바이오 효소 생산 과정은 무엇인가요?

1. 효소 생산

효소는 미생물, 동물, 식물에서 생산되지만 주요 공급원은 미생물입니다. 미생물은 식물이나 동물에 비해 장점이 많기 때문에 일반적으로 우수한 효소 생산 균주를 선별하여 발효를 통해 효소를 생산합니다. 발효액의 효소 농도를 높이기 위해 우수한 균주를 선별하고, 유전자 조작 박테리아를 개발하며, 발효 조건을 최적화합니다. 산업 생산에는 고온 내성 α-아밀라아제, 알칼리성 내성 프로테아제, 리파아제 등과 같은 새로운 효소의 특별한 성능이 필요합니다. 따라서 특별한 성능을 가진 새로운 효소를 생산할 수 있는 균주를 연구하고 개발해야 합니다.

2. 효소 준비

효소 분리 및 정제 기술은 현재 생명공학 '후처리 공정'의 핵심입니다. 미생물 세포와 그 발효액 또는 동식물 세포와 그 배양액에서 다양한 분리 및 정제 기술을 사용하여 다양한 순도의 고 활성 효소 제제로 만든 효소의 분리 및 정제에서 효소 제제를 국가 경제의 모든 측면에서 더 널리 사용하려면 효소 제제의 활성, 순도 및 수율을 개선해야하므로 새로운 분리 및 정제 기술을 연구해야합니다.

3. 효소 및 세포 고정화

효소 및 세포 고정화 연구는 효소공학의 핵심 과제입니다. 효소의 안정성을 향상시키고, 효소 제제를 재사용하고, 효소 제제의 적용 범위를 확대하기 위해 효소 고정화를위한 다양한 고정화 방법, 고정화 포도당 이성질체 효소, 고정화 카바 모일 라제 등과 같은 고정화 효소의 준비, 고정화 효소의 결정 및 연구 개발의 다양한 측면의 적용을위한 고정화 효소를 사용하여 고정화 효소의 적용 범위를 확장합니다. 고정화 효소는 여전히 강력한 생명력을 가지고 있습니다. 생화학, 화학공학, 미생물학, 고분자 및 의학 등 다양한 분야에서 높은 가치를 인정받고 있습니다.

고정화 세포는 고정화 효소를 기반으로 개발됩니다. 다양한 고정화 방법을 사용하여 미생물 세포, 동물 세포 및 식물 세포를 고정화하여 다양한 고정화 생물학적 세포를 만듭니다. 고정화 세포의 효소적 특성, 특히 동역학적 특성에 대한 연구와 다양한 응용 분야에서 고정화 세포의 연구 및 개발은 오늘날 효소 공학에서 뜨거운 주제입니다.

고정화 기술은 효소 기술 현대화의 중요한 이정표이며, 산업 응용에서 천연 효소의 단점을 극복하고 효소 반응의 특성을 최대한 발휘할 수 있는 획기적인 기술입니다. 고정화 기술의 발전 없이는 현대 효소 기술은 없다고 할 수 있습니다.

4. 효소 분자 변형

효소 분자 변형이라고도 합니다. 효소의 안정성을 향상시키고, 항원성을 줄이고, 체내 약용 박테리아의 반감기를 연장하기 위해 다양한 변형 방법을 사용하여 효소 분자의 구조를 수정하여 천연 효소를 만들기 위해 우수한 특성 (예 : 높은 안정성, 항원성 없음, 프로테아제 가수 분해에 대한 내성 등)이 없으며 새로운 효소 활동을 생성하여 효소의 적용을 확대하여 효소 적용의 가치를 높이고 경제적 및 사회적 이익을 더 많이 달성합니다. 그리고 사회적 이익.

효소 분자 변형은 두 가지 측면에서 수행할 수 있습니다:

(1) 단백질 공학 기술을 사용하여 효소 분자 구조 유전자를 변형하여 합리적인 기본 구조와 공간 구조를 가진 우수한 특성과 높은 활성을 가진 새로운 효소(돌연변이 효소)를 얻을 수 있을 것으로 기대합니다.

