Qual é a abordagem da química computacional na pesquisa de enzimas industriais?
O artigo apresenta os principais métodos de química computacional usados na pesquisa industrial de enzimas, especialmente para orientar a engenharia de enzimas, incluindo simulações de campo de força de mecânica molecular e dinâmica molecular, mecânica quântica e modelagem combinada de mecânica quântica/mecânica molecular, modelagem eletrostática contínua e acoplamento molecular. Esses métodos são resumidos no texto a partir de duas perspectivas, respectivamente: primeiro, os conceitos básicos dos próprios métodos, os resultados dos cálculos originais, as condições de aplicabilidade e as vantagens e desvantagens; e segundo, as informações valiosas obtidas a partir dos cálculos para orientar o projeto de mutantes e bibliotecas de mutantes.
A aplicação industrial de enzimas tem uma história centenária, e a catálise enzimática é amplamente utilizada em diferentes setores, como alimentos, agricultura, medicina e indústria química, devido à sua alta eficiência, alta especificidade e seletividade, além de ser ecologicamente correta [1-2]. Como o ambiente de aplicação industrial é muito diferente do ambiente em que as enzimas vivem na natureza, a natureza e a função catalítica das enzimas naturais e seu ambiente de aplicação geralmente não combinam ou não são ideais. Nesse caso, é necessário modificar a sequência natural de aminoácidos da enzima com a ajuda da engenharia de enzimas para melhorar seu desempenho [3]. A estratégia de engenharia de enzimas mais comumente usada é a construção de bibliotecas de mutações para triagem, ou seja, evolução dirigida em laboratório [4]. Um dos pré-requisitos necessários para uma evolução dirigida eficaz é que a capacidade da biblioteca (ou seja, o número de mutantes contidos na biblioteca) da biblioteca de mutantes que está sendo examinada seja suficientemente grande em relação à proporção de mutantes potencialmente benéficos na biblioteca. O tamanho de uma biblioteca de mutantes geralmente é limitado pelo método de triagem, pelos recursos disponíveis e por outras condições objetivas. A questão principal é como aumentar a porcentagem de mutantes eficazes na biblioteca de mutantes. O conhecimento aprofundado da relação entre a sequência da enzima, a estrutura e as propriedades importantes pode ajudar a identificar os pontos críticos de mutação, limitar o escopo da mutação e realizar um projeto de biblioteca de mutantes de qualidade. Os métodos de química computacional são um meio importante de obter essa compreensão. Foi demonstrado que as bibliotecas de mutação de proteínas projetadas por computador com base no design computacional podem aumentar a porcentagem de mutantes eficazes em várias ordens de magnitude em relação às bibliotecas de mutação aleatória [5]. Para alguns tópicos difíceis de engenharia de enzimas ou de proteínas, o aprimoramento substancial que a computação pode proporcionar pode ser suficiente para determinar o sucesso ou o fracasso final do tópico, que não está mais limitado ao aprimoramento da eficiência. De fato, a química computacional e os métodos de biologia computacional possibilitaram o projeto de enzimas artificiais a partir do zero com funções catalíticas que as enzimas naturais não possuem. Como outras revisões deste álbum foram dedicadas a métodos para o projeto otimizado automatizado de sequências de aminoácidos, este artigo se concentrará em métodos computacionais para simular e analisar enzimas com uma determinada sequência de aminoácidos. Obviamente, os pesquisadores podem usar esses métodos para estudar o tipo selvagem e os mutantes separadamente e depois comparar os resultados.
O estudo de proteínas, especialmente enzimas, é há muito tempo uma importante fronteira da pesquisa em química computacional [6-8]. Os principais métodos incluem simulações de dinâmica molecular (MD clássica) baseadas em campos de força de mecânica molecular clássica [9], mecânica quântica (QM) [10] e métodos combinados de mecânica quântica/mecânica molecular (QM/MM) [8,11-12], previsão de complexos intermoleculares, ou seja, acoplamento molecular (Docking) [13], e modelo contínuo polarizável (PCM) para quantificar os efeitos eletrostáticos e de solvente [ 14]. ), como o modelo Poisson-Boltzmann (PB) [14], e alguns modelos baseados em propriedades geométricas. Neste artigo, apresentaremos uma visão geral de cada um desses métodos a partir de duas perspectivas: primeiro, sobre os próprios métodos, incluindo os princípios básicos, os resultados computacionais originais, as condições de aplicabilidade e as (possíveis) vantagens e desvantagens etc.; e, segundo, sobre como usar esses métodos para obter informações relevantes para a engenharia, como uma compreensão mais profunda dos mecanismos catalíticos relevantes, previsões teóricas ou explicações de mudanças nas propriedades.e, em segundo lugar, sobre como usar esses métodos para obter informações relevantes para a engenharia, como uma compreensão mais profunda dos mecanismos cataliticamente relevantes, previsões teóricas ou explicações de alterações nas propriedades ou funções de diferentes mutantes em relação ao tipo selvagem, que podem orientar o projeto de bibliotecas de mutação de alta qualidade para evolução direcionada, ou o projeto de bibliotecas de mutação de alta qualidade, ou o projeto de bancos de mutação. projeto de bibliotecas de mutação de alta qualidade, ou sugerir locais específicos de mutação e tipos de mutação com base na análise de resultados computacionais brutos etc.
