Apa pendekatan kimia komputasi dalam penelitian enzim industri?
Makalah ini memperkenalkan metode kimia komputasi utama yang digunakan dalam penelitian enzim industri, terutama untuk memandu rekayasa enzim, termasuk simulasi medan gaya mekanika molekuler dan dinamika molekuler, mekanika kuantum dan pemodelan mekanika kuantum/mekanika molekuler gabungan, pemodelan elektrostatik kontinum, dan penambatan molekuler. Metode-metode ini dirangkum dalam teks dari dua perspektif, masing-masing: pertama, konsep dasar metode itu sendiri, hasil perhitungan asli, kondisi penerapan, serta kelebihan dan kekurangan; dan kedua, informasi berharga yang diperoleh dari perhitungan untuk memandu desain mutan dan pustaka mutan.
Aplikasi industri enzim memiliki sejarah seratus tahun, dan katalisis enzim banyak digunakan di berbagai industri seperti makanan, pertanian, obat-obatan, dan industri kimia karena efisiensinya yang tinggi, spesifisitas dan selektivitas yang tinggi, dan ramah lingkungan [1-2]. Karena lingkungan aplikasi industri jauh berbeda dengan lingkungan di mana enzim hidup di alam, sifat dan fungsi katalitik enzim alami dan lingkungan aplikasinya biasanya tidak cocok atau tidak optimal. Dalam hal ini, perlu dilakukan modifikasi urutan asam amino alami enzim dengan bantuan rekayasa enzim untuk meningkatkan kinerjanya [3]. Strategi rekayasa enzim yang paling umum digunakan adalah membangun pustaka mutasi untuk penyaringan, yaitu evolusi yang diarahkan oleh laboratorium [4]. Salah satu prasyarat yang diperlukan untuk evolusi terarah yang efektif adalah bahwa kapasitas perpustakaan (yaitu, jumlah mutan yang terkandung dalam perpustakaan) dari perpustakaan mutan yang menjalani penyaringan cukup besar relatif terhadap proporsi mutan yang berpotensi menguntungkan dalam perpustakaan. Ukuran perpustakaan mutan sering kali dibatasi oleh metode penyaringan, sumber daya yang tersedia, dan kondisi obyektif lainnya. Masalah utamanya adalah bagaimana meningkatkan persentase mutan yang efektif dalam perpustakaan mutan. Pemahaman mendalam tentang hubungan antara urutan enzim, struktur dan sifat-sifat penting dapat membantu mengidentifikasi titik-titik mutasi, membatasi ruang lingkup mutasi dan mewujudkan desain perpustakaan mutan yang berkualitas. Metode kimia komputasi adalah cara penting untuk mendapatkan pemahaman ini. Telah ditunjukkan bahwa pustaka mutasi protein yang dirancang secara komputasi berdasarkan desain komputasi dapat meningkatkan persentase mutan yang efektif dengan beberapa kali lipat dibandingkan dengan pustaka mutasi acak [5]. Untuk beberapa topik rekayasa enzim atau rekayasa protein yang sulit, peningkatan substansial yang dapat dihasilkan oleh komputasi mungkin cukup untuk menentukan keberhasilan atau kegagalan akhir dari topik tersebut, yang tidak lagi terbatas pada peningkatan efisiensi. Faktanya, metode kimia komputasi dan biologi komputasi telah berhasil memungkinkan desain enzim buatan dari awal dengan fungsi katalitik yang tidak dimiliki oleh enzim alami. Karena ulasan lain dalam album ini telah dikhususkan untuk metode untuk desain optimal otomatis dari urutan asam amino, makalah ini akan fokus pada metode komputasi untuk mensimulasikan dan menganalisis enzim dengan urutan asam amino tertentu. Tentu saja, para peneliti dapat menggunakan metode-metode ini untuk mempelajari tipe liar dan mutan secara terpisah dan kemudian membandingkan hasilnya.