(2) 효소 단백질의 1차 구조의 화학적 또는 효소적 변형 또는 측쇄기의 화학적 변형을 통한 효소 분자의 화학적 변형. 효소 특성을 변경하기 위해. 이러한 효소는 효소학 및 의학의 기초 연구에 특히 유용합니다.

효소 생산에 사용되는 미생물은 사상균, 효모, 박테리아의 세 가지 주요 그룹으로 주로 호기성 박테리아가 있습니다. 몇 가지 주요 산업용 효소의 균주와 용도는 다음과 같습니다:

아밀라아제

아밀라아제는 전분을 가수분해하여 페이스트 몰트 올리고당과 말토오스를 생성합니다. 생산은 바실러스 속의 바실러스 서브틸리스와 바실러스 리체니포르미스를 이용한 심층 발효가 주를 이루며, 후자는 내열성 효소를 생성합니다. 아스 페르 길 루스와 리조 푸스 균주를 사용한 심층 및 반고체 발효도 식품 가공에 사용됩니다 [6] . 아밀라아제는 주로 설탕 생산, 섬유 탈수, 발효 원료 처리 및 식품 가공에 사용됩니다. 글루코아밀라아제는 전분을 포도당으로 가수분해할 수 있으며, 현재 아스퍼질러스 니거의 심층 발효로 거의 전량 생산되며 설탕 생산, 알코올 생산 및 발효 원료 가공에 사용됩니다.

프로테아제

균주의 사용과 가장 다양한 종류의 생산. 이끼 모양의 바실러스, 짧은 작은 바실러스 및 고초균을 사용하여 박테리아 프로테아제의 심층 발효 생산; 스트렙토마이세스, 아스퍼질러스 심층 발효 생산으로 가죽 탈모, 모피 연화, 제약, 식품 산업에 사용되는 중성 프로테아제 및 아스퍼질러스 산성 프로테아제; 원래 송아지의 위장에서 추출한 레넷 대신 치즈 제조에서 레넷의 반고형 발효 생산에 일부 박테리아가 사용되는 Trichoderma spp를 통해 생산합니다.

포도당 이성질체 분해 효소

70년대에 급속히 발전한 종입니다. 스트렙토마이세스 세포는 먼저 깊은 발효에 의해 얻어지고 고정화 후 포도당 용액은 자당 대신 식품 산업에서 사용할 수있는 약 50% 과당을 포함하는 시럽으로 전환됩니다. 아밀라아제, 글루코아밀라아제 및 포도당 이성질화 효소 등을 통해 옥수수 전분을 시럽으로 만드는 것이 신흥 설탕 산업 중 하나가되었습니다.

표현식 시스템 선택
1 대장균 발현 시스템
①pET 발현 시스템 선호
단백질 재조합 발현 및 정제는 가용화 태그를 사용하여 수행 할 수 있으며, MBP가 우선적으로 선호됩니다.
BL21(DE3), TB 배지 37°에서 1-1.5 OD까지 성장, 18℃에서 1시간 동안 3 OD까지 성장, 0.5mM IPTG에서 19시간 동안 OD 최대 10까지 유도하는 pET24 또는 pET28(정제가 필요한 경우)을 선호합니다.
높은 발현과 낮은 용해도에 대한 구제 조치: 15℃까지 냉각, 2xYT 또는 ZYP5052(자가 유도)로 배지 변경, 발현 숙주 변경, N-말단 및/C-말단 2-10 아미노산 잔기의 절단, MBP와 같은 고용해성 단백질과 융합하여 발현, 화학적으로 분자 샤페론 유도, 분자 샤페론/상호 작용 단백질의 공동 발현 또는 리간드 제공 등. ④ 발현이 높지만 용해도가 낮은 경우.
대장균 발현 시스템의 장단점 ⑤ 대장균 발현 시스템의 장단점
장점: 가장 편리하고, 가장 효과적
단점: 약한 분비물 발현 능력, 이황화 결합 형성의 어려움, 번역 후 변형 없음