1
Simulação de dinâmica molecular (MD) baseada em campos de força de mecânica molecular clássica (MM)
1.1
Introdução ao método
Por enquanto, não consideramos as alterações químicas envolvidas na catálise enzimática, mas apenas os processos de alterações conformacionais da enzima, formação e dissociação de complexos não covalentes entre a enzima e os reagentes (ou produtos) devido ao movimento térmico molecular. Durante esses processos, o estado eletrônico da molécula não se altera (por exemplo, nenhuma ligação covalente é quebrada ou criada), e o modelo de campo de força da mecânica molecular se aplica. O chamado campo de força da mecânica molecular é uma função matemática empírica que expressa a dependência da energia potencial de um sistema molecular na configuração geométrica (ou seja, as coordenadas espaciais de todos os átomos que compõem o sistema molecular) (Fig. 1A). Em outras palavras, se usarmos X para representar as coordenadas espaciais de todos os átomos e VMM (X ) para representar a energia potencial do campo de força molecular, a energia potencial muda à medida que a molécula muda de uma conformação X1 para outro X2:
∆VMM = VMM ( X2 ) – VMM ( X1 ).
De acordo com a teoria termodinâmica, os átomos em uma molécula estão sempre em movimento térmico, ou seja, X está constantemente mudando com o tempo; além disso, quando fazemos observações experimentais, a amostra sempre consiste em um grande número de moléculas (com exceção de experimentos com uma única molécula), com diferentes moléculas em diferentes estados conformacionais. Portanto, do ponto de vista cinético, precisamos considerar as mudanças conformacionais ao longo do tempo e, do ponto de vista termodinâmico, precisamos considerar a distribuição de probabilidade de moléculas com diferentes conformações. A simulação de dinâmica molecular (MD) é o modelo mais simples para examinar esses dois aspectos das propriedades (Fig. 1B). Na simulação MD, partimos de uma conformação inicial, calculamos a força que atua em cada átomo em cada momento com base na conformação atual e na função de energia potencial (a força é a derivada negativa da função de energia potencial em relação às coordenadas dos átomos), integramos numericamente as equações de movimento de Newton para obter a conformação no próximo momento e repetimos o processo para obter a trajetória da evolução da conformação ao longo do tempo.
No meio disso, algoritmos especiais podem ser usados para simular o efeito de fatores ambientais (por exemplo, temperatura, pressão etc.) no movimento molecular. De acordo com o princípio termodinâmico, quando o intervalo de tempo é longo o suficiente, a distribuição de probabilidade da conformação da mesma molécula em diferentes pontos de tempo e a conformação de diferentes moléculas no estado de equilíbrio termodinâmico são as mesmas (ou seja, a média de tempo é equivalente à média do sistema). Portanto, se a simulação MD for executada por um período de tempo suficientemente longo, o conjunto de conformações obtido da simulação poderá ser usado como uma amostra da distribuição de conformações moleculares em um determinado estado de equilíbrio termodinâmico. Com base nesse princípio, podemos analisar propriedades observáveis arbitrárias de um sistema em seu estado de equilíbrio termodinâmico com base nas trajetórias de tempo obtidas por MD.
