산업 효소 연구에서의 계산 화학 접근 방식은 무엇인가요?

이 논문은 분자 역학 힘장 및 분자 역학 시뮬레이션, 양자역학 및 양자역학/분자 역학 결합 모델링, 연속체 정전기 모델링 및 분자 도킹을 포함하여 산업 효소 연구, 특히 효소 공학 안내를 위해 사용되는 주요 계산 화학 방법을 소개합니다. 이러한 방법들은 각각 두 가지 관점에서 요약되어 있습니다: 첫째, 방법 자체의 기본 개념, 원래 계산의 결과, 적용 가능 조건 및 장단점, 둘째, 계산에서 얻은 유용한 정보를 통해 돌연변이 및 돌연변이 라이브러리의 설계를 안내합니다.

효소의 산업적 응용은 100년의 역사를 가지고 있으며 효소 촉매는 고효율, 높은 특이성 및 선택성, 환경 친화성으로 인해 식품, 농업, 의학 및 화학 산업과 같은 다양한 산업에서 널리 사용되고 있습니다. ^[1-2]. 산업 응용 환경은 효소가 자연에서 살아가는 환경과 크게 다르기 때문에 천연 효소의 특성과 촉매 기능 및 응용 환경이 일반적으로 일치하지 않거나 최적이 아닙니다. 이 경우 효소의 성능을 향상시키기 위해 효소 공학의 도움으로 효소의 천연 아미노산 서열을 수정할 필요가 있습니다. ^[3]. 가장 일반적으로 사용되는 효소 엔지니어링 전략은 스크리닝을 위한 돌연변이 라이브러리 구축, 즉 실험실 주도 진화입니다. ^[4]. 효과적인 직접 진화를 위한 필수 전제 조건 중 하나는 스크리닝 중인 돌연변이 라이브러리의 라이브러리 용량(즉, 라이브러리에 포함된 돌연변이의 수)이 라이브러리 내 잠재적으로 유익한 돌연변이의 비율에 비해 충분히 크다는 것입니다. 돌연변이 라이브러리의 크기는 스크리닝 방법, 사용 가능한 리소스 및 기타 객관적인 조건에 의해 제한되는 경우가 많습니다. 핵심 문제는 돌연변이 라이브러리에서 효과적인 돌연변이의 비율을 높이는 방법입니다. 효소 서열, 구조 및 중요한 특성 간의 관계를 심층적으로 이해하면 돌연변이 핫스팟을 식별하고 돌연변이 범위를 제한하며 양질의 돌연변이 라이브러리 설계를 실현하는 데 도움이 될 수 있습니다. 전산 화학 방법은 이러한 이해를 얻는 중요한 수단입니다. 계산 설계를 기반으로 한 계산 설계 단백질 돌연변이 라이브러리는 무작위 돌연변이 라이브러리에 비해 효과적인 돌연변이의 비율을 몇 배나 높일 수 있는 것으로 나타났습니다. ^[5]. 일부 어려운 효소 공학이나 단백질 공학의 경우, 계산이 가져올 수 있는 상당한 개선은 더 이상 효율성 향상에 국한되지 않고 궁극적인 성패를 결정할 수 있을 만큼 충분할 수 있습니다. 실제로 계산 화학과 계산 생물학 방법은 자연 효소가 갖지 못한 촉매 기능을 가진 인공 효소를 처음부터 설계하는 데 성공했습니다. 다른 리뷰에서는 아미노산 서열의 최적 설계를 자동화하는 방법에 대해 다루었으므로 이 논문에서는 주어진 아미노산 서열을 가진 효소를 시뮬레이션하고 분석하는 계산 방법에 초점을 맞출 것입니다. 물론 연구자들은 이러한 방법을 사용하여 야생형과 돌연변이를 개별적으로 연구한 다음 결과를 비교할 수 있습니다.
단백질, 특히 효소에 대한 연구는 오랫동안 계산 화학 연구의 중요한 영역이었습니다. ^[6-8]. 주요 방법으로는 고전 분자 역학 역장 기반의 분자 역학 시뮬레이션(고전 MD)이 있습니다. ^[9], 양자 역학(QM) ^{[10] 및} 양자 역학/분자 역학(QM/MM) 결합 방법 ^[8,11-12], 분자 간 복합체 예측, 즉 분자 도킹(도킹) ^{[13], 그리고} 정전기 및 용매 효과를 정량화하기 위한 편광 연속체 모델(PCM) [ ^14]. 푸아송-볼츠만 모델(PB)과 같은) ^[14], 그리고 기하학적 속성에 기반한 일부 모델입니다. 이 백서에서는 첫째, 기본 원리, 독창적인 계산 결과, 적용 가능성 조건, (잠재적인) 장단점 등 방법 자체에 대한 개요를 두 가지 관점에서 살펴보고, 둘째, 이러한 방법을 사용하여 촉매 관련 메커니즘에 대한 더 깊은 이해와 이론적 예측 또는 설명과 같은 엔지니어링 관련 정보를 얻는 방법에 대해 설명합니다.둘째, 이러한 방법을 사용하여 촉매 관련 메커니즘에 대한 더 깊은 이해, 야생형에 대한 다양한 돌연변이의 특성 또는 기능 변화에 대한 이론적 예측 또는 설명과 같은 공학 관련 정보를 얻는 방법, 즉 유도 진화를 위한 고품질 돌연변이 라이브러리 설계 또는 고품질 돌연변이 라이브러리 설계 또는 돌연변이 은행 설계, 원시 계산 결과 분석을 기반으로 특정 돌연변이 부위 및 돌연변이 유형 제안 등에 대해 설명합니다.

