Bagaimana proses produksi bio-enzim?

1. Produksi enzim

Enzim diproduksi dari mikroorganisme, hewan dan tumbuhan, tetapi sumber utamanya adalah mikroorganisme. Karena mikroorganisme memiliki lebih banyak keuntungan daripada tanaman dan hewan, umumnya strain penghasil enzim yang sangat baik dipilih untuk menghasilkan enzim melalui fermentasi. Untuk meningkatkan konsentrasi enzim dalam kaldu fermentasi, strain yang sangat baik dipilih, bakteri hasil rekayasa genetika dikembangkan, dan kondisi fermentasi dioptimalkan. Produksi industri membutuhkan kinerja khusus enzim baru, seperti α-amilase tahan suhu tinggi, protease dan lipase tahan basa, dll. Oleh karena itu, kita perlu meneliti dan mengembangkan strain untuk menghasilkan kinerja khusus enzim baru.

2. Persiapan enzim

Teknologi pemisahan dan pemurnian enzim merupakan inti dari "proses pasca-perawatan" bioteknologi saat ini. Menggunakan berbagai teknik pemisahan dan pemurnian, dari sel mikroba dan kaldu fermentasinya, atau sel hewan dan tumbuhan dan kaldu kulturnya dalam pemisahan dan pemurnian enzim, yang terbuat dari sediaan enzim yang sangat aktif dengan kemurnian yang berbeda, agar sediaan enzim lebih banyak digunakan di semua aspek ekonomi nasional, harus meningkatkan aktivitas sediaan enzim, kemurnian dan hasil, perlunya mempelajari teknik pemisahan dan pemurnian yang baru.

3. Enzim dan imobilisasi sel

Penelitian imobilisasi enzim dan sel adalah tugas utama rekayasa enzim. Untuk meningkatkan stabilitas enzim, menggunakan kembali sediaan enzim, memperluas jangkauan aplikasi sediaan enzim, menggunakan berbagai metode imobilisasi untuk imobilisasi enzim, pembuatan enzim yang tidak dapat bergerak, seperti glukosa isomerase yang tidak dapat bergerak, karbamilase yang tidak dapat bergerak, dll., Penentuan enzim yang tidak dapat bergerak, dan enzim yang tidak dapat bergerak untuk penerapan berbagai aspek pengembangan penelitian. Enzim yang tidak bergerak masih memiliki vitalitas yang kuat. Ini sangat dihargai oleh berbagai bidang seperti biokimia, teknik kimia, mikrobiologi, polimer dan kedokteran.

Sel yang diimobilisasi dikembangkan berdasarkan enzim yang diimobilisasi. Berbagai metode imobilisasi digunakan untuk melumpuhkan sel mikroba, sel hewan, dan sel tumbuhan untuk membuat berbagai sel biologis yang tidak dapat bergerak. Studi tentang sifat enzimatik sel yang diimobilisasi, terutama sifat kinetik, serta penelitian dan pengembangan sel yang diimobilisasi dalam berbagai aplikasi merupakan topik hangat dalam rekayasa enzim saat ini.

Teknologi imobilisasi merupakan tonggak penting dalam modernisasi teknologi enzim, dan merupakan teknologi terobosan untuk mengatasi kekurangan enzim alami dalam aplikasi industri dan untuk memberikan permainan penuh pada karakteristik reaksi enzim. Dapat dikatakan bahwa tidak ada teknologi enzim modern tanpa pengembangan teknologi imobilisasi.

4. Modifikasi molekul enzim

Juga dikenal sebagai modifikasi molekul enzim. Untuk meningkatkan stabilitas enzim, mengurangi antigenisitas, memperpanjang waktu paruh bakteri obat dalam tubuh, menggunakan berbagai metode modifikasi untuk memodifikasi struktur molekul enzim, untuk membuat enzim alami tidak memiliki beberapa karakteristik yang sangat baik (seperti stabilitas yang lebih tinggi, tidak ada antigenisitas, resistensi terhadap hidrolisis protease, dll.), dan bahkan menciptakan aktivitas enzim baru, untuk memperluas aplikasi enzim, untuk meningkatkan nilai aplikasi enzim, dan mencapai manfaat ekonomi dan sosial yang lebih besar. dan manfaat sosial.