A MD oferece uma poderosa ferramenta computacional para analisar de forma abrangente o processo de mudança cinética de alterações conformacionais e importantes distribuições termodinâmicas quânticas microscópicas em resolução atômica, o que é particularmente importante para elucidar os princípios de design e os mecanismos de funcionamento de máquinas biomacromoleculares complexas, como as enzimas. Como os métodos experimentais atuais para análise da estrutura macromolecular só podem fornecer estruturas estáticas com média espaço-temporal, as simulações de MD têm uma função insubstituível em pesquisas relacionadas. De acordo com essa premissa, a própria ferramenta de MD ainda está em processo de aprimoramento e refinamento contínuos. Metodologicamente, as principais limitações da MD vêm de dois aspectos: primeiro, a precisão do modelo do campo de força molecular e, segundo, o tempo limitado de simulação dificulta a realização da amostragem completa do espaço conformacional. Com relação ao primeiro problema, o campo de força molecular foi bastante aprimorado nos últimos anos, e a precisão da descrição termodinâmica do equilíbrio conformacional das macromoléculas biológicas, especialmente dos sistemas de proteínas, foi aumentada, simulando com sucesso uma variedade de moléculas de proteínas, desde o processo de dobragem da cabeça até a estrutura natural [15-16]. Em termos de tempo de simulação, devido ao desenvolvimento de hardware e software de computador, agora é possível realizar simulações da ordem de microssegundos para sistemas de tamanho usual (por exemplo, moléculas de enzimas de centenas de resíduos em solução aquosa) usando hardware de computação convencional (por exemplo, servidores de vários núcleos usados pelo grupo). Nessa escala de tempo, processos como a abertura e o fechamento de domínios estruturais ou regiões de anel podem ser observados. Se houver mais recursos de computação disponíveis, também é possível realizar simulações diretas de processos como ligação/dissociação de substrato. Para estudar processos em escalas de tempo além do alcance da simulação (por exemplo, alterações funcionais em larga escala de proteínas alostéricas etc.), podem ser usados métodos de amostragem aprimorados [17], desde que o usuário tenha um conhecimento mais aprofundado da teoria MD.
Atualmente, a maioria dos aplicativos de simulação de MD abrange escalas de tempo de nanossegundos a microssegundos, e a amostragem do espaço conformacional é restrita principalmente à vizinhança da estrutura inicial (para proteínas de domínio único, geralmente é o aumento e a queda estrutural do deslocamento da raiz quadrada média (RMS) na faixa de 3-4 Å). Portanto, é necessário usar uma estrutura inicial razoável como entrada para a MD para que os resultados da simulação sejam significativos. Na maioria dos casos, estruturas cristalinas determinadas experimentalmente ou estruturas baseadas em modelagem comparativa de proteínas homólogas são usadas como estruturas iniciais para MD. Ao simular complexos de enzima-substrato, geralmente é necessário modelar a estrutura inicial do complexo com base na estrutura da enzima vazia ou da enzima em complexo com outras moléculas, seja usando acoplamento molecular ou substituindo diretamente outras moléculas pequenas (por exemplo, inibidores) na estrutura cristalina pelo substrato. As simulações MD também exigem a construção de um campo de força molecular que retrate todas as unidades químicas do sistema. Quando o sistema a ser simulado inclui uma molécula pequena como substrato, é comum que o campo de força molecular padrão fornecido no pacote de software MD não cubra a molécula pequena como substrato. Nesse caso, é possível usar um software de ferramenta que possa gerar automaticamente campos de força para moléculas pequenas [18-19]. Os arquivos de campo de força devem ser verificados manualmente e usados para testes de simulação curtos antes de usar os campos de força gerados automaticamente para simulações MD longas.
Fig. 1 Campo de força de mecânica molecular (A) e simulação de dinâmica molecular (B)
Fig. 1 Campo de força de mecânica molecular (A) e simulação de dinâmica molecular (B)
1.2
Aplicação à pesquisa de enzimas
As informações obtidas com as simulações MD podem ser aplicadas de diferentes maneiras para orientar as modificações de engenharia de enzimas [20]. Por exemplo, comparando simulações MD de temperatura ambiente e alta temperatura, é possível prever quais regiões da molécula da enzima provavelmente terão a estabilidade estrutural mais sensível à temperatura ambiente. A introdução de mutações pontuais de prolina, ligações dissulfeto, etc. nessas regiões poderia aumentar a resistência ao calor da enzima [21-24]. Outra estratégia para melhorar a estabilidade é projetar mutantes que formem mais ligações de hidrogênio e sal na superfície [25-26]. Antes de validar experimentalmente esses mutantes, o tipo selvagem e os mutantes podem ser simulados em paralelo para avaliar teoricamente se a mutação pode alcançar o efeito desejado [27-28]. Além da temperatura, a MD pode ser usada para analisar o efeito das mudanças no pH ambiental, nos solventes etc. sobre a conformação da proteína e sua estabilidade [29-30].