Studi tentang protein, terutama enzim, telah lama menjadi bidang penting dalam penelitian kimia komputasi [6-8]. Metode utama meliputi simulasi dinamika molekuler (MD klasik) berdasarkan medan gaya mekanika molekuler klasik [9], mekanika kuantum (QM) [10] dan metode gabungan mekanika kuantum/mekanika molekuler (QM/MM) [8,11-12], prediksi kompleks intermolekuler, yaitu pengikatan molekul (Docking) [13], dan model kontinum polarisasi (PCM) untuk mengukur efek elektrostatik dan pelarut [ 14]. ) seperti model Poisson-Boltzmann (PB) [14], dan beberapa model yang didasarkan pada sifat-sifat geometris. Dalam makalah ini, kami akan memberikan gambaran umum tentang masing-masing metode ini dari dua perspektif: pertama, tentang metode itu sendiri, termasuk prinsip-prinsip dasar, hasil komputasi asli, kondisi penerapan, dan (potensi) keuntungan dan kerugian, dll.dan kedua, tentang bagaimana menggunakan metode ini untuk mendapatkan informasi yang relevan dengan teknik, seperti pemahaman yang lebih dalam tentang mekanisme yang relevan secara katalitik, prediksi teoritis atau penjelasan tentang perubahan sifat atau fungsi mutan yang berbeda sehubungan dengan tipe liar, yang dapat memandu desain pustaka mutasi berkualitas tinggi untuk evolusi terarah, atau desain pustaka mutasi berkualitas tinggi, atau desain bank mutasi. desain pustaka mutasi berkualitas tinggi, atau menyarankan lokasi mutasi dan jenis mutasi tertentu berdasarkan analisis hasil komputasi mentah, dll.
1
Simulasi dinamika molekuler (MD) berdasarkan medan gaya mekanika molekuler klasik (MM)
1.1
Pengantar metode ini
Untuk saat ini, kami tidak mempertimbangkan perubahan kimiawi yang terlibat dalam katalisis enzim, tetapi hanya proses perubahan konformasi enzim, pembentukan dan disosiasi kompleks non-kovalen antara enzim dan reaktan (atau produk) karena gerakan termal molekuler. Selama proses ini, keadaan elektronik molekul tidak berubah (misalnya, tidak ada ikatan kovalen yang diputuskan atau dibuat), dan model medan gaya mekanika molekuler berlaku. Apa yang disebut medan gaya mekanika molekuler adalah fungsi matematis empiris yang mengekspresikan ketergantungan energi potensial sistem molekuler pada konfigurasi geometris (yaitu, koordinat spasial semua atom yang membentuk sistem molekuler) (Gbr. 1A). Dengan kata lain, jika kita menggunakan X untuk merepresentasikan koordinat spasial dari semua atom dan VMM (X ) untuk mewakili energi potensial medan gaya molekul, energi potensial berubah ketika molekul berubah dari satu konformasi X1 ke yang lain X2:
∆VMM = VMM ( X2 ) – VMM ( X1 ).
Menurut teori termodinamika, atom-atom dalam molekul selalu bergerak secara termal, yaitu, X terus berubah seiring waktu; selain itu, ketika kita melakukan pengamatan eksperimental, sampel selalu terdiri dari sejumlah besar molekul (dengan pengecualian eksperimen molekul tunggal), dengan molekul yang berbeda dalam keadaan konformasi yang berbeda. Oleh karena itu, dari sudut pandang kinetik, kita perlu mempertimbangkan perubahan konformasi dari waktu ke waktu, dan dari sudut pandang termodinamika, kita perlu mempertimbangkan distribusi probabilitas molekul dengan konformasi yang berbeda. Simulasi dinamika molekuler (MD) adalah model yang paling mudah untuk memeriksa dua aspek sifat ini (Gbr. 1B). Dalam simulasi MD, kita mulai dari konformasi awal, menghitung gaya yang bekerja pada setiap atom pada setiap titik waktu berdasarkan konformasi saat ini dan fungsi energi potensial (gaya adalah turunan negatif dari fungsi energi potensial terhadap koordinat atom), mengintegrasikan secara numerik persamaan gerak Newton untuk mendapatkan konformasi pada titik waktu berikutnya, dan mengulangi proses tersebut untuk mendapatkan lintasan evolusi konformasi dari waktu ke waktu.
