Wat is de computationele chemiebenadering in industrieel enzymonderzoek?

Het artikel introduceert de belangrijkste computationeel-chemische methoden die worden gebruikt bij industrieel enzymonderzoek, met name voor het sturen van enzymengineering, waaronder moleculaire mechanica krachtveld- en moleculaire dynamica simulaties, kwantummechanica en gecombineerde kwantummechanica/moleculaire mechanica modellering, continuüm elektrostatische modellering en moleculaire docking. Deze methoden worden in de tekst vanuit twee perspectieven samengevat: ten eerste de basisconcepten van de methoden zelf, de resultaten van de oorspronkelijke berekeningen, de voorwaarden voor toepasbaarheid en de voor- en nadelen; en ten tweede de waardevolle informatie die uit de berekeningen wordt verkregen om het ontwerp van mutanten en mutantbibliotheken te sturen.

De industriële toepassing van enzymen kent een honderdjarige geschiedenis en enzymkatalyse wordt op grote schaal gebruikt in verschillende industrieën, zoals de voedingsmiddelen-, landbouw-, medische en chemische industrie, vanwege de hoge efficiëntie, hoge specificiteit en selectiviteit en milieuvriendelijkheid. ^[1-2]. Aangezien de industriële toepassingsomgeving sterk verschilt van de omgeving waarin enzymen in de natuur leven, komen de aard en katalytische functie van natuurlijke enzymen en hun toepassingsomgeving meestal niet overeen of zijn ze niet optimaal. In dit geval is het noodzakelijk om de natuurlijke aminozuursequentie van het enzym te wijzigen met behulp van enzymengineering om de prestaties te verbeteren. ^[3]. De meest gebruikte enzymengineeringstrategie is het samenstellen van mutatiebibliotheken voor screening, d.w.z. laboratoriumgerichte evolutie. ^[4]. Een van de noodzakelijke voorwaarden voor effectieve gerichte evolutie is dat de bibliotheekcapaciteit (d.w.z. het aantal mutanten in de bibliotheek) van de gescreende mutantbibliotheek voldoende groot is in verhouding tot het aandeel potentieel gunstige mutanten in de bibliotheek. De omvang van een mutantbibliotheek wordt vaak beperkt door de screeningmethode, de beschikbare middelen en andere objectieve omstandigheden. De belangrijkste vraag is hoe het percentage effectieve mutanten in de mutantbibliotheek kan worden verhoogd. Diepgaand inzicht in de relatie tussen enzymsequentie, structuur en belangrijke eigenschappen kan helpen om mutatie-hotspots te identificeren, de omvang van de mutatie te beperken en een kwalitatief goede mutantbibliotheek te ontwerpen. Computationele chemiemethoden zijn een belangrijk middel om dit inzicht te verkrijgen. Er is aangetoond dat op computationeel ontwerp gebaseerde eiwitmutatiebibliotheken het percentage effectieve mutanten met enkele orden van grootte kunnen verhogen ten opzichte van willekeurige mutatiebibliotheken. ^[5]. Voor sommige moeilijke onderwerpen op het gebied van enzym- of eiwitengineering kan de substantiële verbetering die computationele berekeningen kunnen opleveren voldoende zijn om het uiteindelijke succes of falen van het onderwerp te bepalen, dat niet langer beperkt is tot de verbetering van de efficiëntie. In feite hebben computationele chemie en computationele biologiemethoden het met succes mogelijk gemaakt om kunstmatige enzymen te ontwerpen met katalytische functies die natuurlijke enzymen niet bezitten. Aangezien andere besprekingen in dit album zijn gewijd aan methoden voor het geautomatiseerd optimaal ontwerpen van aminozuursequenties, zal dit artikel zich richten op computationele methoden voor het simuleren en analyseren van enzymen met een gegeven aminozuursequentie. Natuurlijk kunnen onderzoekers deze methoden gebruiken om wild-type en mutanten apart te bestuderen en vervolgens de resultaten te vergelijken.
De studie van eiwitten, vooral enzymen, is al lange tijd een belangrijk grensgebied van computationeel chemisch onderzoek. ^[6-8]. De belangrijkste methoden zijn moleculaire dynamica simulaties (klassieke MD) gebaseerd op klassieke moleculaire mechanica krachtvelden ^[9], kwantummechanica (QM) ^{[10] en} gecombineerde kwantummechanica/moleculaire mechanica (QM/MM) methoden ^[8,11-12], voorspelling van intermoleculaire complexen, d.w.z. moleculaire docking (Docking) ^{[13], en} polariseerbaar continuümmodel (PCM) om elektrostatische en oplosmiddeleffecten te kwantificeren [ ^14]. ) zoals het Poisson-Boltzmann model (PB) ^[14], en sommige modellen gebaseerd op geometrische eigenschappen. In dit artikel geven we een overzicht van elk van deze methoden vanuit twee perspectieven: ten eerste over de methoden zelf, inclusief de basisprincipes, originele rekenresultaten, toepasbaarheidsvoorwaarden en (potentiële) voor- en nadelen, enz.en ten tweede over hoe deze methoden gebruikt kunnen worden om engineering-relevante informatie te verkrijgen, zoals een beter begrip van katalytisch relevante mechanismen, theoretische voorspellingen of verklaringen van veranderingen in de eigenschappen of functies van verschillende mutanten ten opzichte van het wildtype, die als leidraad kunnen dienen voor het ontwerp van hoogwaardige mutatiebibliotheken voor gerichte evolutie, of het ontwerp van hoogwaardige mutatiebibliotheken, of het ontwerp van mutatiebanken. ontwerp van hoogwaardige mutatiebibliotheken, of het suggereren van specifieke mutatiesites en mutatietypen op basis van de analyse van ruwe computationele resultaten, enz.