Além da estabilidade, a MD foi aplicada para prever resíduos de pontos críticos com potencial para afetar significativamente a dinâmica conformacional associada à ligação do substrato/liberação do produto, fornecendo uma base para a criação de mutações ou bibliotecas de mutantes que podem alterar a seletividade do substrato, a seletividade da reação, a taxa de liberação do produto etc [31-32]. Uma das maneiras de estudar a seletividade de substrato/reação com MD é comparar os resultados da simulação de complexos enzima-substrato com diferentes (estruturas iniciais) e prever substrato ou estados estruturais com maior afinidade (ou maior reatividade). Um método quantitativo rigoroso para calcular a afinidade (ou reatividade) são os cálculos de energia livre [33-34]. Devido à natureza computacionalmente intensiva dos cálculos de energia livre, a maioria dos aplicativos atuais usa métodos qualitativos para a previsão: a discriminação qualitativa da afinidade relativa pode se basear na estabilidade da estrutura dos complexos de moléculas pequenas e macromoléculas, na energia média de interação intermolecular etc., enquanto a discriminação qualitativa da reatividade se baseia nas distribuições de configuração geométrica relativa dos grupos funcionais catalíticos e reativos etc. [35]. Os resultados dessa discriminação qualitativa podem ser usados como base para projetar bibliotecas de sequências evolutivas direcionadas. Além disso, as simulações MD também podem ser usadas para analisar os resíduos de pontos críticos em torno do poro de ligação do substrato/dissociação do produto [36-37]. Esse tipo de aplicativo envolve a simulação de caminhos de dissociação para a dissociação de moléculas pequenas de proteínas e, se houver dificuldades com escalas de tempo de simulação insuficientes, elas podem ser superadas usando técnicas de amostragem aprimoradas [38-39].
2
Modelos de mecânica quântica (QM) e modelos combinados de mecânica quântica/mecânica molecular (QM/MM)
2.1
Introdução ao método
Para simular as etapas químicas da catálise enzimática, como a criação e a quebra de ligações covalentes, a transferência de elétrons e os saltos entre diferentes estados eletrônicos, são necessários modelos de mecânica quântica (QM). Atualmente, os modelos QM comumente usados em química computacional são classificados em vários tipos, como ab initio ( ab initio ), teoria funcional de densidade (DFT) e métodos semi-empíricos [40]. Entre eles, os métodos semi-empíricos são os menos dispendiosos do ponto de vista computacional. Entretanto, eles não são métodos de primeiros princípios e a confiabilidade dos resultados computacionais depende muito do sistema e do problema específicos. Os métodos ab initio e DFT são métodos de primeiros princípios e são universais. Os modelos práticos de DFT podem conter mais aproximações teóricas empíricas do que os cálculos ab initio, mas a DFT pode lidar com energias de correlação de elétrons com eficiência computacional muito alta. Além disso, para muitos problemas de reações químicas, os erros computacionais dos melhores modelos DFT para parâmetros importantes, como as alterações de energia durante o processo de reação, já são tão pequenos quanto cerca de 1 kcal/mol, e os resultados são suficientes para serem usados como base para determinar a solidez química de um mecanismo catalítico ou caminho de reação específico.
Dada a configuração geométrica de uma molécula, sua energia pode ser calculada usando o QM. O modelo QM é usado com mais frequência para a otimização de geometrias moleculares, ou seja, para encontrar uma estrutura localmente estável (com uma energia mais baixa do que as estruturas vizinhas) após alterações sucessivas de uma configuração inicial ou para encontrar os caminhos de menor energia que conectam os reagentes aos produtos e os estados de transição ao longo dos caminhos. Esses cálculos são computacionalmente intensivos, pois diferentes configurações geométricas precisam ser consideradas e comparadas e, normalmente, dezenas a milhares de cálculos de ponto único precisam ser realizados. Uma estratégia comum para economizar esforço computacional é otimizar primeiro uma ampla gama de pesquisas de caminhos de reação usando modelos QM eficientes com precisão limitada e, em seguida, concluir a otimização da configuração usando modelos de maior precisão próximos à configuração/caminho de energia mais baixa pesquisada ou realizar cálculos de ponto único.