1

고전 분자 역학 역장(MM)에 기반한 분자 역학 시뮬레이션(MD)

1.1

방법 소개

당분간 효소 촉매와 관련된 화학적 변화는 고려하지 않고 분자 열 운동으로 인한 효소의 형태 변화, 효소와 반응물(또는 생성물) 사이의 비공유 복합체 형성 및 해리 과정만 고려합니다. 이러한 과정에서 분자의 전자 상태는 변하지 않으며(예: 공유 결합이 끊어지거나 생성되지 않음), 분자 역학 힘장 모델이 적용됩니다. 소위 분자 역학 힘장은 분자 시스템의 위치 에너지가 기하학적 구성(즉, 분자 시스템을 구성하는 모든 원자의 공간 좌표)에 의존하는 것을 표현하는 경험적 수학적 함수입니다(그림 1A). 즉, 우리가 X 를 사용하여 모든 원자의 공간 좌표를 나타내고 ^VMM (X )를 사용하여 분자력장 포텐셜 에너지를 나타내며, 분자가 한 형태에서 다른 형태로 변화함에 따라 포텐셜 에너지가 변화합니다. _X1 다른 _X2:
^∆VMM = ^VMM ( _X2 ) – ^VMM ( _X1 ).
열역학 이론에 따르면 분자의 원자는 항상 열 운동을 하고 있습니다, X 는 시간에 따라 끊임없이 변화하며, 실험 관찰을 할 때 시료는 항상 여러 분자로 구성되며(단일 분자 실험 제외), 서로 다른 형태 상태의 분자가 존재합니다. 따라서 운동학적 관점에서는 시간에 따른 형태 변화를 고려해야 하고, 열역학적 관점에서는 서로 다른 형태를 가진 분자의 확률 분포를 고려해야 합니다. 분자 역학 시뮬레이션(MD)은 이러한 두 가지 측면의 특성을 조사할 수 있는 가장 간단한 모델입니다(그림 1B). MD 시뮬레이션에서는 초기 형태에서 시작하여 현재 형태와 위치 에너지 함수(힘은 원자의 좌표에 대한 위치 에너지 함수의 음의 미분)를 기반으로 각 시점의 각 원자에 작용하는 힘을 계산하고, 뉴턴의 운동 방정식을 수치적으로 통합하여 다음 시점의 형태를 구한 후 이 과정을 반복하여 시간에 따른 형태 변화의 궤적을 얻습니다.
그 사이에 특수 알고리즘을 사용하여 환경 요인(예: 온도, 압력 등)이 분자 운동에 미치는 영향을 시뮬레이션할 수 있습니다. 열역학적 원리에 따르면 시간 간격이 충분히 길면 서로 다른 시점에서 동일한 분자의 형태와 열역학적 평형 상태의 다른 분자의 형태 확률 분포가 동일합니다(즉, 시간 평균은 시스템 평균과 동일합니다). 따라서 MD 시뮬레이션을 충분히 오랜 시간 동안 수행하면 시뮬레이션에서 얻은 일련의 형태를 특정 열역학적 평형 상태에서의 분자 형태 분포의 샘플로 사용할 수 있습니다. 이 원리를 바탕으로 MD에서 얻은 시간 궤적을 기반으로 열역학적 평형 상태에서 시스템의 임의의 관찰 가능한 특성을 분석할 수 있습니다.
