células é a tarefa central da engenharia de enzimas. Para melhorar a estabilidade das enzimas, reutilizar as preparações enzimáticas, expandir a faixa de aplicação das preparações enzimáticas, usar uma variedade de métodos de imobilização para a imobilização de enzimas, a preparação de enzimas imobilizadas, como a glicose isomerase imobilizada, a carbamoilase imobilizada, etc., a determinação de enzimas imobilizadas e as enzimas imobilizadas para a aplicação de vários aspectos do desenvolvimento da pesquisa. A enzima imobilizada ainda tem grande vitalidade. Ela é altamente valorizada por vários campos, como bioquímica, engenharia química, microbiologia, polímeros e medicina.

As células imobilizadas são desenvolvidas com base em enzimas imobilizadas. Vários métodos de imobilização são usados para imobilizar células microbianas, células animais e células vegetais para produzir uma variedade de células biológicas imobilizadas. O estudo das propriedades enzimáticas das células imobilizadas, especialmente as propriedades cinéticas, e a pesquisa e o desenvolvimento de células imobilizadas em várias aplicações são um tópico importante na engenharia de enzimas atualmente.

A tecnologia de imobilização é um marco importante na modernização da tecnologia de enzimas e é uma tecnologia revolucionária para superar as deficiências das enzimas naturais em aplicações industriais e para aproveitar ao máximo as características da reação enzimática. Pode-se dizer que não existe tecnologia enzimática moderna sem o desenvolvimento da tecnologia de imobilização.

4. Modificação molecular da enzima

Também conhecida como modificação molecular da enzima. A fim de melhorar a estabilidade da enzima, reduzir a antigenicidade, estender a meia-vida das bactérias medicinais no corpo, usando vários métodos de modificação para alterar a estrutura da molécula da enzima, a fim de criar uma enzima natural que não tenha algumas características excelentes (como maior estabilidade, ausência de antigenicidade, resistência à hidrólise da protease etc.) e até mesmo criar uma nova atividade enzimática, para expandir a aplicação da enzima, de modo a aumentar o valor da aplicação da enzima e obter maiores benefícios econômicos e sociais.

A modificação molecular da enzima pode ser realizada sob dois aspectos:

(1) Usar a tecnologia de engenharia de proteínas para modificar o gene da estrutura da molécula da enzima, com a expectativa de obter uma nova enzima (enzima mutante) com excelentes características e alta atividade, que tenha uma estrutura primária e uma estrutura espacial razoáveis.

(2) Modificação química ou enzimática da estrutura primária das proteínas da enzima, ou modificação química da molécula da enzima com modificação química do grupo da cadeia lateral. Para alterar as propriedades enzimáticas. Essas enzimas são particularmente úteis na pesquisa básica em enzimologia e na medicina.

Os microrganismos usados na produção de enzimas são fungos filamentosos, leveduras e bactérias em três grupos principais, principalmente bactérias aeróbicas. As cepas e os usos de várias das principais enzimas industriais estão listados abaixo:

Amilase

As amilases hidrolisam o amido para produzir oligossacarídeos pastosos de malte e maltose. A produção é dominada pela fermentação profunda com Bacillus subtilis e Bacillus licheniformis do gênero Bacillus, o último dos quais produz enzimas resistentes ao calor. Fermentações profundas e semi-sólidas com cepas de Aspergillus e Rhizopus também são usadas para o processamento de alimentos [6] . As amilases são usadas principalmente na produção de açúcar, na dessecação de têxteis, no tratamento de matérias-primas de fermentação e no processamento de alimentos. A glucoamilase pode hidrolisar o amido em glicose, que agora é quase inteiramente produzida por fermentação profunda de Aspergillus niger, e é usada na produção de açúcar, produção de álcool e processamento de matéria-prima de fermentação.

Protease

O uso de cepas e a produção da maioria das variedades. Com bacilos em forma de líquen, bacilos pequenos e curtos e bacilos subtilis para a produção de protease bacteriana por fermentação profunda; com streptomyces, Aspergillus para a produção de protease neutra por fermentação profunda e Aspergillus para a produção de protease ácida, usadas para depilação de couro, amaciamento de peles, produtos farmacêuticos e indústria alimentícia; com Trichoderma spp. algumas das bactérias para a produção de coalho por fermentação semissólida na fabricação de queijo em vez de coalho extraído do estômago do bezerro original.