1

Moleculaire dynamica simulatie (MD) gebaseerd op klassieke moleculaire mechanica krachtvelden (MM)

1.1

Inleiding tot de methode

We beschouwen voorlopig niet de chemische veranderingen die betrokken zijn bij enzymkatalyse, maar alleen de processen van conformatieveranderingen van het enzym, vorming en dissociatie van niet-covalente complexen tussen het enzym en de reactanten (of producten) als gevolg van moleculaire thermische beweging. Tijdens deze processen verandert de elektronische toestand van het molecuul niet (er worden bijvoorbeeld geen covalente bindingen verbroken of gemaakt) en is het molecuulmechanische krachtveldmodel van toepassing. Het zogenaamde moleculaire mechanica krachtveld is een empirische wiskundige functie die de afhankelijkheid van de potentiële energie van een moleculair systeem van de geometrische configuratie (d.w.z. de ruimtelijke coördinaten van alle atomen waaruit het moleculaire systeem bestaat) uitdrukt (Fig. 1A). Met andere woorden, als we X om de ruimtelijke coördinaten van alle atomen weer te geven en ^VMM (X ) om de potentiële energie van het moleculaire krachtveld weer te geven, verandert de potentiële energie als het molecuul van één conformatie verandert _X1 naar een ander _X2:
^∆VMM = ^VMM ( _X2 ) – ^VMM ( _X1 ).
Volgens de thermodynamische theorie zijn de atomen in een molecuul altijd in thermische beweging, dat wil zeggen, X verandert voortdurend met de tijd; bovendien bestaat het monster bij experimentele waarnemingen altijd uit een groot aantal moleculen (met uitzondering van experimenten met één molecuul), met verschillende moleculen in verschillende conformatietoestanden. Daarom moeten we vanuit kinetisch oogpunt rekening houden met de conformatieveranderingen in de tijd en vanuit thermodynamisch oogpunt met de kansverdeling van moleculen met verschillende conformaties. Moleculaire dynamica simulatie (MD) is het meest eenvoudige model om deze twee aspecten van eigenschappen te onderzoeken (Fig. 1B). In de MD simulatie starten we met een initiële conformatie, berekenen we de kracht die op elk atoom werkt op elk tijdstip op basis van de huidige conformatie en de potentiële energiefunctie (de kracht is de negatieve afgeleide van de potentiële energiefunctie met betrekking tot de coördinaten van de atomen), integreren we de bewegingsvergelijkingen van Newton numeriek om de conformatie op het volgende tijdstip te verkrijgen en herhalen we het proces om het traject van de conformatie-evolutie in de tijd te verkrijgen.
Daartussenin kunnen speciale algoritmen worden gebruikt om het effect van omgevingsfactoren (bijv. temperatuur, druk, enz.) op de moleculaire beweging te simuleren. Volgens het thermodynamische principe is de kansverdeling van de conformatie van hetzelfde molecuul op verschillende tijdstippen en de conformatie van verschillende moleculen in de thermodynamische evenwichtstoestand hetzelfde als het tijdsinterval lang genoeg is (tijdgemiddelde is dus gelijk aan systeemgemiddelde). Daarom kan, als de MD simulatie lang genoeg wordt uitgevoerd, de set van conformaties verkregen uit de simulatie gebruikt worden als een voorbeeld van de verdeling van moleculaire conformaties bij een bepaalde thermodynamische evenwichtstoestand. Gebaseerd op dit principe kunnen we willekeurige waarneembare eigenschappen van een systeem in zijn thermodynamische evenwichtstoestand analyseren op basis van de tijdstrajecten verkregen door MD.
MD biedt een krachtig computationeel hulpmiddel om het kinetische veranderingsproces van conformatieveranderingen en belangrijke microscopische kwantumthermodynamische verdelingen uitgebreid te analyseren bij atomaire resolutie, wat vooral belangrijk is voor het ophelderen van de ontwerpprincipes en werkingsmechanismen van complexe biomacromoleculaire machines zoals enzymen. Aangezien de huidige experimentele methoden voor macromoleculaire structuuranalyse alleen statische structuren met een spatio-temporele gemiddelde kunnen opleveren, hebben MD simulaties een onvervangbare functie in gerelateerd onderzoek. Onder deze vooronderstelling bevindt het MD gereedschap zelf zich nog steeds in een proces van continue verbetering en verfijning. Methodologisch komen de belangrijkste beperkingen van MD voort uit twee aspecten: ten eerste, de nauwkeurigheid van het moleculaire krachtveldmodel; en ten tweede, de beperkte simulatietijd maakt het moeilijk om de volledige bemonstering van de conformationele ruimte te realiseren. Voor het eerste probleem is het moleculaire krachtveld de afgelopen jaren sterk verbeterd en is de nauwkeurigheid van de thermodynamische beschrijving van het conformationele evenwicht van biologische macromoleculen, met name eiwitsystemen, vergroot. ^[15-16]. In termen van simulatietijd is het dankzij de ontwikkeling van computerhardware en -software nu mogelijk om simulaties in de orde van microseconden uit te voeren voor systemen van gebruikelijke grootte (bijvoorbeeld enzymmoleculen van honderden residuen in een waterige oplossing) met conventionele computerhardware (bijvoorbeeld multi-core servers die door de groep worden gebruikt). Op deze tijdschaal kunnen processen zoals het openen en sluiten van structurele domeinen of ringgebieden worden waargenomen. Als er meer rekenkracht beschikbaar is, kunnen ook directe simulaties van processen zoals substraatbinding/-dissociatie worden uitgevoerd. Om processen op tijdschalen buiten het bereik van de simulatie te bestuderen (bijv. grootschalige functionele veranderingen van allosterische eiwitten, enz. ^[17], op voorwaarde dat de gebruiker een grondiger begrip heeft van de MD-theorie.
Momenteel bestrijken de meeste MD simulatietoepassingen tijdschalen van nanoseconden tot microseconden, en het bemonsteren van de conformatieruimte is meestal beperkt tot de omgeving van de initiële structuur (voor eiwitten met één eiwitdomein is dit meestal de structurele stijging en daling van de RMS-verplaatsing in het 3-4 Å bereik). Daarom is het noodzakelijk om een redelijke beginstructuur te gebruiken als invoer voor de MD om de simulatieresultaten zinvol te laten zijn. In de meeste gevallen worden experimenteel bepaalde kristalstructuren of structuren gebaseerd op vergelijkende modellering van homologe eiwitten gebruikt als initiële structuren voor MD. Bij het simuleren van enzym-substraat complexen is het vaak nodig om de initiële structuur van het complex te modelleren op basis van de structuur van het lege enzym of van het enzym in complex met andere moleculen, hetzij door gebruik te maken van moleculaire docking of door andere kleine moleculen (bijv. remmers) in de kristalstructuur direct te vervangen door het substraat. MD simulaties vereisen ook de constructie van een moleculair krachtveld dat alle chemische eenheden in het systeem weergeeft. Wanneer het te simuleren systeem een kleine molecule als substraat bevat, is het vaak zo dat het standaard moleculaire krachtveld in het MD softwarepakket de kleine molecule als substraat niet dekt. In dit geval kan hulpprogrammatuur worden gebruikt die automatisch krachtvelden voor kleine moleculen kan genereren. ^[18-19]. De krachtveldbestanden moeten handmatig worden gecontroleerd en gebruikt voor korte simulatieproeven voordat de automatisch gegenereerde krachtvelden worden gebruikt voor lange MD-simulaties.