MD는 형태 변화의 운동학적 변화 과정과 중요한 미시적 양자 열역학적 분포를 원자 해상도에서 종합적으로 분석할 수 있는 강력한 계산 도구를 제공하며, 이는 효소와 같은 복잡한 생체 거대 분자 기계의 설계 원리와 작동 메커니즘을 밝히는 데 특히 중요한 역할을 합니다. 현재 고분자 구조 분석을 위한 실험적 방법은 시공간적으로 평균화된 정적 구조만을 제공할 수 있기 때문에, MD 시뮬레이션은 관련 연구에서 대체 불가능한 기능을 가지고 있습니다. 이러한 전제 하에 MD 도구 자체는 여전히 지속적인 개선과 개선의 과정에 있습니다. 방법론적으로 MD의 주요 한계는 첫째, 분자력장 모델의 정확성, 둘째, 제한된 시뮬레이션 시간으로 인해 형태 공간의 전체 샘플링을 실현하기 어렵다는 두 가지 측면에서 비롯됩니다. 첫 번째 문제의 경우, 분자력장은 최근 몇 년 동안 크게 개선되어 생물학적 거대 분자, 특히 단백질 시스템의 형태 평형에 대한 열역학적 설명의 정확도가 향상되어 헤드 폴딩 과정에서 자연 구조에 이르기까지 다양한 단백질 분자를 성공적으로 시뮬레이션할 수 있게 되었습니다. ^[15-16]. 시뮬레이션 시간의 경우, 컴퓨터 하드웨어 및 소프트웨어의 발달로 인해 기존 컴퓨팅 하드웨어(예: 그룹에서 사용하는 멀티코어 서버)를 사용하여 일반적인 크기의 시스템(예: 수용액 내 수백 개의 잔기로 이루어진 효소 분자)에 대해 마이크로초 단위로 시뮬레이션을 수행할 수 있게 되었습니다. 이 시간 규모에서는 구조 도메인이나 고리 영역의 개방 및 폐쇄와 같은 과정을 관찰할 수 있습니다. 더 많은 컴퓨팅 리소스를 사용할 수 있다면 기판 결합/해체와 같은 프로세스를 직접 시뮬레이션할 수도 있습니다. 시뮬레이션이 도달할 수 없는 시간 규모(예: 알로스테릭 단백질의 대규모 기능 변화 등)의 프로세스를 연구하려면 향상된 샘플링 방법을 사용할 수 있습니다. ^[17], 사용자가 MD 이론에 대해 더 깊이 이해하고 있다는 전제하에 말이죠.
현재 대부분의 MD 시뮬레이션 애플리케이션은 나노초에서 마이크로초까지의 시간 범위를 다루며, 형태 공간의 샘플링은 대부분 초기 구조 부근으로 제한됩니다(단일 도메인 단백질의 경우 일반적으로 3-4Å 범위에서 루트-평균 제곱(RMS) 변위의 구조적 상승과 하강). 따라서 시뮬레이션 결과가 의미 있는 결과를 얻으려면 합리적인 초기 구조를 MD에 입력으로 사용해야 합니다. 대부분의 경우 실험적으로 결정된 결정 구조 또는 상동 단백질의 비교 모델링에 기반한 구조가 MD의 초기 구조로 사용됩니다. 효소-기질 복합체를 시뮬레이션할 때는 분자 도킹을 사용하거나 결정 구조의 다른 작은 분자(예: 억제제)를 기질로 직접 대체하여 빈 효소 또는 다른 분자와 복합된 효소의 구조를 기반으로 복합체의 초기 구조를 모델링해야 하는 경우가 많습니다. MD 시뮬레이션은 또한 시스템의 모든 화학 단위를 묘사하는 분자력장을 구성해야 합니다. 시뮬레이션할 시스템에 기질로 작은 분자가 포함되어 있는 경우, MD 소프트웨어 패키지에서 제공하는 표준 분자력장이 기질로 작은 분자를 포함하지 않는 경우가 종종 있습니다. 이 경우 저분자에 대한 포스 필드를 자동으로 생성할 수 있는 도구 소프트웨어를 사용할 수 있습니다. ^[18-19]. 긴 MD 시뮬레이션에 자동 생성된 포스 필드를 사용하기 전에 포스 필드 파일을 수동으로 확인하여 짧은 시뮬레이션 시험에 사용해야 합니다.

그림. 1 분자 역학 역학 필드 (A) 및 분자 역학 시뮬레이션 (B)
그림 1 분자 역학 힘장(A) 및 분자 역학 시뮬레이션(B)