Di antaranya, algoritme khusus dapat digunakan untuk mensimulasikan efek faktor lingkungan (misalnya, suhu, tekanan, dll.) pada gerakan molekul. Menurut prinsip termodinamika, ketika interval waktu cukup lama, distribusi probabilitas konformasi molekul yang sama pada titik waktu yang berbeda dan konformasi molekul yang berbeda dalam keadaan kesetimbangan termodinamika adalah sama (yaitu, rata-rata waktu setara dengan rata-rata sistem). Oleh karena itu, jika simulasi MD dilakukan dalam jangka waktu yang cukup lama, kumpulan konformasi yang diperoleh dari simulasi dapat digunakan sebagai sampel distribusi konformasi molekul pada kondisi kesetimbangan termodinamika tertentu. Berdasarkan prinsip ini, kita dapat menganalisis sifat-sifat yang dapat diamati secara sembarang dari suatu sistem pada keadaan kesetimbangan termodinamika berdasarkan lintasan waktu yang diperoleh dengan MD.
MD menyediakan alat komputasi yang kuat untuk menganalisis secara komprehensif proses perubahan kinetik perubahan konformasi dan distribusi termodinamika kuantum mikroskopis yang penting pada resolusi atomik, yang sangat penting untuk menjelaskan prinsip-prinsip desain dan mekanisme kerja mesin biomakromolekuler yang kompleks seperti enzim. Karena metode eksperimental saat ini untuk analisis struktur makromolekul hanya dapat memberikan struktur statis rata-rata secara spatio-temporal, simulasi MD memiliki fungsi yang tak tergantikan dalam penelitian terkait. Berdasarkan premis ini, alat MD itu sendiri masih dalam proses perbaikan dan penyempurnaan yang berkelanjutan. Secara metodologis, keterbatasan utama MD berasal dari dua aspek: pertama, keakuratan model medan gaya molekuler; dan kedua, waktu simulasi yang terbatas menyulitkan untuk merealisasikan pengambilan sampel penuh ruang konformasi. Untuk masalah pertama, medan gaya molekuler telah sangat ditingkatkan dalam beberapa tahun terakhir, dan keakuratan deskripsi termodinamika dari keseimbangan konformasi makromolekul biologis, terutama sistem protein, telah ditingkatkan, berhasil mensimulasikan berbagai molekul protein dari proses pelipatan kepala ke struktur alami [15-16]. Dalam hal waktu simulasi, karena perkembangan perangkat keras dan perangkat lunak komputer, sekarang dimungkinkan untuk menyelesaikan simulasi dalam urutan mikrodetik untuk sistem dengan ukuran biasa (misalnya, molekul enzim dengan ratusan residu dalam larutan air) menggunakan perangkat keras komputasi konvensional (misalnya, server multi-inti yang digunakan oleh grup). Pada skala waktu ini, proses seperti pembukaan dan penutupan domain struktural atau daerah cincin dapat diamati. Jika lebih banyak sumber daya komputasi tersedia, simulasi langsung proses seperti pengikatan/disosiasi substrat juga dapat direalisasikan. Untuk mempelajari proses pada skala waktu di luar jangkauan simulasi (misalnya, perubahan fungsional skala besar protein alosterik, dll.), Metode pengambilan sampel yang ditingkatkan dapat digunakan [17], asalkan pengguna memiliki pemahaman yang lebih mendalam tentang teori MD.