Modifikasi molekul enzim dapat dilakukan dari dua aspek:

(1) Menggunakan teknologi rekayasa protein untuk memodifikasi gen struktur molekul enzim, dengan harapan mendapatkan enzim baru (enzim mutan) dengan karakteristik yang sangat baik dan aktivitas tinggi yang memiliki struktur primer dan struktur ruang yang wajar.

(2) Modifikasi kimiawi atau enzimatik terhadap struktur primer protein enzim, atau modifikasi kimiawi molekul enzim dengan modifikasi kimiawi pada gugus rantai samping. Untuk mengubah sifat enzimatik. Enzim-enzim ini sangat berguna dalam penelitian dasar di bidang enzimologi dan kedokteran.

Mikroorganisme yang digunakan dalam produksi enzim adalah jamur berserabut, ragi, dan bakteri dalam tiga kelompok utama, terutama dengan bakteri aerobik. Jenis dan penggunaan beberapa enzim industri utama tercantum di bawah ini:

Amilase

Amilase menghidrolisis pati untuk menghasilkan oligosakarida malt pucat dan maltosa. Produksi didominasi oleh fermentasi dalam dengan Bacillus subtilis dan Bacillus licheniformis dari genus Bacillus, yang terakhir ini menghasilkan enzim yang tahan panas. Fermentasi dalam dan semi-padat dengan strain Aspergillus dan Rhizopus juga digunakan untuk pengolahan makanan [6] . Amilase terutama digunakan dalam produksi gula, desizing tekstil, pengolahan bahan baku fermentasi dan pengolahan makanan. Glukoamilase dapat menghidrolisis pati menjadi glukosa, yang sekarang hampir seluruhnya diproduksi oleh fermentasi dalam Aspergillus niger, dan digunakan dalam produksi gula, produksi alkohol, dan pengolahan bahan baku fermentasi.

Protease

Penggunaan strain dan produksi varietas yang paling banyak. Dengan basil berbentuk lumut, basil kecil pendek dan basil subtilis untuk produksi fermentasi mendalam dari protease bakteri; dengan streptomyces, produksi fermentasi mendalam Aspergillus dari protease netral dan protease asam Aspergillus, digunakan untuk penghilangan bulu, pelunakan bulu, obat-obatan, industri makanan; dengan Trichoderma spp. beberapa bakteri dalam produksi fermentasi semi-padat rennet dalam pembuatan keju, bukan rennet yang diekstrak dari perut anak sapi asli.

Isomerase glukosa

Spesies ini berkembang pesat pada tahun 70-an. Sel Streptomyces pertama kali diperoleh dengan fermentasi dalam, dan setelah imobilisasi, larutan glukosa diubah menjadi sirup yang mengandung sekitar 50% fruktosa, yang dapat digunakan dalam industri makanan sebagai pengganti sukrosa. Dengan amilase, glukoamilase dan glukosa isomerase, dll. Akan dibuat dari pati jagung menjadi sirup telah menjadi salah satu industri gula yang sedang berkembang.

Pemilihan Sistem Ekspresi
1 Sistem ekspresi E. coli
①Sistem ekspresi pET lebih disukai
Ekspresi dan pemurnian rekombinan protein dapat dilakukan dengan menggunakan tag terlarut, MBP lebih disukai sebagai pilihan pertama.
③ Lebih disukai pET24 atau pET28 (jika diperlukan pemurnian) dengan BL21 (DE3), pertumbuhan medium TB 37 ° hingga 1-1,5 OD, pertumbuhan 18 ℃ selama 1 jam hingga 3 OD, induksi 0,5 mM IPTG selama 19 jam hingga OD hingga 10.
④ Tindakan penyelamatan untuk ekspresi tinggi dan kelarutan rendah: pendinginan hingga serendah 15 ℃; mengubah media menjadi 2xYT atau ZYP5052 (yang diinduksi sendiri), mengubah inang ekspresi; pemotongan terminal-N dan/atau terminal-C 2-10 residu asam amino; ekspresi dengan fusi dengan protein yang sangat larut, seperti MBP; secara kimiawi menginduksi pendamping molekuler, ikut mengekspresikan pendamping molekuler / protein yang berinteraksi, atau menyediakan ligan.
⑤ Keuntungan dan kerugian dari sistem ekspresi E. coli
Keuntungan: paling nyaman, paling efektif
Kekurangan: kemampuan ekspresi sekresi yang lemah; kesulitan dalam pembentukan ikatan disulfida; tidak ada modifikasi pasca-translasi