1.2

효소 연구에 적용

MD 시뮬레이션에서 얻은 정보를 다양한 방식으로 적용하여 효소 엔지니어링 수정을 안내할 수 있습니다. ^[20]. 예를 들어, 실온과 고온 MD 시뮬레이션을 비교함으로써 효소 분자의 어느 영역이 주변 온도에 가장 민감한 구조적 안정성을 가질 가능성이 높은지 예측할 수 있습니다. 이러한 영역에 프롤린 점 돌연변이, 이황화 결합 등을 도입하면 잠재적으로 효소의 내열성을 향상시킬 수 있습니다. ^[21-24]. 안정성을 개선하기 위한 또 다른 전략은 표면 수소와 염 결합을 더 많이 형성하는 돌연변이를 설계하는 것입니다. ^[25-26]. 이러한 돌연변이를 실험적으로 검증하기 전에 야생형과 돌연변이를 동시에 시뮬레이션하여 돌연변이가 원하는 효과를 얻을 수 있는지 이론적으로 평가할 수 있습니다. ^[27-28]. MD는 온도 외에도 환경 pH, 용매 등의 변화가 단백질 형태와 안정성에 미치는 영향을 분석하는 데 사용할 수 있습니다. ^[29-30].
안정성 외에도 MD는 기질 결합/생산물 방출과 관련된 형태 역학에 큰 영향을 미칠 가능성이 있는 핫스팟 잔기를 예측하는 데 적용되어 기질 선택성, 반응 선택성, 제품 방출 속도 등을 변경할 수 있는 돌연변이 또는 돌연변이 라이브러리를 설계할 수 있는 기반을 제공합니다. ^[31-32]. MD로 기질/반응 선택성을 연구하는 방법 중 하나는 서로 다른(초기 구조) 효소-기질 복합체의 시뮬레이션 결과를 비교하여 더 높은 친화도(또는 더 높은 반응성)를 갖는 기질 또는 구조 상태를 예측하는 것입니다. 친화도(또는 반응성)를 계산하는 엄격한 정량적 방법은 자유 에너지 계산입니다. ^[33-34]. 자유 에너지 계산의 계산 집약적인 특성으로 인해 현재 대부분의 응용 분야에서는 상대적 친화도의 정성적 판별은 저분자-거대 분자 복합체의 구조 안정성, 평균 분자 간 상호작용 에너지 등을 기반으로 하며, 반응성의 정성적 판별은 촉매 및 반응 작용기 등의 상대적 기하학적 구성 분포 등을 기반으로 합니다. ^[35]. 이러한 질적 차별의 결과는 지시된 진화 서열의 라이브러리를 설계하기 위한 기초로 사용할 수 있습니다. 또한 MD 시뮬레이션은 기질 결합/산물 해리 기공 주변의 핫스팟 잔류물을 분석하는 데도 사용할 수 있습니다. ^[36-37]. 이러한 유형의 응용 분야에는 단백질에서 저분자를 분리하기 위한 해리 경로 시뮬레이션이 포함되며, 시뮬레이션 시간 규모가 충분하지 않아 어려움이 있는 경우 향상된 샘플링 기술을 사용하여 이를 극복할 수 있습니다. ^[38-39].

2

양자역학(QM) 및 양자역학/분자 역학 결합(QM/MM) 모델

2.1

방법 소개

공유 결합 생성 및 파괴, 전자 이동, 서로 다른 전자 상태 사이의 도약과 같은 효소 촉매의 화학적 단계를 시뮬레이션하려면 양자 역학(QM) 모델이 필요합니다. 현재 계산 화학에서 일반적으로 사용되는 QM 모델은 다음과 같은 몇 가지 유형으로 분류됩니다. 처음 시작 ), 밀도-함수 이론(DFT) 및 반경험적 방법 ^[40]. 그 중 반경험적 방법은 계산 비용이 가장 적게 듭니다. 하지만 제1원칙이 아닌 방법이며 계산 결과의 신뢰성은 특정 시스템과 문제에 따라 크게 달라집니다. 애비니오 방법과 DFT 방법 모두 제1원리 방법이며 보편적인 방법입니다. 실제 DFT 모델은 초기 계산보다 경험적인 이론적 근사치를 더 많이 포함할 수 있지만, DFT는 매우 높은 계산 효율로 전자 상관 에너지를 처리할 수 있습니다. 또한 많은 화학 반응 문제의 경우 반응 과정 중 에너지 변화와 같은 주요 파라미터에 대한 최상의 DFT 모델의 계산 오차는 이미 약 1kcal/mol 정도로 작으며, 그 결과는 특정 촉매 메커니즘이나 반응 경로의 화학적 건전성을 결정하기 위한 기초로 사용하기에 충분합니다.
분자의 기하학적 구성이 주어지면 QM을 사용하여 에너지를 계산할 수 있습니다. 이를 단일점 계산(즉, 기하학적 구성 공간에서 한 점만 다루는 계산)이라고 합니다. QM 모델은 분자 구조의 최적화, 즉 초기 구성에서 연속적인 변화 후 국부적으로 안정적인 구조(주변 구조보다 낮은 에너지)를 찾거나 반응물과 생성물을 연결하는 가장 낮은 에너지 경로와 경로를 따라 전이 상태를 찾는 데 더 자주 사용됩니다. 이러한 계산은 다양한 기하학적 구성을 고려하고 비교해야 하며 일반적으로 수십에서 수천 개의 단일 지점 계산을 수행해야 하므로 계산 집약적입니다. 계산 노력을 절약하기 위한 일반적인 전략은 먼저 정확도가 제한된 효율적인 QM 모델을 사용하여 광범위한 반응 경로 검색을 최적화한 다음, 검색된 가장 낮은 에너지 구성/경로 근처에서 정확도가 높은 모델을 사용하여 구성 최적화를 완료하거나 단일 지점 계산을 수행하는 것입니다.
현재 효소 분자 전체에 제1원리 QM 방법을 적용하는 것은 계산 집약적이며 기본적으로 단일 지점 계산으로 제한되며 여전히 실용성이 부족합니다. QM/MM 모델(그림 2)은 일반적으로 큰 분자에 사용됩니다. ^[11]. 이 모델에서 분자 시스템은 적어도 두 부분으로 나뉘는데, 화학 반응에 직접 관여하는 부분은 QM 모델로 처리하고 나머지는 분자 역학(MM)으로 처리합니다. QM-MM 경계와 상호작용을 처리하는 몇 가지 다른 전략이 있습니다. ^[41]. 제1원리 QM/MM 모델에서 QM 계산은 MM보다 훨씬 더 많은 비용이 들기 때문에, 주로 QM 영역의 형상을 예측하거나 시뮬레이션하기 위해 형태 최적화 방법이 사용되며, 분자 역학 시뮬레이션을 사용하여 MM 부분을 샘플링할 수 있습니다. ^[42]. 이는 계산 결과가 시스템의 QM 영역의 초기 구조에 더 민감할 수 있음을 의미합니다. 이 경우 신뢰할 수 있는 결과를 얻으려면 다른 초기 구조 모델을 사용한 계산이 필요합니다. 반경험적 방법의 경우 ^{[43] 또는} 경험적 원자가 결합 이론 ^[44-45] 는 QM 파트에 사용됩니다. ^, 를 사용하면 더 긴 QM/MM MD 샘플링을 통해 형태 공간을 더 완벽하게 탐색하고 초기 구조의 영향을 줄일 수 있습니다.