Fig. 1 Moleculair mechanisch krachtveld (A) en moleculaire dynamica simulatie (B)
Fig. 1 Moleculair mechanisch krachtveld (A) en moleculaire dynamica simulatie (B)

1.2

Toepassing bij enzymonderzoek

Informatie verkregen uit MD simulaties kan op verschillende manieren worden toegepast om enzyme engineering modificaties te begeleiden ^[20]. Door MD-simulaties bij kamertemperatuur en bij hoge temperatuur te vergelijken, kan bijvoorbeeld worden voorspeld welke gebieden van het enzymmolecuul waarschijnlijk de gevoeligste structurele stabiliteit voor omgevingstemperatuur hebben. Het introduceren van proline-puntmutaties, disulfidebindingen enz. in deze gebieden zou de hittebestendigheid van het enzym kunnen verbeteren. ^[21-24]. Een andere strategie om de stabiliteit te verbeteren is het ontwerpen van mutanten die meer oppervlaktewaterstof- en zoutbindingen vormen. ^[25-26]. Voordat dergelijke mutanten experimenteel worden gevalideerd, kunnen wild-type en mutanten parallel worden gesimuleerd om theoretisch te beoordelen of de mutatie het gewenste effect kan hebben. ^[27-28]. Naast temperatuur kan MD worden gebruikt om het effect te analyseren van veranderingen in omgevings-pH, oplosmiddelen, etc. op de eiwitconformatie en de stabiliteit ervan. ^[29-30].
Naast stabiliteit is MD toegepast om hotspotresidu's te voorspellen die de conformatiedynamica die samenhangt met substraatbinding/productvrijgave significant kunnen beïnvloeden. Dit biedt een basis voor het ontwerpen van mutaties of mutantbibliotheken die de substraatselectiviteit, reactieselectiviteit, productvrijgavesnelheid, enz. kunnen veranderen. ^[31-32]. Een van de manieren om substraat/reactie selectiviteit te bestuderen met MD is om de simulatieresultaten van enzym-substraat complexen met verschillende (begin)structuren te vergelijken en substraat of structurele toestanden met hogere affiniteit (of hogere reactiviteit) te voorspellen. Een rigoureuze kwantitatieve methode om affiniteit (of reactiviteit) te berekenen is vrije-energieberekeningen ^[33-34]. Vanwege de rekenintensieve aard van vrije-energieberekeningen gebruiken de meeste huidige toepassingen kwalitatieve methoden voor voorspelling: kwalitatief onderscheid van relatieve affiniteit kan gebaseerd zijn op de stabiliteit van de structuur van de complexen van kleine molecule-macromolecule, de gemiddelde intermoleculaire interactie-energie, enz., terwijl kwalitatief onderscheid van reactiviteit gebaseerd is op de relatieve geometrische configuratieverdeling van de katalytische en reactieve functionele groepen, enz. ^[35]. De resultaten van een dergelijke kwalitatieve discriminatie kunnen worden gebruikt als basis voor het ontwerpen van bibliotheken van gerichte evolutionaire sequenties. Daarnaast kunnen MD simulaties ook worden gebruikt om hotspot residuen rond de substraatbindings/product dissociatie porie te analyseren. ^[36-37]. Dit type toepassing omvat de simulatie van dissociatieroutes voor de dissociatie van kleine moleculen uit eiwitten, en als er problemen zijn met onvoldoende simulatietijdschalen, kunnen deze worden overwonnen met verbeterde bemonsteringstechnieken. ^[38-39].