Atualmente, a aplicação de métodos QM de primeiro princípio a toda a molécula da enzima é computacionalmente intensiva, basicamente limitada a cálculos de ponto único, e ainda carece de praticidade. O modelo QM/MM (Fig. 2) é comumente usado para moléculas grandes [11]. Nesse modelo, o sistema molecular é dividido em pelo menos duas partes: a parte diretamente envolvida na reação química é tratada com o modelo QM, e o restante é tratado com a mecânica molecular (MM). Há várias estratégias diferentes para lidar com os limites e as interações QM-MM [41]. Nos modelos QM/MM de primeiros princípios, os cálculos de QM são muito mais caros do que os de MM. Portanto, os métodos de otimização conformacional são usados principalmente para a região de QM para prever ou simular sua geometria, e as simulações de dinâmica molecular podem ser usadas para obter amostras da parte de MM. [42]. Isso significa que os resultados computacionais podem ser mais sensíveis à estrutura inicial da região QM do sistema. Nesse caso, são necessários cálculos com diferentes modelos de estrutura inicial para obter resultados confiáveis. Se os métodos semi-empíricos [43] ou teorias empíricas de ligação de valência [44-45] são usados para a parte QM , pode ser possível explorar o espaço conformacional de forma mais completa e reduzir o efeito da estrutura inicial por meio de uma amostragem MD QM/MM mais longa.
Fig. 2 Mecânica quântica (QM)/Molecular Mecânica (MM) modelos
Fig. 2 Modelo de mecânica quântica (QM)/mecânica molecular (MM).
2.2
Aplicação do método
Ambos o modelo QM [10] e o modelo QM/MM [41] têm sido amplamente utilizados para a previsão teórica e o teste dos mecanismos químicos das reações catalisadas por enzimas. Seus resultados podem nos ajudar a discernir quais resíduos importantes participam do processo de reação química, encontrar a etapa limitadora da taxa da reação, modelar a estrutura dos intermediários da reação e dos estados de transição, analisar como eles interagem com o ambiente da enzima, etc. Em comparação com o modelo de cluster QM, o modelo QM/MM pode simular de forma mais realista o ambiente da enzima no qual os centros de reação química estão localizados. O QM/MM tem sido amplamente utilizado para prever/testar teoricamente o mecanismo químico da catálise enzimática e para analisar e prever os possíveis efeitos dos resíduos de aminoácidos ambientais no processo catalítico. [46]. Em princípio, esses resultados podem ser usados para orientar o projeto de bibliotecas de mutações de evolução dirigida com o objetivo de aumentar a atividade catalítica e alterar a especificidade ou a seletividade. Um estudo mais desafiador seria obter enzimas artificiais totalmente novas com base no projeto de novos centros ativos a partir de modelos de estrutura de estado de transição previstos por QM ou QM/MM [47].
3
Modelagem eletrostática de mídia contínua
3.1
Princípio do método
A catálise enzimática é quase sempre realizada em um ambiente de solução específico. Os efeitos do solvente têm uma influência crucial nas propriedades da enzima. Os modelos para calcular os efeitos do solvente dos tratamentos químicos se enquadram em duas categorias: modelos explícitos de solvente, por exemplo, em campos de força de mecânica molecular ou modelos QM, em que cada molécula de solvente e cada átomo nela contido são explicitamente incluídos no modelo; e modelos implícitos de solvente ou de meio contínuo [48], onde As moléculas e os átomos do solvente não são incluídos no modelo e os chamados "campos médios do solvente" são usados para lidar com os efeitos do solvente. que não inclui moléculas e átomos do solvente, mas trata os efeitos do solvente com o chamado "campo médio do solvente". A vantagem do modelo de solvente explícito é que ele é capaz de tratar o soluto e o solvente de maneira totalmente consistente, modelando de forma realista interações específicas, como a ligação de hidrogênio soluto-solvente, a ligação de sal e assim por diante. A desvantagem é que o número de moléculas de solvente é grande e intensivo em termos de computação. Além disso, o aumento estocástico do solvente contribui significativamente para a energia total do sistema, e a média da amostra de simulação longa deve ser realizada para eliminar o efeito do aumento. O modelo de solvente oculto retrata o efeito de média do solvente, e o aumento e a queda termodinâmica do solvente foram calculados.
Para simplificar o tratamento, geralmente separamos o efeito do solvente não polar (efeito hidrofóbico) do efeito do solvente polar no modelo de solvente oculto. A experiência tem mostrado que a energia livre de solvatação de um soluto não polar é proporcional à sua área de superfície acessível ao solvente (SASA). Portanto, o modelo de solvatação SASA é frequentemente usado para esse componente. Os parâmetros desse modelo incluem os raios atômicos necessários para calcular a SASA, o raio da molécula de solvente (1,4 Å para moléculas de água) e uma constante de proporcionalidade para a energia livre de solvatação proporcional à SASA. Esses parâmetros são geralmente determinados pelo ajuste de valores experimentais da energia livre de solvatação de moléculas pequenas.