그림. 2 양자 기계 (QM)/분자 역학 (MM) 모델
그림 2 양자 역학(QM)/분자 역학(MM) 모델.

2.2

방법 적용

^{둘 다} QM 모델 ^{[10] 및} QM/MM 모델 ^[41] 는 효소 촉매 반응의 화학적 메커니즘을 이론적으로 예측하고 테스트하는 데 널리 사용되어 왔습니다. 그 결과는 화학 반응 과정에 참여하는 주요 잔류물을 파악하고, 반응의 속도 제한 단계를 찾고, 반응 중간체와 전이 상태의 구조를 모델링하고, 효소 환경과 어떻게 상호작용하는지 분석하는 데 도움이 될 수 있습니다. QM 클러스터 모델과 비교하여 QM/MM 모델은 화학 반응 중심이 위치한 효소 환경을 보다 현실적으로 시뮬레이션할 수 있으며, 효소 촉매의 화학 메커니즘을 이론적으로 예측/시험하고 환경 아미노산 잔기가 촉매 과정에 미치는 영향을 분석 및 예측하는 데 널리 사용되어 왔습니다. ^[46]. 원칙적으로 이러한 결과는 촉매 활성을 향상시키고 특이성 또는 선택성을 변경하는 것을 목표로 하는 유도 진화 돌연변이 라이브러리의 설계를 안내하는 데 사용할 수 있습니다. 더 도전적인 연구는 QM 또는 QM/MM 예측 전이 상태 구조 모델에서 처음부터 새로운 활성 중심을 설계하여 완전히 새로운 인공 효소를 얻는 것입니다. ^[47].