2

Kwantummechanica (QM) en gecombineerde kwantummechanica/moleculaire mechanica (QM/MM) modellen

2.1

Inleiding tot de methode

Voor het simuleren van chemische stappen in enzymkatalyse, zoals het aanmaken en verbreken van covalente bindingen, elektronenoverdracht en sprongen tussen verschillende elektronische toestanden, zijn kwantummechanische (QM) modellen nodig. Momenteel worden QM modellen die vaak gebruikt worden in de computationele chemie ingedeeld in verschillende types zoals ab initio ( ab initio ), dichtheidsfunctionaaltheorie (DFT) en semi-empirische methoden ^[40]. Onder hen zijn semi-empirische methoden rekenkundig het minst duur. Het zijn echter niet-eerste-principe methoden en de betrouwbaarheid van de rekenresultaten is sterk afhankelijk van het specifieke systeem en probleem. Zowel ab initio als DFT methoden zijn eerste-principe methoden en zijn universeel. Praktische DFT modellen kunnen meer empirische theoretische benaderingen bevatten dan ab initio berekeningen, maar DFT kan elektronen correlatie energieën verwerken met een zeer hoge rekenefficiëntie. Bovendien zijn voor veel chemische reactieproblemen de rekenfouten van de beste DFT modellen voor belangrijke parameters zoals de energieveranderingen tijdens het reactieproces al zo klein als ongeveer 1 kcal/mol, en de resultaten zijn voldoende om gebruikt te worden als basis voor het bepalen van de chemische deugdelijkheid van een bepaald katalytisch mechanisme of reactietraject.
Gegeven de geometrische configuratie van een molecuul, kan de energie ervan worden berekend met behulp van QM. Dit staat bekend als een eenpuntsberekening (d.w.z. het gaat om slechts één punt in de geometrische configuratieruimte). Het QM-model wordt vaker gebruikt voor de optimalisatie van moleculaire geometrieën, d.w.z. om een lokaal stabiele structuur te vinden (met een lagere energie dan de naburige structuren) na opeenvolgende veranderingen van een beginconfiguratie, of om de paden met de laagste energie te vinden die de reactanten met de producten verbinden, en de overgangstoestanden langs de paden. Deze berekeningen zijn rekenintensief omdat verschillende geometrische configuraties in beschouwing genomen en vergeleken moeten worden en er typisch tienduizenden tot duizenden eenpuntsberekeningen uitgevoerd moeten worden. Een gebruikelijke strategie om rekenkracht te besparen is om eerst een groot aantal reactiepaden te optimaliseren met behulp van efficiënte QM-modellen met beperkte nauwkeurigheid, en dan de configuratieoptimalisatie te voltooien met behulp van modellen met hogere nauwkeurigheid in de buurt van de gezochte configuratie/pad met de laagste energie, of om eenpuntsberekeningen uit te voeren.
Momenteel is de toepassing van eerste-principe QM methoden op het hele enzymmolecuul rekenintensief, in principe beperkt tot enkelpuntsberekeningen, en nog steeds niet praktisch uitvoerbaar. Het QM/MM-model (Fig. 2) wordt vaak gebruikt voor grote moleculen. ^[11]. In dit model wordt het moleculaire systeem opgedeeld in ten minste twee delen: het deel dat direct betrokken is bij de chemische reactie wordt behandeld met het QM model, en de rest wordt behandeld met moleculaire mechanica (MM). Er zijn verschillende strategieën om om te gaan met QM-MM grenzen en interacties ^[41]. In eerste-principes QM/MM-modellen zijn QM-berekeningen veel duurder dan MM. Daarom worden meestal conformationele optimalisatiemethoden gebruikt voor het QM-gebied om de geometrie ervan te voorspellen of te simuleren, en kunnen moleculaire dynamica simulaties worden gebruikt om het MM-gedeelte te bemonsteren. ^[42]. Dit betekent dat de rekenresultaten gevoeliger kunnen zijn voor de beginstructuur van het QM-gebied van het systeem. In dit geval zijn berekeningen met verschillende modellen van de beginstructuur nodig om betrouwbare resultaten te verkrijgen. Als semi-empirische methoden ^{[43] of} empirische valentiebindingstheorieën ^[44-45] worden gebruikt voor het KM-gedeelte ^, kan het mogelijk zijn om de conformatieruimte vollediger te verkennen en het effect van de beginstructuur te verminderen door langere QM/MM MD bemonstering.