2 Sistem Ekspresi Ragi (Picrosporum)
Keuntungan: integrasi gen eksogen yang stabil; promotor gen oksidase alkohol kuat, dan ekspresinya dapat diatur secara ketat oleh metanol; protein rekombinan dapat diekspresikan dalam bentuk intraseluler atau ekstraseluler; mengandung fungsi modifikasi pasca-translasi yang umum pada sistem ekspresi eukariotik; terdapat inang / vektor komersial, yang mudah dioperasikan; mudah untuk diamplifikasi, dan kerapatan fermentasi sangat tinggi.
Kekurangan: bentuk pemrosesan pasca-penerjemahan yang unik; masalah glikosilasi yang berlebihan.

3 Pilihan pertama adalah sistem ekspresi yang dilaporkan dalam literatur, pilihan kedua adalah sistem E. coli, dan sistem ragi digunakan jika ekspresi dalam E. coli tidak aktif. Menurut sumber gen untuk menentukan sistem ekspresi, gen ditambah tag afinitas untuk memfasilitasi pemurnian.

Modifikasi enzim
①Desain rasional: berdasarkan informasi struktur dan fungsi protein pada perubahan gen pengkodean dan uji ekspresi rekombinasi.
Prosedur: pertama, mendapatkan struktur enzim dari database BRENDA, kemudian memodifikasi struktur enzim dan memprediksi struktur enzim dengan Alphafold2, kemudian melakukan analisis docking antara enzim dan molekul ligan dengan perangkat lunak PyMOL, dan akhirnya, sesuai dengan struktur enzim yang baru, mutasi sekuens gen secara terarah, dan kemudian mengekspresikannya secara rekombinan untuk mendapatkan enzim baru (untuk meningkatkan stabilitas termal, efisiensi katalitik, dan kekhususan substrat enzim).
② Desain irasional: mutasi frekuensi tinggi atau rekombinasi urutan pengkodean dan ekspresi rekombinan serta pengujian dengan hasil tinggi

Proses desain ab initio: 1. Pengembangan medan gaya dan algoritma pengambilan sampel 2. Pengujian throughput tinggi 3. Identifikasi struktur

Evolusi protein yang terarah
①Pilih gen asli
②Membangun perpustakaan mutasi gen yang beragam
③Menghubungkan beberapa gen yang bermutasi dalam vektor dan mengekspresikannya dalam strain yang sesuai
④ Pilih gen mutan berkualitas tinggi dengan skrining, lalu ekspresikan gen mutan dalam jumlah besar.

Metode pembuatan pustaka gen mutan
①Mutasi acak frekuensi tinggi secara in vivo: gunakan E. coli XL1-Red sebagai inang replikasi gen (sistem perbaikan kerusakan DNA yang rusak)
Dibudidayakan hingga tahap dataran tinggi, 1 mutasi basa rata-rata terjadi dalam 2Kb.
②Kit Mutagenesis Acak: tingkat mutasi 0,1 -1,6% /PCR, setara dengan 1-16 mutasi basa / gen
③ Mutagenesis saturasi titik demi titik

Evolusi Alami: Mutasi Spontan, Rekombinasi, Seleksi Alam
Evolusi pertanian: mutasi spontan, pemuliaan, penyaringan
Evolusi laboratorium: laju mutasi yang dipercepat, pemuliaan molekuler, penyaringan

Pengocokan DNA
Strategi eksperimental rekayasa protein
①Pilih gen awal untuk menetapkan sistem inaktivasi dan/atau metode penyaringan.
②Jika hubungan struktur-fungsi diketahui, gunakan metode desain yang rasional terlebih dahulu.
③Penyempurnaan mutasi acak dan penyaringan dengan hasil tinggi
④Desain dari awal hanya jika tidak ada gen awal yang sesuai.