3

정전기 연속체 미디어 모델링

3.1

방법의 원리

효소 촉매 작용은 거의 항상 특정 용액 환경에서 이루어집니다. 용매 효과는 효소의 특성에 결정적인 영향을 미칩니다. 화학 처리의 용매 효과를 계산하는 모델은 분자 역학 힘장 또는 QM 모델과 같이 각 용매 분자와 그 안의 원자가 모델에 명시적으로 포함되는 명시적 용매 모델과 암시적 용매 또는 연속체 매체 모델의 두 가지 범주로 나뉩니다. ^{[48], 여기서} 용매 분자와 원자는 모델에 포함되지 않고 소위 "용매 평균장"을 사용하여 용매 효과를 처리합니다. 용매 분자와 원자는 포함되지 않고 소위 "용매 평균장"으로 용매 효과를 처리합니다. 명시적 용매 모델의 장점은 용질과 용매를 완전히 일관된 방식으로 처리하여 용질-용매 수소 결합, 염 결합 등과 같은 특정 상호작용을 사실적으로 모델링할 수 있다는 것입니다. 단점은 용매 분자의 수가 많고 계산 집약적이라는 점입니다. 또한 용매 확률적 상승은 시스템의 총 에너지에 크게 기여하며, 상승 효과를 제거하려면 긴 시뮬레이션 샘플 평균을 수행해야 합니다. 숨겨진 용매 모델은 용매의 평균화 효과를 나타내며, 용매의 열역학적 상승과 하강이 평균화되었습니다.
처리의 단순화를 위해 일반적으로 숨겨진 용매 모델에서는 비극성 용매 효과(소수성 효과)를 극성 용매 효과와 분리합니다. 경험에 따르면 비극성 용질의 용해 자유 에너지는 용매 접근 표면적(SASA)에 비례하는 것으로 나타났습니다. 따라서 이 구성 요소에는 SASA 용해 모델이 자주 사용됩니다. 이 모델의 파라미터에는 SASA를 계산하는 데 필요한 원자 반경, 용매 분자의 반경(물 분자의 경우 1.4Å), SASA에 비례하는 용해 자유 에너지의 비례 상수가 포함됩니다. 이러한 매개변수는 일반적으로 작은 분자의 용해 자유 에너지에 대한 실험 값을 맞추어 결정됩니다.
극성 용매 효과를 고려하는 데 가장 일반적으로 사용되는 모델은 용매가 차지하는 영역을 특정 유전율(물의 경우 78.4)을 가진 연속 매질로 간주하고 용질 영역은 낮은 유전율(일반적으로 2-8 값) 또는 진공(유전율 1)을 가진 매질이 차지하는 것으로 간주합니다(그림 3A). 연속 매질은 용질 영역의 전하 분포에 의해 생성된 정전기장에 의해 분극되고, 그 결과 분극된 전하 분포는 용질 영역에서 용질 전하에 작용하는 정전기장을 차례로 생성합니다. 분극된 전하에 의해 생성된 전기장을 반응장이라고 합니다. 따라서 정전기 연속 매체 모델은 반응장 모델이라고도 합니다. 용매 영역에 자유 이온이 없는 연속 매질 모델에서 공간 정전기 전위와 공간 전하 분포 사이의 관계는 푸아송 방정식을 만족합니다. 자유 이온이 포함된 용액 환경의 경우, 이온의 공간 분포는 공간 정전기 전위의 영향을 받습니다. 이 요소를 고려하면 공간 정전위와 공간 전하 분포의 관계는 푸아송-볼츠만 방정식(PB 방정식)을 만족하며, PB 방정식은 3차원 공간에서 정전위 분포와 전하 및 유전체의 분포 사이의 관계에 관한 편미분 방정식으로 수치적으로 풀 수 있습니다. 효소와 같은 거대 분자 시스템의 PB 방정식을 푸는 가장 일반적인 수치적 방법은 유한 차분법(FD)이며, 이를 통칭하여 FDPB 모델이라고 합니다(그림 3B). ^[14]. FDPB를 사용하면 용질의 공간 전하 분포를 기반으로 3차원에서 정전기 전위를 계산할 수 있으며, 이를 통해 정전기 자유 에너지와 같은 다른 특성도 계산할 수 있습니다. 저분자 시스템에 대한 QM 계산에서 반응장은 종종 분자 표면의 표면 전하 분포에 의해 생성된 전기장으로 동등하게 대체되며, 해당 모델을 편극성 연속 매체(PCM) 모델이라고 합니다.
극성 용매 효과를 설명하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 모델은 용매가 차지하는 영역을 특정 유전율(물의 경우 78.4)을 가진 연속 매질로 취급하는 반면 용질 영역은 낮은 유전율(일반적으로 2-8 값) 또는 진공(유전율 1)을 가진 매질이 차지하는 것처럼 취급합니다(그림 3A). 연속 매질은 용질 영역의 전하 분포에 의해 생성된 정전기장에 의해 분극되고, 그 결과 분극된 전하 분포는 다시 용질 영역에서 용질 전하에 작용하는 정전기장을 생성합니다. 분극된 전하에 의해 생성된 전기장을 반응장이라고 합니다. 따라서 정전기 연속 매체 모델은 반응장 모델이라고도 합니다. 용매 영역에 자유 이온이 없는 연속 매질 모델에서 공간 정전기 전위와 공간 전하 분포 사이의 관계는 푸아송 방정식을 만족합니다. 자유 이온이 포함된 용액 환경의 경우, 이온의 공간 분포는 공간 정전기 전위의 영향을 받습니다. 이 요소를 고려하면 공간 정전위와 공간 전하 분포의 관계는 푸아송-볼츠만 방정식(PB 방정식)을 만족하며, PB 방정식은 3차원 공간에서 정전위 분포와 전하 및 유전체의 분포 사이의 관계에 관한 편미분 방정식으로 수치적으로 풀 수 있습니다. 효소와 같은 거대 분자 시스템의 PB 방정식을 푸는 가장 일반적인 수치적 방법은 유한 차분법(FD)이며, 이를 통칭하여 FDPB 모델이라고 합니다(그림 3B). ^[14]. FDPB를 사용하면 용질의 공간 전하 분포를 기반으로 3차원에서 정전기 전위를 계산할 수 있으며, 이를 통해 정전기 자유 에너지와 같은 다른 특성도 계산할 수 있습니다. 소분자 시스템의 QM 계산에서 반응장은 종종 분자 표면의 표면 전하 분포에 의해 생성된 전기장으로 등가적으로 대체되며, 해당 모델을 편극성 연속 매체(PCM) 모델이라고 합니다.