Os modelos mais comumente usados para considerar os efeitos do solvente polar tratam a região ocupada pelo solvente como um meio contínuo com uma constante dielétrica específica (78,4 para a água) e a região do soluto como sendo ocupada por um meio com uma constante dielétrica baixa (geralmente avaliada em 2-8) ou um vácuo (constante dielétrica de 1) (Fig. 3A). O meio contínuo é polarizado pelo campo eletrostático gerado pela distribuição de carga na região do soluto, e a distribuição de carga polarizada resultante, por sua vez, gera um campo eletrostático na região do soluto que atua sobre a carga do soluto. O campo elétrico gerado pelas cargas polarizadas é chamado de campo de reação. Portanto, o modelo de meio contínuo eletrostático também é conhecido como modelo de campo de reação. No modelo de meio contínuo sem íons livres na região do solvente, a relação entre o potencial eletrostático espacial e a distribuição de carga espacial satisfaz a equação de Poisson. Para um ambiente de solução contendo íons livres, a distribuição espacial dos íons é afetada pelo potencial eletrostático espacial. Considerando esse fator, a relação entre o potencial eletrostático espacial e a distribuição espacial de carga satisfaz a equação de Poisson-Boltzmann (equação PB). A equação PB é uma equação diferencial parcial referente à relação entre a distribuição do potencial eletrostático e a distribuição da carga e do dielétrico no espaço tridimensional, e pode ser resolvida numericamente. O método numérico mais comum para resolver a equação PB para sistemas macromoleculares, como enzimas, é o método de diferença finita (FD), coletivamente chamado de modelo FDPB (Figura 3B) [14]. Com o FDPB, é possível calcular o potencial eletrostático em três dimensões com base na distribuição de carga espacial do soluto, o que, por sua vez, permite o cálculo de outras propriedades, como a energia livre eletrostática. Nos cálculos de QM para sistemas de moléculas pequenas, o campo de reação é frequentemente substituído de forma equivalente pelo campo elétrico gerado pela distribuição de carga superficial na superfície molecular, e o modelo correspondente é chamado de modelo de meio contínuo polarizável (PCM).
O modelo mais comumente usado para levar em conta os efeitos do solvente polar trata a região ocupada pelo solvente como um meio contínuo com uma constante dielétrica específica (78,4 para a água), enquanto a região do soluto é tratada como se fosse ocupada por um meio com uma constante dielétrica baixa (geralmente avaliada em 2-8) ou um vácuo (constante dielétrica de 1) (Fig. 3A). O meio contínuo é polarizado pelo campo eletrostático gerado pela distribuição de carga na região do soluto, e a distribuição de carga polarizada resultante, por sua vez, gera um campo eletrostático na região do soluto que atua sobre a carga do soluto. O campo elétrico gerado pelas cargas polarizadas é chamado de campo de reação. Portanto, o modelo de meio contínuo eletrostático também é conhecido como modelo de campo de reação. No modelo de meio contínuo sem íons livres na região do solvente, a relação entre o potencial eletrostático espacial e a distribuição de carga espacial satisfaz a equação de Poisson. Para um ambiente de solução contendo íons livres, a distribuição espacial dos íons é afetada pelo potencial eletrostático espacial. Considerando esse fator, a relação entre o potencial eletrostático espacial e a distribuição espacial de carga satisfaz a equação de Poisson-Boltzmann (equação PB). A equação PB é uma equação diferencial parcial referente à relação entre a distribuição do potencial eletrostático e a distribuição da carga e do dielétrico no espaço tridimensional, e pode ser resolvida numericamente. O método numérico mais comum para resolver a equação PB para sistemas macromoleculares, como enzimas, é o método de diferença finita (FD), coletivamente chamado de modelo FDPB (Figura 3B) [14]. Com o FDPB, é possível calcular o potencial eletrostático em três dimensões com base na distribuição de carga espacial do soluto, o que, por sua vez, permite o cálculo de outras propriedades, como a energia livre eletrostática. Nos cálculos QM de sistemas moleculares pequenos, o campo de reação é frequentemente substituído de forma equivalente pelo campo elétrico gerado pela distribuição de carga superficial na superfície da molécula, e o modelo correspondente é chamado de modelo de meio contínuo polarizável (PCM).