Glucose isomerase

Uma espécie se desenvolveu rapidamente na década de 70. As células de Streptomyces são obtidas primeiramente por fermentação profunda e, após a imobilização, a solução de glicose é convertida em um xarope contendo cerca de 50% de frutose, que pode ser usado na indústria alimentícia em vez de sacarose. Com a amilase, a glucoamilase e a glicose isomerase, etc., o amido de milho será transformado em xarope, tornando-se um dos setores emergentes do açúcar.

Seleção de sistemas de expressão
1 Sistema de expressão de E. coli
①O sistema de expressão PET é o preferido
② A expressão e a purificação da proteína recombinante podem ser realizadas com o uso de marcadores solubilizados, sendo a MBP preferida como primeira opção.
③ Preferencialmente pET24 ou pET28 (se a purificação for necessária) com BL21(DE3), crescimento em meio TB a 37° até 1-1,5 DO, crescimento a 18 ℃ por 1 hora até 3 DO, indução de IPTG a 0,5 mM por 19 horas até DO de até 10.
④ Medidas de resgate para alta expressão e baixa solubilidade: resfriamento até 15 ℃; alteração do meio para 2xYT ou ZYP5052 (autoinduzido), alteração do hospedeiro de expressão; truncamento dos resíduos de 2 a 10 aminoácidos N-terminal e/ou C-terminal; expressão por fusão com proteínas altamente solúveis, como MBP; indução química de chaperones moleculares, coexpressão de chaperones moleculares/proteínas de interação ou fornecimento de ligantes.
⑤ Vantagens e desvantagens do sistema de expressão de E. coli
Vantagens: mais conveniente, mais eficaz
Desvantagens: fraca capacidade de expressão de secreção; dificuldade na formação de ligações dissulfeto; nenhuma modificação pós-tradução

2 Sistema de expressão de levedura (Picrosporum)
Vantagens: integração estável de genes exógenos; o promotor do gene da álcool oxidase é forte, e a expressão pode ser estritamente regulada pelo metanol; as proteínas recombinantes podem ser expressas nas formas intracelular ou extracelular; contém funções de modificação pós-traducional comuns aos sistemas de expressão eucariótica; há hospedeiros/vetores comerciais, o que é fácil de operar; fácil de amplificar, e a densidade de fermentação é extremamente alta.
② Desvantagens: forma única de processamento pós-tradução; problema de glicosilação excessiva.

3 A primeira opção é o sistema de expressão relatado na literatura, a segunda opção é o sistema de E. coli, e o sistema de levedura é usado se a expressão em E. coli for inativa. De acordo com a fonte do gene para determinar o sistema de expressão, o gene é acrescido de etiquetas de afinidade para facilitar a purificação.

Modificação enzimática
①Projeto racional: com base nas informações sobre a estrutura e a função da proteína na alteração do gene codificador e no teste de expressão de recombinação.
Procedimento: primeiro, obtenha a estrutura da enzima do banco de dados BRENDA, depois modifique a estrutura da enzima e preveja a estrutura da enzima com o Alphafold2, depois faça a análise de acoplamento entre a enzima e a molécula do ligante com o software PyMOL e, por fim, de acordo com a nova estrutura da enzima, faça a mutação direcional das sequências do gene e, em seguida, expresse-a recombinantemente para obter uma nova enzima (para melhorar a estabilidade térmica, a eficiência catalítica e a especificidade do substrato da enzima).
② Projeto irracional: mutação ou recombinação de alta frequência de sequências de codificação, expressão recombinante e testes de alto rendimento

Processo de design ab initio: 1. desenvolvimento do campo de força e algoritmo de amostragem 2. testes de alto rendimento 3. identificação da estrutura

Evolução dirigida de proteínas
①Selecionar genes originais
②Estabeleça uma biblioteca de mutações genéticas diversificadas
③Ligue vários genes mutantes em vetores e expresse-os nas cepas correspondentes, respectivamente
④ Selecione um gene mutante de alta qualidade por meio de triagem e, em seguida, expresse o gene mutante em grandes quantidades.

Métodos de geração de bibliotecas de genes mutantes
①Mutação aleatória de alta frequência in vivo: use E. coli XL1-Red como hospedeiro de replicação de genes (sistema de reparo de danos ao DNA defeituoso)
Cultivado até o estágio de platô, ocorre uma mutação de base em 2Kb, em média.
②Kit de mutagênese aleatória: taxa de mutação 0,1 -1,6% /PCR, equivalente a 1-16 mutações de base/gene
③ Mutagênese de saturação ponto a ponto

Evolução natural: Mutação espontânea, recombinação, seleção natural
Evolução agrícola: mutação espontânea, reprodução, triagem
Evolução laboratorial: taxa de mutação acelerada, reprodução molecular, triagem

Embaralhamento de DNA
Estratégia experimental de engenharia de proteínas
①Selecione o gene inicial para estabelecer um sistema de inativação e/ou um método de triagem.
Se a relação estrutura-função for conhecida, adote primeiro o método de projeto racional.
③Ajuste fino da mutação aleatória e triagem de alto rendimento
④Projete do zero somente se não houver um gene inicial adequado.