Fig. 2 Kwantummechanica (QM)/Moleculair Mechanica (MM) modellen
Fig. 2 Kwantummechanisch (QM)/moleculair mechanisch (MM) model.

2.2

Toepassing van de methode

^Beide het QM-model ^{[10] en} het QM/MM-model ^[41] zijn veel gebruikt voor theoretische voorspelling en het testen van de chemische mechanismen van enzym-gekatalyseerde reacties. Hun resultaten kunnen ons helpen om te bepalen welke belangrijke residuen deelnemen aan het chemische reactieproces, de snelheidslimiterende stap van de reactie te vinden, de structuur van reactie-intermediairen en overgangstoestanden te modelleren, te analyseren hoe ze interageren met de enzymomgeving, enz. Vergeleken met het QM-clustermodel kan het QM/MM-model de enzymomgeving waarin de chemische reactiecentra zich bevinden realistischer simuleren. QM/MM is op grote schaal gebruikt om het chemische mechanisme van enzymkatalyse theoretisch te voorspellen/testen en om de mogelijke effecten van aminozuurresiduen in de omgeving op het katalytische proces te analyseren en te voorspellen. ^[46]. In principe kunnen deze resultaten worden gebruikt als leidraad voor het ontwerp van gerichte evolutie mutatiebibliotheken met als doel de katalytische activiteit te verhogen en de specificiteit of selectiviteit te veranderen. Een meer uitdagende studie zou zijn om geheel nieuwe kunstmatige enzymen te verkrijgen op basis van het ontwerp van nieuwe actieve centra vanuit het niets op basis van QM of QM/MM voorspelde overgangstoestand structuurmodellen. ^[47].