Fig. 3 Modelo eletrostático contínuo (A) e Poisson-Boltzmann de diferença finita (FDPB) método (B)
Fig. 3 Modelo eletrostático contínuo (A) e o método de diferenças finitas de Poisson-Boltzmann (FDPB) (B).
3.2
Aplicação do método
Uma das aplicações importantes do modelo contínuo é o estudo do estado de protonação de grupos de cadeias laterais de aminoácidos carregados em moléculas de enzimas. O software PROPKA prevê o pKa de cada grupo dissociável resolvendo a equação PB para calcular a energia livre eletrostática para diferentes estados de protonação [50]. A distribuição do potencial eletrostático de superfície de uma molécula de enzima é um fator importante que afeta a seletividade do substrato da enzima. Dada a estrutura espacial e o estado de protonação de uma molécula de enzima, a distribuição do potencial eletrostático de superfície de uma molécula de enzima pode ser calculada pelo método FDPB, que também prevê o efeito de mutações em resíduos de aminoácidos ou alterações no pH ambiental, alterações na concentração iônica, etc., no potencial eletrostático de superfície. [14].
Ao estudar as etapas químicas da catálise enzimática com o modelo de cluster QM, muitas vezes é necessário usar o modelo PCM para simular a influência eletrostática do ambiente na zona de reação. Se o processo de reação envolver mudanças significativas na distribuição de carga, os resultados dos cálculos de QM a vácuo sem o uso de um meio contínuo não são razoáveis e podem até levar a conclusões qualitativas errôneas. No modelo QM/MM, o centro de reação geralmente é cercado por moléculas solúveis que são tratadas da maneira MM, e geralmente não há necessidade de considerar o campo de reação do meio contínuo. No entanto, se a carga líquida do sistema mudar antes e depois da reação (por exemplo, cálculos de potencial redox), é provável que a contribuição do ambiente da solução fora do limite do sistema para a energia livre da reação precise ser levada em conta e, nesse caso, os resultados de QM/MM podem ser corrigidos usando o modelo de meio contínuo.
Como um método que equilibra eficiência e precisão, o MM/PBSA pode ser usado para analisar a afinidade de complexos proteína-proteína e proteína-molécula pequena [49]. Para obter o cancelamento de erros, é convencional realizar simulações de dinâmica molecular de solvente explícito dos complexos para obter uma coleção de conformações; para cada conformação complexa, calcular a energia MM/PBSA do complexo como um todo e de cada monômero que compõe o complexo, respectivamente; e aproximar a energia livre de ligação usando a média da diferença entre a energia MM/PBSA do todo e a dos monômeros para toda a conformação. Esse método pode ser usado para analisar resíduos de pontos críticos que afetam a afinidade do substrato e também pode ser usado para prever alterações na seletividade do substrato em mutantes.
4
Outros métodos
4.1
Docagem molecular
Docking refere-se ao processo computacional de prever a estrutura (e a afinidade) de um complexo com base na estrutura de um monômero. O acoplamento de pequenas moléculas e proteínas é uma ferramenta central para a triagem virtual de medicamentos com base na estrutura, para a qual vários algoritmos foram desenvolvidos [13]. Esses algoritmos e modelos também podem ser aplicados ao acoplamento de complexos substrato-enzima. A triagem virtual de medicamentos exige a consideração de um grande número de moléculas pequenas diferentes e, por motivos de eficiência computacional, as alterações estruturais do receptor (ou apenas a cadeia lateral) geralmente não são levadas em conta nos cálculos de acoplamento molecular. Em contraste com a triagem virtual, nos estudos de acoplamento substrato-enzima, apenas um ou vários substratos diferentes são considerados com frequência, e as alterações estruturais na enzima podem, em princípio, ser levadas em conta de forma mais completa. A maneira mais direta de fazer isso é obter diversas estruturas de enzimas por meio de métodos de amostragem conformacional, como o MD, que são acoplados separadamente ao substrato. No acoplamento substrato-enzima, muitas vezes também é possível usar a disposição espacial relativa do substrato e dos grupos funcionais catalíticos para examinar/avaliar os resultados do acoplamento.