2 효모 발현 시스템(피크로스포룸)
장점 : 외인성 유전자의 안정적인 통합; 알코올 산화 효소 유전자의 프로모터가 강하고 메탄올에 의해 발현이 엄격하게 조절 될 수 있음; 재조합 단백질은 세포 내 또는 세포 외 형태로 발현 될 수 있음; 진핵 생물 발현 시스템에 공통된 번역 후 변형 기능을 포함; 작동하기 쉬운 상용 숙주 / 벡터가 있으며 증폭이 용이하며 발효 밀도가 매우 높습니다.
단점: 번역 후 처리의 독특한 형태, 과도한 글리코실화 문제.

3 첫 번째 선택은 문헌에 보고된 발현 시스템, 두 번째 선택은 대장균 시스템, 대장균에서 발현이 비활성 상태인 경우 효모 시스템을 사용합니다. 발현 시스템을 결정하기 위해 유전자의 출처에 따라 유전자에 친화성 태그를 추가하여 정제를 용이하게 합니다.

효소 변형
합리적인 설계: 코딩 유전자 변화 및 재조합 발현 테스트에 대한 단백질 구조 및 기능 정보를 기반으로 합니다.
절차: 먼저 BRENDA 데이터베이스에서 효소 구조를 얻은 다음, 효소 구조를 수정하고 Alphafold2로 효소 구조를 예측한 다음, PyMOL 소프트웨어로 효소와 리간드 분자 간의 도킹 분석을 수행하고, 마지막으로 새로운 효소 구조에 따라 유전자 서열을 방향으로 돌연변이시킨 다음 재조합 발현하여 새로운 효소를 얻습니다 (효소의 열 안정성, 촉매 효율 및 기질 특이성 향상).
비합리적인 설계: 코딩 서열의 고빈도 돌연변이 또는 재조합, 재조합 발현 및 높은 처리량 테스트

초기 설계 프로세스: 1. 역장 개발 및 샘플링 알고리즘 2. 높은 처리량 테스트 3. 구조 식별

단백질의 직접적인 진화
원본 유전자 선택
다양성 유전자 변이 라이브러리 구축 ②다양성 유전자 변이 라이브러리 구축
여러 개의 돌연변이 유전자를 벡터에 연결하여 해당 균주에서 각각 발현시킵니다.
스크리닝을 통해 고품질의 돌연변이 유전자를 선별한 후, 돌연변이 유전자를 대량으로 발현시킵니다.

돌연변이 유전자 라이브러리 생성 방법
생체 내 고주파 무작위 돌연변이: 대장균 XL1-Red를 유전자 복제 숙주로 사용(DNA 손상 복구 시스템 결함)
정체기까지 배양된 경우, 평균 2Kb에서 1개의 염기 변이가 발생합니다.
랜덤 돌연변이 유발 키트: 돌연변이율 0.1~1.6% /PCR, 1-16 염기 돌연변이/유전자에 해당
포인트별 포화 돌연변이 유발 ③ 포인트별 포화 돌연변이 유발

자연 진화: 자발적 돌연변이, 재조합, 자연 선택
농업의 진화: 자연 돌연변이, 육종, 스크리닝
실험실의 진화: 가속화된 돌연변이 속도, 분자 육종, 스크리닝

DNA 셔플링
단백질 공학 실험 전략
비활성화 시스템 및/또는 스크리닝 방법을 설정하기 위해 시작 유전자를 선택합니다.
구조-기능 관계를 알고 있는 경우 합리적인 설계 방법을 먼저 채택합니다.
무작위 돌연변이 미세 조정 및 높은 처리량 스크리닝
적합한 시작 유전자가 없는 경우에만 처음부터 설계합니다.