Teknik Penelitian Protein
1 Sifat fisik dan kimia yang terkait dengan pemisahan dan pemurnian protein
Ukuran molekul (dialisis, ultrafiltrasi, filtrasi gel, sentrifugasi)
Bentuk molekul (sentrifugasi gradien, elektroforesis)
(iii) Sifat bermuatan (elektroforesis, kromatografi penukar ion)
(iv) Sifat pelarutan (salinisasi, pengendapan pelarut organik)
⑤ Perbedaan dalam pengikatan spesifik pada ligan (kromatografi imunoafinitas, kromatografi bioafinitas, kromatografi afinitas khelat logam)
(vi) Sifat adsorpsi (kromatografi hidrofobik)
(vii) denaturasi dan denaturasi (denaturasi dan denaturasi urea)

2 Sistem ekspresi protein
(1) Sistem ekspresi bakteri: siklus pendek, efisiensi tinggi, biaya rendah, tetapi tidak ada modifikasi pasca-penerjemahan. Terutama digunakan untuk produksi protein prokariotik, protein eukariotik sederhana.
Pemilihan vektor ekspresi: seri hewan peliharaan, seri pGEX, PQE30......
Pemilihan galur ekspresi: BL21 (DE3), Rosetta, M15......
Kondisi induksi: Konsentrasi IPTG, suhu dan durasi waktu
Pemurnian: Ni-NTA (Tag-nya), Manik-manik Strep, GST.....

Sistem ekspresi ragi: siklus pendek, efisiensi tinggi, biaya rendah, ada modifikasi pasca-penerjemahan. Akan ada glikosilasi yang tidak tepat, modifikasi mannose yang tinggi. Terutama digunakan untuk memproduksi protein intraseluler/sekresi, protein pengikat disulfida, protein terglikosilasi.

(iii) Sistem ekspresi bakteriofag: kapasitas gen yang tinggi, larut dalam protein, cocok untuk produksi protein beracun, modifikasi pasca-translasi yang mirip dengan mamalia. Kondisi kultivasi sangat keras dan tidak memiliki beberapa modifikasi glikosilasi. Terutama digunakan untuk produksi protein membran, protein ukuran besar, vaksin virus, protein pensinyalan, sitokin, kinase.
Genom baculovirus memiliki kapasitas yang sangat besar untuk penyisipan gen eksogen hingga 38 kb.
Baculovirus diproduksi di dalam sel serangga dan tidak bereplikasi di dalam sel mamalia.
Keuntungan: baculovirus dapat ditransduksi secara efisien dalam garis sel mamalia, termasuk sel primer dan sel punca.
Aman (tidak bereplikasi dalam sel mamalia) dan tidak ada efek sitopatik yang dapat diamati
Sel pra-transduksi yang disimpan dalam keadaan beku juga dapat digunakan sebagai sel persiapan uji
Portabilitas (untuk analisis jenis sel yang relevan secara farmakologis)
Kecepatan pengembangan pengujian (tidak perlu menghabiskan waktu untuk menghasilkan garis sel yang stabil)

Sistem ekspresi mamalia: waktu siklus yang panjang, efisiensi rendah, adanya modifikasi pasca-translasi, bioaktivitas protein yang tinggi. Terutama digunakan untuk memproduksi protein eukariotik yang kompleks, protein yang membutuhkan PTM yang tepat.
Ekspresi protein sementara: Reagen transfeksi PEI atau liposom
Pengembangan lini sel yang stabil: Platform rekayasa sel Flp-In™ Jump-In™
Ekspresi yang dapat diinduksi: Ekspresi yang diatur oleh tetrasiklin
Ekspresi yang dimediasi oleh pengiriman virus: sistem ekspresi lentiviral untuk analisis fungsional; sistem ekspresi adenoviral untuk produksi protein

3 Pemurnian Protein
Mengapa kita perlu memurnikan protein?
Untuk mengkarakterisasi struktur dan fungsi protein yang diminati.
(ii) Mempelajari regulasi protein dan interaksi protein
③ menghasilkan antibodi
Metode Pemurnian
Berdasarkan sifat fisik/kimia
Ukuran protein: dialisis, ultrafiltrasi, kromatografi filtrasi gel
Muatan protein: kromatografi penukar ion
Hidrofobisitas protein: kromatografi interaksi hidrofobik

Berdasarkan sifat biologis: kromatografi afinitas

①Dialisis
Faktor-faktor yang mempengaruhi: tabung dialisis MWCO; volume buffer; waktu dialisis; frekuensi penggantian buffer dialisis

Ultrafiltrasi
Filtrasi sentrifugal, ukuran protein lebih kecil dari ukuran pori tabung filter, disentrifugasi ke bagian bawah tabung.