4.2
Previsão de poros de moléculas pequenas com base na geometria
Diversos estudos experimentais revelaram que algumas mutações distantes do centro ativo podem ter um grande impacto sobre o desempenho catalítico das enzimas. Alguns desses locais podem agir alterando o poro de ligação do substrato/liberação do produto, e o tamanho do poro, as propriedades físico-químicas dos resíduos ao redor do poro etc. podem alterar a taxa de passagem do substrato/produto e afetar a seletividade do substrato. Os métodos de previsão de poros podem ser usados para encontrar resíduos quentes relevantes e fornecer uma base para o projeto de bibliotecas de evolução dirigida. Vários métodos baseados na estrutura geométrica estão disponíveis para prever cavidades na superfície da proteína, cavidades internas, poros que conectam diferentes regiões, etc [51-53]. Esses métodos usam estruturas espaciais estáticas como entradas e, em sua maioria, empregam métodos geométricos e de teoria de gráficos para realizar a previsão com alta eficiência computacional.
4.3
Métodos de comparação de centros ativos
Atualmente, uma grande quantidade de dados de estrutura 3D de enzimas com diferentes tipos de estrutura e famílias foi acumulada no banco de dados de estrutura 3D de proteínas (PDB). Se compararmos diferentes enzimas, descobriremos que algumas delas têm um alto grau de similaridade nos centros ativos (exemplos típicos são os centros ativos da tríade catalítica compartilhados por serina proteases), embora as sequências estruturais gerais não sejam semelhantes. O método de comparação da estrutura do centro ativo [54-55] pode ser usado para recuperar automaticamente os centros ativos de outras enzimas que são semelhantes ao centro ativo da enzima atual. O empilhamento de vários centros ativos semelhantes no espaço tridimensional e a análise das semelhanças e diferenças entre os diferentes centros ativos podem fornecer informações valiosas para a seleção do local da mutação.
5
Resumo
Para fins de clareza na apresentação, nossa introdução dos métodos acima é categorizada. Na prática, os diferentes tipos de métodos não são mutuamente exclusivos. Eles podem ser usados em combinação de várias maneiras para responder melhor às nossas perguntas de interesse. Por exemplo, em simulações de complexos enzima-substrato, o acoplamento molecular pode ser usado para obter a conformação inicial da simulação; o conjunto de conformações obtidas a partir de simulações MD pode ser usado para análise de previsão de poros, acoplamento molecular, simulações QM/MM etc.; modelos MM que inscrevem modelos de transição que são usados para a análise de poros.Os modelos MM que inscrevem os estados de transição obtidos dos modelos QM ou QM/MM podem ser construídos e usados para simulações MD clássicas de longo prazo para analisar os efeitos do aumento e da queda conformacional nos processos químicos, ou para simular um grande número de mutantes para realizar a triagem virtual de mutantes com base em simulações MD; a abordagem MM/PBSA, que já mencionamos, é uma combinação de MD e modelagem de meio contínuo, e assim por diante.
O estudo de sistemas de biomoléculas, como proteínas, por meio de métodos de química computacional tem uma história de mais de 40 anos. Esses métodos têm sido usados cada vez mais amplamente na pesquisa de enzimas industriais, enquanto se desenvolvem continuamente. As equipes de pesquisa da China em química computacional e engenharia de enzimas industriais estão se expandindo e suas capacidades de pesquisa estão melhorando rapidamente. A aplicação da química computacional na engenharia de enzimas será ampliada e aprofundada à medida que a combinação cruzada dessas duas disciplinas se tornar cada vez mais próxima. A engenharia de proteínas, a evolução dirigida e outras técnicas tiveram um grande impacto na pesquisa industrial de enzimas. Espera-se que o desenvolvimento futuro de métodos computacionais, especialmente o avanço de novos métodos de design de enzimas, traga novos avanços tecnológicos para a pesquisa industrial de enzimas na era da biologia sintética.
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| Xilanase | 37278-89-0 |
| Celulase | 9012-54-8 |
| Naringinase | 9068-31-9 |
| β-Amilase | 9000-91-3 |
| Glucose oxidase | 9001-37-0 |
| alfa-Amilase | 9000-90-2 |
| Pectinase | 9032-75-1 |
| Peroxidase | 9003-99-0 |
| Lipase | 9001-62-1 |
| Catalase | 9001-05-2 |
| TANNASE | 9025-71-2 |
| Elastase | 39445-21-1 |
| Urease | 9002-13-5 |
| DEXTRANASE | 9025-70-1 |
| L-Láctico desidrogenase | 9001-60-9 |
| Malato desidrogenase | 9001-64-3 |
| Colesterol oxidase | 9028-76-6 |