단백질 연구 기술
1 단백질 분리 및 정제와 관련된 물리적 및 화학적 특성
분자 크기(투석, 한외 여과, 겔 여과, 원심분리)
분자 형태(구배 원심분리, 전기영동) ②분자 형태(구배 원심분리, 전기영동)
(iii) 전하 특성(전기영동, 이온 교환 크로마토그래피)
(iv) 가용화 특성(염분화, 유기 용매 침전)
리간드에 대한 특이적 결합의 차이(면역 친화성 크로마토그래피, 생체 친화성 크로마토그래피, 금속 킬레이트 친화성 크로마토그래피)
(vi) 흡착 특성(소수성 크로마토그래피)
(vii) 변성 및 변질(요소의 변성 및 변질)

2 단백질 발현 시스템
박테리아 발현 시스템: 짧은 주기, 고효율, 저비용이지만 번역 후 변형이 없습니다. 주로 원핵생물 단백질, 단순 진핵생물 단백질 생산에 사용됩니다.
표현식 벡터 선택: 펫 시리즈, pGEX 시리즈, PQE30......
발현 균주 선택: BL21(DE3), 로제타, M15......
유도 조건: IPTG 농도, 온도 및 지속 시간
정화: Ni-NTA(His 태그), 스트렙-비즈, GST.....

효모 발현 시스템: 짧은 주기, 고효율, 저비용, 번역 후 변형이 존재합니다. 부적절한 글리코실화, 높은 만노스 변형이 있을 수 있습니다. 주로 세포 내/분비 단백질, 이황화 결합 단백질, 당화 단백질 생산에 사용됩니다.

(iii) 박테리오파지 발현 시스템: 높은 유전자 용량, 단백질 용해성, 독성 단백질 생산에 적합, 포유류와 유사한 번역 후 변형. 배양 조건이 가혹하고 일부 글리코실화 변형이 부족합니다. 주로 막 단백질, 대형 단백질, 바이러스 백신, 신호 단백질, 사이토카인, 키나아제 생산에 사용됩니다.
바쿨로바이러스 게놈은 최대 38KB의 외인성 유전자 삽입을 위한 거대한 용량을 가지고 있습니다.
바쿨로바이러스는 곤충 세포에서 생성되며 포유류 세포에서는 복제되지 않습니다.
장점: 바큘로바이러스는 원시 세포와 줄기세포를 포함한 포유류 세포주에서 효율적으로 형질 전환할 수 있습니다.
안전성(포유류 세포에서 복제되지 않음) 및 관찰 가능한 세포 병리 효과 없음
냉동 보관된 전이 전 세포도 시험 준비 세포로 사용할 수 있습니다.
휴대성(약리학적으로 관련된 세포 유형 분석용)
테스트 개발 속도(안정적인 세포주를 생성하는 데 시간을 소비할 필요가 없음)

포유류 발현 시스템: 긴 주기 시간, 낮은 효율성, 번역 후 변형의 존재, 높은 단백질 생리 활성. 주로 복잡한 진핵생물 단백질, 정밀한 PTM이 필요한 단백질을 생산하는 데 사용됩니다.
단백질의 일시적 발현: PEI 또는 리포좀 감염 시약
안정적인 세포주 개발: Flp-In™ Jump-In™ 세포 엔지니어링 플랫폼
유도 발현: 테트라사이클린으로 조절되는 발현
바이러스 전달 매개 발현: 기능 분석을 위한 렌티바이러스 발현 시스템, 단백질 생산을 위한 아데노바이러스 발현 시스템

3 단백질 정제
단백질을 정제해야 하는 이유는 무엇인가요?
관심 있는 단백질의 구조와 기능을 특성화합니다.
(ii) 단백질 조절 및 단백질 상호작용을 연구하기 위해
항체 생성 ③ 항체 생성
정화 방법
물리적/화학적 특성 기반
단백질 크기: 투석, 한외 여과, 겔 여과 크로마토그래피
단백질 전하: 이온 교환 크로마토그래피
단백질 소수성: 소수성 상호 작용 크로마토그래피

생물학적 특성 기반: 친 화성 크로마토그래피

투석
영향 요인: 투석 튜브 MWCO, 버퍼 용량, 투석 시간, 투석 버퍼 교체 빈도

한외 여과
원심 여과, 단백질 크기가 필터 튜브의 기공 크기보다 작으면 튜브 바닥으로 원심 분리됩니다.