Saat ini, sebagian besar aplikasi simulasi MD mencakup skala waktu dari nanodetik hingga mikrodetik, dan pengambilan sampel ruang konformasi sebagian besar terbatas pada sekitar struktur awal (untuk protein domain tunggal, biasanya naik turunnya struktur dari perpindahan root-mean-square (RMS) dalam kisaran 3-4 Ã…). Oleh karena itu, perlu untuk menggunakan struktur awal yang wajar sebagai input ke MD agar hasil simulasi menjadi bermakna. Dalam kebanyakan kasus, struktur kristal yang ditentukan secara eksperimental atau struktur berdasarkan pemodelan komparatif protein homolog digunakan sebagai struktur awal untuk MD. Ketika mensimulasikan kompleks enzim-substrat, sering kali perlu untuk memodelkan struktur awal kompleks berdasarkan struktur enzim kosong atau enzim dalam kompleks dengan molekul lain, baik dengan menggunakan docking molekuler atau dengan secara langsung mengganti molekul kecil lainnya (misalnya, inhibitor) dalam struktur kristal dengan substrat. Simulasi MD juga memerlukan konstruksi medan gaya molekul yang menggambarkan semua unit kimia dalam sistem. Ketika sistem yang akan disimulasikan mencakup molekul kecil sebagai substrat, sering kali medan gaya molekul standar yang disediakan dalam paket perangkat lunak MD tidak mencakup molekul kecil sebagai substrat. Dalam hal ini, perangkat lunak alat yang dapat secara otomatis menghasilkan medan gaya untuk molekul kecil dapat digunakan [18-19]. File medan gaya harus diperiksa secara manual dan digunakan untuk uji coba simulasi singkat sebelum menggunakan medan gaya yang dihasilkan secara otomatis untuk simulasi MD yang panjang.
Gbr. 1 Medan gaya mekanika molekuler (A) dan simulasi dinamika molekuler (B)
Gbr. 1 Medan gaya mekanika molekuler (A) dan simulasi dinamika molekuler (B)
1.2
Aplikasi untuk penelitian enzim
Informasi yang diperoleh dari simulasi MD dapat diterapkan dalam berbagai cara untuk memandu modifikasi rekayasa enzim [20]. Sebagai contoh, dengan membandingkan simulasi MD suhu kamar dan suhu tinggi, dimungkinkan untuk memprediksi daerah mana dari molekul enzim yang cenderung memiliki stabilitas struktural paling sensitif terhadap suhu lingkungan. Memperkenalkan mutasi titik prolin, ikatan disulfida, dll. di wilayah ini berpotensi meningkatkan ketahanan panas enzim [21-24]. Strategi lain untuk meningkatkan stabilitas adalah merancang mutan yang membentuk lebih banyak hidrogen permukaan dan ikatan garam [25-26]. Sebelum memvalidasi mutan tersebut secara eksperimental, tipe liar dan mutan dapat disimulasikan secara paralel untuk menilai secara teoritis apakah mutasi dapat mencapai efek yang diinginkan [27-28]. Selain suhu, MD dapat digunakan untuk menganalisis pengaruh perubahan pH lingkungan, pelarut, dll. terhadap konformasi protein dan kestabilannya [29-30].