그림. 3 정전기 연속체 모델 (A) 및 유한 차분 푸아송-볼츠만 (FDPB) 메서드 (B)
그림 3 정전기 연속체 모델(A)과 유한차분 푸아송-볼츠만(FDPB) 방법(B).

3.2

방법 적용

연속체 모델의 중요한 응용 분야 중 하나는 효소 분자에서 하전된 아미노산 측쇄기의 양성자화 상태를 연구하는 것입니다. 소프트웨어 PROPKA는 PB 방정식을 풀어 다양한 양성자 상태에 대한 정전기적 자유 에너지를 계산하여 각 해리 가능한 그룹의 pKa를 예측합니다. ^[50]. 효소 분자의 표면 정전기 전위 분포는 효소의 기질 선택성에 영향을 미치는 중요한 요소입니다. 효소 분자의 공간 구조와 양성자 상태가 주어지면 효소 분자의 표면 정전기 전위 분포는 FDPB 방법으로 계산할 수 있으며, 아미노산 잔기의 돌연변이 또는 환경 pH의 변화, 이온 농도 변화 등이 표면 정전위에 미치는 영향도 예측할 수 있습니다. ^[14].
QM 클러스터 모델로 효소 촉매의 화학적 단계를 연구할 때, 반응 영역에 대한 환경의 정전기적 영향을 시뮬레이션하기 위해 PCM 모델을 사용해야 하는 경우가 종종 있습니다. 반응 과정에 전하 분포에 상당한 변화가 있는 경우, 연속 매체를 사용하지 않은 진공 QM 계산 결과는 합리적이지 않으며 잘못된 정성적 결론을 도출할 수도 있습니다. QM/MM 모델에서 반응 중심은 일반적으로 MM 방식으로 처리되는 용해성 분자로 둘러싸여 있으며, 일반적으로 연속 매체 반응장을 고려할 필요가 없습니다. 그러나 반응 전후에 시스템의 순전하가 변화하는 경우(예: 산화 환원 전위 계산), 시스템 경계 외부의 용액 환경이 반응의 자유 에너지에 기여하는 바를 고려해야 할 가능성이 있으며, 이 경우 연속체 매체 모델을 사용하여 QM/MM 결과를 보정할 수 있습니다.
효율성과 정확성의 균형을 맞추는 방법으로서 MM/PBSA는 단백질-단백질 및 단백질-소분자 복합체의 친화성을 분석하는 데 사용할 수 있습니다. ^[49]. 오차 제거를 위해서는 복합체의 명시적 용매 분자 역학 시뮬레이션을 수행하여 복합체의 형태를 얻고, 각 복합체 형태에 대해 복합체 전체와 복합체를 구성하는 각 모노머의 MM/PBSA 에너지를 각각 계산하고, 전체 형태에 대한 전체 MM/PBSA 에너지와 모노머의 에너지 차이의 평균을 사용하여 결합의 자유 에너지를 근사화하는 것이 일반적입니다. 이 방법은 기질 친화도에 영향을 미치는 핫스팟 잔기를 분석하는 데 사용할 수 있으며 돌연변이의 기질 선택성 변화를 예측하는 데에도 사용할 수 있습니다.

4

기타 방법

4.1

분자 도킹

도킹은 단량체의 구조를 기반으로 복합체의 구조(및 친화력)를 예측하는 계산 프로세스를 말합니다. 저분자 단백질 도킹은 구조 기반 약물 가상 스크리닝을 위한 핵심 도구로, 이를 위해 여러 알고리즘이 개발되었습니다. ^[13]. 이러한 알고리즘과 모델은 기질-효소 복합체의 도킹에도 적용할 수 있습니다. 가상 약물 스크리닝은 수많은 서로 다른 저분자를 고려해야 하며, 계산 효율성의 이유로 분자 도킹 계산에서 수용체(또는 측쇄)의 구조적 변화는 고려되지 않는 경우가 많습니다. 가상 스크리닝과 달리 기질-효소 도킹 연구에서는 하나 또는 여러 개의 다른 기질만 고려하는 경우가 많으며, 원칙적으로 효소의 구조적 변화를 더 완벽하게 고려할 수 있습니다. 이를 달성하는 가장 간단한 방법은 기질에 개별적으로 도킹하는 MD와 같은 컨포멀 샘플링 방법을 통해 다양한 효소 구조를 얻는 것입니다. 기질-효소 도킹에서는 기질과 촉매 작용기의 상대적인 공간 배열을 사용하여 도킹 결과를 선별/평가하는 것도 종종 가능합니다.