Técnicas de pesquisa de proteínas
1 Propriedades físicas e químicas relacionadas à separação e purificação de proteínas
Tamanho molecular (diálise, ultrafiltração, filtração em gel, centrifugação)
②Forma molecular (centrifugação em gradiente, eletroforese)
(iii) Propriedades de carga (eletroforese, cromatografia de troca iônica)
(iv) Propriedades de solubilização (salinização, precipitação de solvente orgânico)
⑤ Diferenças na ligação específica aos ligantes (cromatografia de imunoafinidade, cromatografia de bioafinidade, cromatografia de afinidade de quelato metálico)
(vi) Propriedades de adsorção (cromatografia hidrofóbica)
(vii) desnaturação e desnaturação (desnaturação e desnaturação da ureia)

2 Sistema de expressão de proteínas
① Sistema de expressão bacteriana: ciclo curto, alta eficiência, baixo custo, mas sem modificação pós-tradução. Usado principalmente para a produção de proteínas procarióticas e proteínas eucarióticas simples.
Seleção do vetor de expressão: série pet, série pGEX, PQE30......
Seleção de cepas de expressão: BL21(DE3), Rosetta, M15......
Condições de indução: Concentração de IPTG, temperatura e tempo de duração
Purificação: Ni-NTA (His tag), Strep-beads, GST.....

Sistema de expressão de levedura: ciclo curto, alta eficiência, baixo custo, existe modificação pós-tradução. Haverá glicosilação inadequada, modificação com alto teor de manose. Usado principalmente para produzir proteínas intracelulares/secretoras, proteínas de ligação a dissulfeto, proteínas glicosiladas.

(iii) Sistema de expressão de bacteriófagos: alta capacidade gênica, proteína solúvel, adequada para a produção de proteínas tóxicas, modificações pós-traducionais semelhantes às de mamíferos. As condições de cultivo são severas e faltam algumas modificações de glicosilação. Usado principalmente para a produção de proteínas de membrana, proteínas de grande porte, vacinas virais, proteínas de sinalização, citocinas, quinases.
O genoma do baculovírus tem uma enorme capacidade de inserção de genes exógenos de até 38 kb.
Os baculovírus são produzidos em células de insetos e não se replicam em células de mamíferos.
Vantagens: os baculovírus podem ser transduzidos com eficiência em linhagens de células de mamíferos, incluindo células primárias e células-tronco.
Segurança (não se replica em células de mamíferos) e ausência de efeitos citopáticos observáveis
As células pré-transduzidas armazenadas e congeladas também podem ser usadas como células de preparação para testes
Portabilidade (para análise de tipos de células farmacologicamente relevantes)
Velocidade de desenvolvimento de testes (não há necessidade de gastar tempo gerando linhas celulares estáveis)

Sistemas de expressão de mamíferos: tempo de ciclo longo, baixa eficiência, presença de modificações pós-traducionais, alta bioatividade da proteína. Usado principalmente para produzir proteínas eucarióticas complexas, proteínas que exigem PTM preciso.
Expressão transitória de proteínas: Reagentes de transfecção de PEI ou lipossomos
Desenvolvimento de linhas celulares estáveis: Plataformas de engenharia celular Flp-In™ Jump-In™
Expressão induzível: Expressão regulada por tetraciclina
Expressão mediada por entrega viral: sistema de expressão lentiviral para análise funcional; sistema de expressão adenoviral para produção de proteínas

3 Purificação de proteínas
Por que precisamos purificar as proteínas?
Para caracterizar a estrutura e a função das proteínas de interesse.
(ii) Estudar a regulação e as interações entre proteínas
③ gerar anticorpos
Métodos de purificação
Com base em propriedades físicas/químicas
Tamanho da proteína: diálise, ultrafiltração, cromatografia de filtração em gel
Carga da proteína: cromatografia de troca iônica
Hidrofobicidade da proteína: cromatografia de interação hidrofóbica

Com base em propriedades biológicas: cromatografia de afinidade

①Diálise
Fatores de influência: MWCO do tubo de diálise; volume do tampão; tempo de diálise; frequência de substituição do tampão de diálise

Ultrafiltração
Filtragem centrífuga: o tamanho da proteína é menor do que o tamanho do poro do tubo de filtragem e ela é centrifugada até o fundo do tubo.