3

Modellering van elektrostatische continuümmedia

3.1

Principe van de methode

Enzymkatalyse vindt bijna altijd plaats in een specifieke oplossingsomgeving. Effecten van oplosmiddelen hebben een cruciale invloed op de eigenschappen van enzymen. Modellen voor het berekenen van de oplosmiddeleffecten van chemische behandelingen vallen uiteen in twee categorieën: expliciete oplosmiddelmodellen, bijvoorbeeld in moleculaire mechanica krachtvelden of QM modellen, waarbij elk oplosmiddelmolecuul en elk atoom daarin expliciet wordt meegenomen in het model; en impliciete oplosmiddel- of continuümmediummodellen. ^{[48], waarbij} waarbij de oplosmiddelmoleculen en -atomen niet in het model zijn opgenomen en de zogenaamde "solvent mean fields" worden gebruikt om de effecten van oplosmiddelen te behandelen. waarbij de oplosmiddelmoleculen en -atomen niet in het model zijn opgenomen, maar de effecten van oplosmiddelen worden behandeld met een zogenaamd "solvent mean field". Het voordeel van het expliciete oplosmiddelmodel is dat het oplosmiddel en solvent op een volledig consistente manier kan behandelen, waarbij specifieke interacties zoals waterstofbruggen tussen oplosmiddel en solvent, zoutbruggen enzovoort realistisch worden gemodelleerd. Het nadeel is dat het aantal oplosmiddelmoleculen groot en rekenintensief is. Bovendien draagt de stochastische stijging van het oplosmiddel aanzienlijk bij aan de totale energie van het systeem, en er moet een lange simulatiemonstergemiddelde worden uitgevoerd om het effect van de stijging te elimineren. Het verborgen oplosmiddelmodel geeft het middelingseffect van het oplosmiddel weer en de thermodynamische stijging en daling van het oplosmiddel is gemiddeld.
Voor de eenvoud van de behandeling, scheiden we meestal het apolaire oplosmiddeleffect (hydrofoob effect) van het polaire oplosmiddeleffect in het verborgen oplosmiddelmodel. De ervaring heeft geleerd dat de vrije energie van solvatie van een niet-polaire opgeloste stof evenredig is met het oppervlak dat toegankelijk is voor oplosmiddelen (SASA). Daarom wordt voor deze component vaak het SASA-oplosmodel gebruikt. Parameters in dit model zijn de atomaire stralen die nodig zijn om de SASA te berekenen, de straal van het oplosmiddelmolecuul (1,4 Å voor watermoleculen) en een proportionaliteitsconstante voor de solvatatievrije energie die evenredig is met de SASA. Deze parameters worden over het algemeen bepaald door experimentele waarden van de oplosbaarheidsvrije energie van kleine moleculen te passen.
De meest gebruikte modellen om polaire oplosmiddeleffecten te overwegen behandelen het gebied bezet door het oplosmiddel als een continu medium met een specifieke diëlektrische constante (78,4 voor water), en het opgeloste gebied als bezet door een medium met een lage diëlektrische constante (meestal gewaardeerd op 2-8) of een vacuüm (diëlektrische constante van 1) (Fig. 3A). Het continue medium wordt gepolariseerd door het elektrostatische veld dat wordt opgewekt door de ladingsverdeling in het opgeloste gebied, en de resulterende gepolariseerde ladingsverdeling genereert op zijn beurt een elektrostatisch veld in het opgeloste gebied dat inwerkt op de lading van de opgeloste stof. Het elektrische veld dat wordt opgewekt door de gepolariseerde ladingen wordt het reactieveld genoemd. Daarom wordt het elektrostatische continue mediummodel ook wel het reactieveldmodel genoemd. In het continue mediummodel zonder vrije ionen in het oplosmiddelgebied voldoet de relatie tussen de ruimte-elektrostatische potentiaal en de ruimte-ladingsverdeling aan de Poisson vergelijking. Voor een oplossingsomgeving met vrije ionen wordt de ruimtelijke verdeling van ionen beïnvloed door de ruimtelijke elektrostatische potentiaal. Rekening houdend met deze factor voldoet de relatie tussen de ruimtelijke elektrostatische potentiaal en de ruimtelijke ladingsverdeling aan de Poisson-Boltzmann vergelijking (PB-vergelijking). De PB-vergelijking is een partiële differentiaalvergelijking betreffende de relatie tussen de verdeling van de elektrostatische potentiaal en de verdeling van de lading en diëlektricum in de driedimensionale ruimte, en kan numeriek opgelost worden. De meest gebruikelijke numerieke methode voor het oplossen van de PB-vergelijking voor macromoleculaire systemen zoals enzymen is de eindigeverschilmethode (FD), die gezamenlijk het FDPB-model wordt genoemd (figuur 3B). ^[14]. Met FDPB is het mogelijk om de elektrostatische potentiaal in drie dimensies te berekenen op basis van de ruimteladingsverdeling van de opgeloste stof, wat op zijn beurt de berekening van andere eigenschappen zoals de elektrostatische vrije energie mogelijk maakt. In QM berekeningen voor kleine molecule systemen wordt het reactieveld vaak gelijkwaardig vervangen door het elektrische veld dat wordt opgewekt door de oppervlakteladingsverdeling op het moleculaire oppervlak, en het bijbehorende model wordt het polariseerbare continue medium (PCM) model genoemd.
Het meest gebruikte model om rekening te houden met polaire oplosmiddeleffecten behandelt het gebied bezet door het oplosmiddel als een continu medium met een specifieke diëlektrische constante (78,4 voor water), terwijl het opgeloste gebied wordt behandeld alsof het wordt bezet door een medium met een lage diëlektrische constante (meestal gewaardeerd op 2-8) of een vacuüm (diëlektrische constante van 1) (Fig. 3A). Het continue medium wordt gepolariseerd door het elektrostatische veld dat wordt opgewekt door de ladingsverdeling in het opgeloste gebied, en de resulterende gepolariseerde ladingsverdeling genereert op zijn beurt een elektrostatisch veld in het opgeloste gebied dat inwerkt op de lading van de opgeloste stof. Het elektrische veld dat wordt opgewekt door de gepolariseerde ladingen wordt het reactieveld genoemd. Daarom wordt het elektrostatische continue mediummodel ook wel het reactieveldmodel genoemd. In het continue mediummodel zonder vrije ionen in het oplosmiddelgebied voldoet de relatie tussen de ruimte-elektrostatische potentiaal en de ruimte-ladingsverdeling aan de Poisson vergelijking. Voor een oplossingsomgeving met vrije ionen wordt de ruimtelijke verdeling van ionen beïnvloed door de ruimtelijke elektrostatische potentiaal. Rekening houdend met deze factor voldoet de relatie tussen de ruimtelijke elektrostatische potentiaal en de ruimtelijke ladingsverdeling aan de Poisson-Boltzmann vergelijking (PB-vergelijking). De PB-vergelijking is een partiële differentiaalvergelijking betreffende de relatie tussen de verdeling van de elektrostatische potentiaal en de verdeling van de lading en diëlektricum in de driedimensionale ruimte, en kan numeriek opgelost worden. De meest gebruikelijke numerieke methode voor het oplossen van de PB-vergelijking voor macromoleculaire systemen zoals enzymen is de eindigeverschilmethode (FD), die gezamenlijk het FDPB-model wordt genoemd (figuur 3B). ^[14]. Met FDPB is het mogelijk om de elektrostatische potentiaal in drie dimensies te berekenen op basis van de ruimteladingsverdeling van de vaste stof, wat op zijn beurt de berekening van andere eigenschappen zoals de elektrostatische vrije energie mogelijk maakt. In QM berekeningen van kleine moleculaire systemen wordt het reactieveld vaak gelijkwaardig vervangen door het elektrische veld dat wordt opgewekt door de oppervlakteladingsverdeling op het oppervlak van het molecuul, en het bijbehorende model wordt het polariseerbare continue medium (PCM) model genoemd.