겔 여과 크로마토그래피 ③ 겔 여과 크로마토그래피
크기가 다른 단백질 분리

이온 교환 크로마토그래피 ④
양이온 교환 컬럼: 젤은 음전하, 단백질은 양전하를 띕니다.
음이온 교환 컬럼: 젤은 양전하를 띠고 단백질은 음전하를 띕니다.
Medium
불활성 지원: 아가로스, 덱스트란
하전 그룹: 카르복시메틸: 음전하, 디에틸아미노: 양전하
균형 이온: 음전하를 띤 그룹: H+ 또는 Na+ 양전하를 띤 그룹: OH- 또는 Cl-
염 농도를 높이거나 pH를 변경하여 단백질을 단계적 또는 구배로 용출합니다.

친 화성 크로마토그래피 ⑤
친 화성 크로마토그래피는 생체 분자와 다른 물질 간의 매우 특정한 고분자 결합 상호 작용을 기반으로 혼합물에서 생체 분자를 분리하는 방법입니다.
예를 들면 항원과 항체의 결합, 리간드와 효소의 결합, 글루타치온과 GST 융합 단백질의 결합, 비오틴 결합 분자에 대한 항비오틴 단백질의 결합, 폴리히스티딘 융합 단백질에 대한 금속 이온의 결합 등이 있습니다.

폴리-(His)에 결합된 금속 이온(Ni 2+; Co 2+; Cu 2+)을 사용하는 고정화 금속 킬레이트 크로마토그래피(IMAC) ₆ 태그가 지정된 단백질.

연쇄상구균 태그 단백질 정제
비드는 스트렙 태그가 있는 단백질을 특이적으로 흡착할 수 있으며, 비오틴을 사용하면 비드에서 단백질을 용출할 수 있습니다. (원리는 GST 풀다운 실험과 유사합니다.)

단백질A/단백질 G 친화성 크로마토그래피
유전자 조작된 단백질 A와 단백질 G는 포유류 IgG의 Fc 영역에 특이적으로 결합할 수 있습니다. 단백질 A와 단백질 G를 컬럼 물질에 결합시킴으로써 IgG와 그 하위 클래스 및 단편은 친화성 크로마토그래피로 정제할 수 있습니다.
단백질 A: 분자량은 42kDa이며, 스파 유전자에 의해 암호화되며, 각각 3개의 알파 나선으로 구성된 5개의 동형 면역글로불린 결합 구조 도메인을 가지고 있습니다.
단백질 G: spg 유전자에 의해 코딩된 분자량 65kDa의 단백질로, 항체의 Fc 및 Fab 세그먼트와 혈청 내 알부민에 결합합니다. 유전자 조작 단백질 G는 알부민과 결합하는 유전자 조작 단백질로, 알부민 결합 부위를 제거하고 단백질 A보다 더 강력한 Fc 결합 도메인만 유지합니다.
단백질A/단백질G: 유전자 조작된 결합 단백질입니다. 4개의 단백질 A와 2개의 단백질 G 면역글로불린 결합 도메인으로 구성되어 있으며, 단백질 A 또는 단백질 G 단독보다 결합 범위가 더 넓고 두 단백질의 장점을 하나로 결합하여 거의 모든 종의 IgG 정제에 적용할 수 있습니다.

정제된 단백질은 어떻게 식별하나요?
SDS-PAGE; HPLC; 질량 분석법; 웨스턴 블롯; 결합 분석; 기능 분석; 구조 규명.

4 전자 현미경
단일 입자 극저온 전자 현미경(단일 입자 분석, SPA)
극저온 전자 단층 촬영 현미경(cryo-ET)

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