③ Cromatografia de filtração em gel
Separar proteínas de tamanhos diferentes

④Cromatografia de troca iônica
Coluna de troca catiônica: o gel é carregado negativamente, a proteína é carregada positivamente
Coluna de troca aniônica: o gel é carregado positivamente, a proteína é carregada negativamente
Médio
Suporte inerte: agarose, dextrana
Grupos carregados: carboximetil: carregado negativamente, dietilamino: carregado positivamente
Equilíbrio de íons: grupos carregados negativamente: H+ ou Na+ grupos carregados positivamente: OH- ou Cl-
Eluição gradual ou em gradiente de proteínas por meio do aumento da concentração de sal ou da alteração do pH.

⑤ Cromatografia de afinidade
A cromatografia de afinidade é um método de separação de biomoléculas de uma mistura com base em interações de ligação macromolecular altamente específicas entre uma biomolécula e outra substância.
Os exemplos incluem: ligação de antígenos a anticorpos, ligação de enzimas a ligantes, ligação de glutationa e proteínas de fusão GST, ligação de proteínas antibiotina a moléculas de ligação a biotina e ligação de íons metálicos a proteínas de fusão de polihistidina.

Cromatografia de quelato de metal imobilizado (IMAC) usando íons metálicos (Ni 2+; Co 2+; Cu 2+) ligados a poli-(His) ₆ proteínas marcadas.

Purificação de proteínas marcadas com Strep
As esferas podem adsorver especificamente as proteínas com a marca strep e, em seguida, com a biotina, a proteína pode ser eluída das esferas. (O princípio é semelhante ao do experimento de pull down de GST)

Cromatografia de afinidade proteína A/proteína G
A proteína A e a proteína G geneticamente modificadas podem se ligar especificamente à região Fc da IgG de mamíferos. Ao ligar a proteína A e a proteína G ao material da coluna, a IgG e suas subclasses e fragmentos podem ser purificados por cromatografia de afinidade.
Proteína A: peso molecular de 42 kDa, codificada pelo gene spa, com 5 domínios estruturais isotípicos de ligação à imunoglobulina, cada um consistindo em 3 hélices alfa.
Proteína G: com um peso molecular de 65 kDa, codificada pelo gene spg, liga os segmentos Fc e Fab do anticorpo, bem como a albumina no soro. A proteína G geneticamente modificada remove o local de ligação da albumina e retém apenas o domínio de ligação Fc, que é mais potente do que a proteína A. A proteína A/proteína G é uma proteína geneticamente modificada que se liga à albumina.
Proteína A/proteína G: é uma proteína de ligação geneticamente modificada. Consiste em 4 domínios de ligação de imunoglobulina da proteína A e 2 da proteína G, que tem uma faixa de ligação mais ampla do que a proteína A ou a proteína G isoladamente, e combina suas vantagens em uma só, que pode ser aplicada à purificação de IgG de quase todas as espécies.

Como identificar a proteína purificada?
SDS-PAGE; HPLC; espectrometria de massa; Western blot; ensaios de ligação; ensaios funcionais; elucidação estrutural.

4 Microscopia eletrônica
Microscopia crioeletrônica de partícula única (Single-ParticleAnalysis, SPA)
Microscopia de tomografia crioeletrônica (cryo-ET)

Entre em contato conosco agora!

Se precisar do Price, preencha suas informações de contato no formulário abaixo. Normalmente, entraremos em contato dentro de 24 horas. Você também pode me enviar um e-mail info@longchangchemical.com durante o horário comercial (das 8h30 às 18h UTC+8 de segunda a sábado) ou use o bate-papo ao vivo do site para obter uma resposta imediata.

Composto Glucoamilase	9032-08-0
Pullulanase	9075-68-7
Xilanase	37278-89-0
Celulase	9012-54-8
Naringinase	9068-31-9
β-Amilase	9000-91-3
Glucose oxidase	9001-37-0
alfa-Amilase	9000-90-2
Pectinase	9032-75-1
Peroxidase	9003-99-0
Lipase	9001-62-1
Catalase	9001-05-2
TANNASE	9025-71-2
Elastase	39445-21-1
Urease	9002-13-5
DEXTRANASE	9025-70-1
L-Láctico desidrogenase	9001-60-9
Malato desidrogenase	9001-64-3
Colesterol oxidase	9028-76-6