Fig. 3 Elektrostatisch continuümmodel (A) en eindige-verschil Poisson-Boltzmann (FDPB) methode (B)
Fig. 3 Elektrostatisch continuümmodel (A) en de eindig-verschil Poisson-Boltzmann (FDPB) methode (B).

3.2

Toepassing van de methode

Een van de belangrijke toepassingen van het continuümmodel is het bestuderen van de protonatietoestand van geladen aminozuur zijketengroepen in enzymmoleculen. De software PROPKA voorspelt de pKa van elke scheidbare groep door de PB-vergelijking op te lossen om de elektrostatische vrije energie voor verschillende protonatietoestanden te berekenen ^[50]. De oppervlakte-elektrostatische potentiaalverdeling van een enzymmolecuul is een belangrijke factor die de substraatselectiviteit van het enzym beïnvloedt. Gegeven de ruimtelijke structuur en protonatietoestand van een enzymmolecuul kan de oppervlakte-elektrostatische potentiaalverdeling van een enzymmolecuul worden berekend met de FDPB-methode, die ook het effect voorspelt van mutaties in aminozuurresiduen of veranderingen in de omgevings-pH, veranderingen in ionconcentratie, enz. op de oppervlakte-elektrostatische potentiaal. ^[14].
Bij het bestuderen van de chemische stappen van enzymkatalyse met het QM-clustermodel is het vaak nodig om het PCM-model te gebruiken om de elektrostatische invloed van de omgeving op de reactiezone te simuleren. Als het reactieproces significante veranderingen in ladingsverdeling met zich meebrengt, zijn de resultaten van vacuüm QM berekeningen zonder het gebruik van een continu medium niet redelijk en kunnen zelfs leiden tot foutieve kwalitatieve conclusies. In het QM/MM model is het reactiecentrum over het algemeen omgeven door oplosbare moleculen die op de MM manier worden behandeld en is het over het algemeen niet nodig om het continue medium reactieveld te overwegen. Echter, als de netto lading van het systeem voor en na de reactie verandert (bijvoorbeeld bij redoxpotentiaalberekeningen), dan is het waarschijnlijk dat de bijdrage van de oplossingsomgeving buiten de systeemgrens aan de vrije energie van de reactie in rekening moet worden gebracht, en in dit geval kunnen de QM/MM resultaten worden gecorrigeerd met behulp van het continuüm medium model.
MM/PBSA is een methode die efficiëntie en nauwkeurigheid in balans brengt en kan worden gebruikt om de affiniteit van eiwit-eiwit en eiwit-kleine molecuul complexen te analyseren. ^[49]. Om fouten op te heffen is het gebruikelijk om expliciete moleculaire dynamica simulaties uit te voeren van de complexen om een verzameling conformaties te verkrijgen; voor elke complexe conformatie de MM/PBSA energie te berekenen van het complex als geheel en van elk monomeer waaruit het complex bestaat; en de vrije bindingsenergie te benaderen door het gemiddelde van het verschil tussen de MM/PBSA energie van het geheel en die van de monomeren voor de gehele conformatie te gebruiken. Deze methode kan worden gebruikt om hotspotresiduen te analyseren die de substraataffiniteit beïnvloeden en kan ook worden gebruikt om veranderingen in substraatselectiviteit in mutanten te voorspellen.

4

Andere methoden

4.1

Moleculair Docken

Docking verwijst naar het computationele proces van het voorspellen van de structuur (en affiniteit) van een complex op basis van de structuur van een monomeer. Docking van kleine molecule-eiwit is een centraal hulpmiddel voor structuurgebaseerde virtuele screening van geneesmiddelen, waarvoor verschillende algoritmen zijn ontwikkeld ^[13]. Deze algoritmen en modellen kunnen ook worden toegepast op het docken van substraat-enzymcomplexen. Virtueel screenen van geneesmiddelen vereist de beschouwing van een groot aantal verschillende kleine moleculen, en om redenen van computerefficiëntie worden de structurele veranderingen van de receptor (of alleen de zijketen) vaak niet meegenomen in moleculaire dockingberekeningen. In tegenstelling tot virtuele screening worden bij substraat-enzym dockingstudies vaak slechts één of enkele verschillende substraten beschouwd en kan in principe meer rekening worden gehouden met structurele veranderingen in het enzym. De meest eenvoudige manier om dit te bereiken is door verschillende enzymstructuren te verkrijgen met conformationele samplingmethoden zoals MD, die afzonderlijk aan het substraat worden gekoppeld. Bij substraat-enzym docking is het vaak ook mogelijk om de relatieve ruimtelijke rangschikking van substraat en katalytische functionele groepen te gebruiken om dockingresultaten te screenen/evalueren.