Kromatografi filtrasi gel ③ Kromatografi filtrasi gel
Memisahkan protein dengan ukuran yang berbeda

Kromatografi pertukaran ion
Kolom penukar kation: gel bermuatan negatif, protein bermuatan positif
Kolom penukar anion: gel bermuatan positif, protein bermuatan negatif
Sedang
Pendukung inert: agarose, dekstran
Gugus bermuatan: karboksimetil: bermuatan negatif, dietilamino: bermuatan positif
Ion penyeimbang: gugus bermuatan negatif: H+ atau Na+ gugus bermuatan positif: OH- atau Cl-
Elusi protein secara bertahap atau gradien dengan meningkatkan konsentrasi garam atau mengubah pH.

Kromatografi afinitas
Kromatografi afinitas adalah metode pemisahan biomolekul dari campuran berdasarkan interaksi pengikatan makromolekul yang sangat spesifik antara biomolekul dan zat lain.
Contohnya meliputi: pengikatan antigen pada antibodi, pengikatan enzim pada ligan, pengikatan protein fusi glutathione dan GST, pengikatan protein anti-biotin pada molekul pengikat biotin, dan pengikatan ion logam pada protein fusi polihistidin.

Kromatografi kelat logam terimobilisasi (IMAC) menggunakan ion logam (Ni 2+; Co 2+; Cu 2+) yang terikat pada poli-(His) ₆ protein yang ditandai.

Pemurnian protein yang ditandai dengan Strep
Manik-manik secara khusus dapat menyerap protein dengan tag strep, dan kemudian dengan biotin, protein dapat dielusi dari manik-manik. (Prinsipnya mirip dengan percobaan pull down GST)

kromatografi afinitas proteinA/protein G
Protein A dan protein G yang direkayasa secara genetik dapat secara spesifik mengikat daerah Fc dari IgG mamalia. Dengan mengikat protein A dan protein G pada bahan kolom, IgG dan subkelas serta fragmennya dapat dimurnikan dengan kromatografi afinitas.
protein A: berat molekul 42kDa, dikodekan oleh gen spa, dengan 5 domain struktural pengikat imunoglobulin isotipik, masing-masing terdiri dari 3 heliks alfa.
Protein G: dengan berat molekul 65 kDa, dikodekan oleh gen spg, mengikat segmen Fc dan Fab antibodi serta albumin dalam serum. Protein G yang direkayasa secara genetik menghilangkan tempat pengikatan albumin dan hanya mempertahankan domain pengikatan Fc, yang lebih kuat daripada protein A. Protein A/protein G adalah protein yang direkayasa secara genetik yang mengikat albumin.
proteinA/protein G: adalah protein pengikat yang direkayasa secara genetik. Terdiri dari 4 domain pengikatan imunoglobulin protein A dan 2 protein G, yang memiliki jangkauan pengikatan yang lebih luas daripada protein A atau protein G saja, dan menggabungkan keunggulannya menjadi satu, yang dapat diterapkan pada pemurnian IgG dari hampir semua spesies.

Bagaimana cara mengidentifikasi protein yang dimurnikan?
SDS-PAGE; HPLC; spektrometri massa; Western blot; Uji pengikatan; Uji fungsional; Penjelasan struktural.

4 Mikroskop elektron
Mikroskop krio-elektron partikel tunggal (Single-ParticleAnalysis, SPA)
Mikroskopi tomografi krio-elektron (cryo-ET)

Hubungi Kami Sekarang!

Jika Anda membutuhkan Harga, silakan isi informasi kontak Anda di formulir di bawah ini, kami biasanya akan menghubungi Anda dalam waktu 24 jam. Anda juga bisa mengirim email kepada saya info@longchangchemical.com selama jam kerja (8:30 pagi hingga 6:00 sore UTC+8 Senin-Sabtu) atau gunakan obrolan langsung situs web untuk mendapatkan balasan secepatnya.

Senyawa Glukoamilase	9032-08-0
Pullulanase	9075-68-7
Xilanase	37278-89-0
Selulase	9012-54-8
Naringinase	9068-31-9
β-Amilase	9000-91-3
Glukosa oksidase	9001-37-0
alfa-Amilase	9000-90-2
Pektinase	9032-75-1
Peroksidase	9003-99-0
Lipase	9001-62-1
Katalase	9001-05-2
TANNASE	9025-71-2
Elastase	39445-21-1
Urease	9002-13-5
DEXTRANASE	9025-70-1
L-Laktat dehidrogenase	9001-60-9
Dehidrogenase malat	9001-64-3
Kolesterol oksidase	9028-76-6