4.2

기하학적 구조를 기반으로 한 저분자 기공 예측

수많은 실험 연구를 통해 활성 중심에서 멀리 떨어진 일부 돌연변이가 효소의 촉매 성능에 큰 영향을 미칠 수 있다는 사실이 밝혀졌습니다. 이러한 부위 중 일부는 기질 결합/생성물 방출 기공을 변경하여 작용할 수 있으며 기공 크기, 기공 주변 잔류물의 물리화학적 특성 등이 기질/생성물 통과율을 변화시키고 기질 선택성에 영향을 줄 수 있습니다. 기공 예측 방법은 관련 핫 잔류물을 찾고 지시된 진화 라이브러리 설계의 기초를 제공하는 데 사용할 수 있습니다. 단백질 표면 피트, 내부 공동, 서로 다른 영역을 연결하는 기공 등을 예측하기 위해 여러 기하학적 구조 기반 방법을 사용할 수 있습니다. ^[51-53]. 이러한 방법은 정적 공간 구조를 입력으로 사용하며, 대부분 기하학적 및 그래프 이론적 방법을 사용하여 높은 계산 효율로 예측을 실현합니다.

4.3

액티브 센터 비교 방법

현재 단백질 3D 구조 데이터베이스(PDB)에는 다양한 구조 유형과 계열을 가진 효소의 3D 구조 데이터가 대량으로 축적되어 있습니다. 서로 다른 효소를 비교하면 전체 구조 서열이 유사하지 않더라도 일부 효소는 활성 중심이 매우 유사하다는 것을 알 수 있습니다(대표적인 예로 세린 프로테아제가 공유하는 촉매 삼중 활성 중심이 있습니다). 활성 중심 구조 비교 방법 ^{[54-55] 캔} 를 사용하여 현재 효소의 활성 중심과 유사한 다른 효소의 활성 중심을 자동으로 검색할 수 있습니다. 3차원 공간에서 여러 개의 유사한 활성 중심을 함께 쌓고 서로 다른 활성 중심 간의 유사점과 차이점을 분석하면 돌연변이 부위 선택에 유용한 정보를 얻을 수 있습니다.

5

요약

설명의 명확성을 위해 위의 방법을 분류하여 소개합니다. 실제로는 서로 다른 유형의 방법이 상호 배타적이지 않습니다. 관심 있는 질문에 더 잘 답하기 위해 여러 가지 방법으로 조합하여 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 효소-기질 복합체 시뮬레이션에서 분자 도킹을 사용하여 시뮬레이션의 초기 형태를 얻을 수 있고, MD 시뮬레이션에서 얻은 형태 집합을 기공 예측 분석, 분자 도킹, QM/MM 시뮬레이션 등에 사용할 수 있습니다.QM 또는 QM/MM 모델에서 얻은 전이 상태를 새긴 MM 모델을 구축하여 장시간 고전적인 MD 시뮬레이션에 사용하여 화학 공정에 대한 형태 상승 및 하강의 영향을 분석하거나 많은 수의 돌연변이를 시뮬레이션하여 MD 시뮬레이션을 기반으로 돌연변이의 가상 스크리닝을 실현할 수 있으며, 이미 언급한 MM/PBSA 방식은 MD와 연속 매체 모델링의 조합 등 다양한 용도로 활용될 수 있습니다.
계산 화학 방법으로 단백질과 같은 생체 분자 시스템을 연구하는 것은 40년 이상의 역사를 가지고 있습니다. 이러한 방법은 산업 효소 연구에서 점점 더 널리 사용되며 지속적으로 발전해 왔습니다. 중국의 계산 화학 및 산업 효소 공학 연구팀이 확대되고 있으며 연구 역량이 빠르게 향상되고 있습니다. 효소 공학에서 계산 화학의 응용은 이 두 학문의 교차 결합이 점점 더 가까워짐에 따라 더 넓고 깊어질 것입니다. 단백질 공학, 유도 진화 및 기타 기술은 산업 효소 연구에 큰 영향을 미쳤습니다. 향후 계산 방법의 발전, 특히 새로운 효소 설계 방법의 획기적인 발전은 합성 생물학 시대의 산업 효소 연구에 새로운 기술 혁신을 가져올 것으로 예상됩니다.

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