4.2

Voorspelling van poriën voor kleine moleculen op basis van geometrie

Talrijke experimentele studies hebben aangetoond dat sommige mutaties ver van het actieve centrum een grote invloed kunnen hebben op de katalytische prestaties van enzymen. De poriegrootte, fysisch-chemische eigenschappen van de residuen rond de porie, enz. kunnen de doorlaatbaarheid van substraat en product veranderen en de substraatselectiviteit beïnvloeden. Porievoorspellingsmethoden kunnen worden gebruikt om relevante hete residuen te vinden en een basis te leggen voor het ontwerp van gerichte evolutiebibliotheken. Er zijn verschillende geometrische structuurgebaseerde methoden beschikbaar om eiwitoppervlakteputjes, interne holtes, poriën die verschillende gebieden verbinden, enz. te voorspellen. ^[51-53]. Deze methoden gebruiken statische ruimtelijke structuren als invoer en maken meestal gebruik van geometrische en grafiektheoretische methoden om de voorspelling met hoge computerefficiëntie te realiseren.

4.3

Vergelijkingsmethoden voor actieve centra

Momenteel is een grote hoeveelheid 3D-structuurgegevens van enzymen met verschillende structuurtypes en -families verzameld in de Protein 3D Structure Database (PDB). Als we verschillende enzymen vergelijken, zullen we zien dat sommige een hoge mate van overeenkomst hebben in actieve centra (typische voorbeelden zijn de katalytische triade actieve centra gedeeld door serine proteasen), ook al zijn de algemene structurele sequenties niet vergelijkbaar. De methode om de structuur van actieve centra te vergelijken ^{[54-55] kunnen} worden gebruikt om automatisch de actieve centra van andere enzymen op te zoeken die lijken op het actieve centrum van het huidige enzym. Het stapelen van meerdere vergelijkbare actieve centra in de driedimensionale ruimte en het analyseren van de overeenkomsten en verschillen tussen verschillende actieve centra kan waardevolle informatie opleveren voor de selectie van mutatieplaatsen.

5

Samenvatting

Omwille van de overzichtelijkheid is onze introductie van de bovenstaande methoden gecategoriseerd. In de praktijk sluiten verschillende typen methoden elkaar niet uit. Ze kunnen op veel manieren in combinatie worden gebruikt om onze vragen beter te beantwoorden. Bijvoorbeeld, in simulaties van enzym-substraat complexen, kan moleculaire docking gebruikt worden om de initiële conformatie van de simulatie te verkrijgen; de set van conformaties verkregen uit MD simulaties kan gebruikt worden voor porievoorspellingsanalyse, moleculaire docking, QM/MM simulaties, enz.MM-modellen die de overgangstoestanden beschrijven die zijn verkregen uit QM- of QM/MM-modellen kunnen worden gebouwd en gebruikt voor langdurige klassieke MD-simulaties om de effecten van conformatiestijging en -daling op chemische processen te analyseren, of voor het simuleren van een groot aantal mutanten om virtuele screening van mutanten te realiseren op basis van MD-simulaties; de MM/PBSA-benadering, die we al hebben genoemd, is een combinatie van MD en continuüm medium modellering, enzovoort.
De studie van biomoleculaire systemen zoals eiwitten door middel van computationele scheikundige methoden heeft een geschiedenis van meer dan 40 jaar. Deze methoden worden steeds vaker gebruikt bij industrieel enzymonderzoek en ontwikkelen zichzelf voortdurend. China's onderzoeksteams op het gebied van zowel computationele chemie als industriële enzymtechnologie breiden zich uit en hun onderzoekscapaciteiten worden snel beter. De toepassing van computationele chemie in enzymtechnologie zal worden verbreed en verdiept naarmate de combinatie van deze twee disciplines steeds nauwer wordt. Eiwitengineering, gerichte evolutie en andere technieken hebben een grote invloed gehad op industrieel enzymonderzoek. De toekomstige ontwikkeling van computationele methoden, met name de doorbraak van nieuwe enzymontwerpmethoden, zal naar verwachting nieuwe technologische doorbraken opleveren voor industrieel enzymonderzoek in het tijdperk van de synthetische biologie.

Neem nu contact met ons op!

Als je Price nodig hebt, vul dan je contactgegevens in op het formulier hieronder. We nemen dan meestal binnen 24 uur contact met je op. Je kunt me ook een e-mail sturen info@longchangchemical.com tijdens kantooruren (8:30 tot 18:00 UTC+8 ma. ~ za.) of gebruik de live chat op de website voor een snel antwoord.

Samenstelling Glucoamylase	9032-08-0
Pullulanase	9075-68-7
Xylanase	37278-89-0
Cellulase	9012-54-8
Naringinase	9068-31-9
β-amylase	9000-91-3
Glucose-oxidase	9001-37-0
alfa-amylase	9000-90-2
Pectinase	9032-75-1
Peroxidase	9003-99-0
Lipase	9001-62-1
Katalase	9001-05-2
TANNASE	9025-71-2
Elastase	39445-21-1
Urease	9002-13-5
DEXTRANASE	9025-70-1
L-Lactische dehydrogenase	9001-60-9
Dehydrogenase malaat	9001-64-3
Cholesteroloxidase	9028-76-6