Selain stabilitas, MD telah diterapkan untuk memprediksi residu hotspot yang berpotensi secara signifikan memengaruhi dinamika konformasi yang terkait dengan pengikatan substrat/pelepasan produk, memberikan dasar untuk merancang mutasi atau pustaka mutan yang dapat mengubah selektivitas substrat, selektivitas reaksi, laju pelepasan produk, dll. [31-32]. Salah satu cara untuk mempelajari selektivitas substrat/reaksi dengan MD adalah dengan membandingkan hasil simulasi kompleks enzim-substrat dengan (struktur awal) yang berbeda dan memprediksi keadaan substrat atau struktur dengan afinitas yang lebih tinggi (atau reaktivitas yang lebih tinggi). Metode kuantitatif yang ketat untuk menghitung afinitas (atau reaktivitas) adalah perhitungan energi bebas [33-34]. Karena sifat perhitungan energi bebas yang intensif secara komputasi, sebagian besar aplikasi saat ini menggunakan metode kualitatif untuk prediksi: diskriminasi kualitatif afinitas relatif dapat didasarkan pada stabilitas struktur kompleks molekul-makromolekul kecil, energi interaksi antarmolekul rata-rata, dll., sedangkan diskriminasi kualitatif reaktivitas didasarkan pada distribusi konfigurasi geometris relatif dari gugus fungsi katalitik dan reaktif, dll. [35]. Hasil diskriminasi kualitatif tersebut dapat digunakan sebagai dasar untuk merancang pustaka sekuens evolusi terarah. Selain itu, simulasi MD juga dapat digunakan untuk menganalisis residu hotspot di sekitar pori pengikatan substrat/disosiasi produk [36-37]. Jenis aplikasi ini melibatkan simulasi jalur disosiasi untuk pemisahan molekul kecil dari protein, dan jika ada kesulitan dengan skala waktu simulasi yang tidak mencukupi, hal ini dapat diatasi dengan menggunakan teknik pengambilan sampel yang disempurnakan [38-39].
2
Model mekanika kuantum (QM) dan gabungan mekanika kuantum/mekanika molekuler (QM/MM)
2.1
Pengantar metode ini
Untuk mensimulasikan langkah-langkah kimiawi dalam katalisis enzim, seperti pembuatan dan pemutusan ikatan kovalen, transfer elektron, dan lompatan di antara keadaan elektronik yang berbeda, diperlukan model mekanika kuantum (QM). Saat ini, model QM yang biasa digunakan dalam kimia komputasi diklasifikasikan ke dalam beberapa jenis seperti ab initio ( ab initio ), teori fungsional kepadatan (DFT), dan metode semi-empiris [40]. Di antara metode-metode tersebut, metode semi-empiris adalah yang paling murah secara komputasi. Namun, metode ini bukan metode prinsip pertama dan keandalan hasil komputasi sangat bergantung pada sistem dan masalah tertentu. Baik metode ab initio maupun DFT adalah metode prinsip pertama dan bersifat universal. Model DFT praktis mungkin mengandung lebih banyak perkiraan teoritis empiris daripada perhitungan ab initio, tetapi DFT dapat menangani energi korelasi elektron dengan efisiensi komputasi yang sangat tinggi. Selain itu, untuk banyak masalah reaksi kimia, kesalahan komputasi dari model DFT terbaik untuk parameter kunci seperti perubahan energi selama proses reaksi sudah sekecil sekitar 1 kkal/mol atau lebih, dan hasilnya cukup untuk digunakan sebagai dasar untuk menentukan kesehatan kimia dari mekanisme katalitik atau jalur reaksi tertentu.
Dengan mengetahui konfigurasi geometris molekul, energinya dapat dihitung menggunakan QM. Model QM lebih sering digunakan untuk optimasi geometri molekul, yaitu untuk menemukan struktur yang stabil secara lokal (dengan energi yang lebih rendah dari struktur tetangga) setelah perubahan berturut-turut dari konfigurasi awal, atau untuk menemukan jalur berenergi terendah yang menghubungkan reaktan ke produk, dan keadaan transisi di sepanjang jalur tersebut. Perhitungan ini sangat intensif secara komputasi karena konfigurasi geometris yang berbeda harus dipertimbangkan dan dibandingkan, dan biasanya puluhan hingga ribuan perhitungan titik tunggal harus dilakukan. Strategi umum untuk menghemat upaya komputasi adalah pertama-tama mengoptimalkan berbagai pencarian jalur reaksi menggunakan model QM yang efisien dengan akurasi terbatas, dan kemudian menyelesaikan pengoptimalan konfigurasi menggunakan model dengan akurasi yang lebih tinggi di dekat konfigurasi / jalur energi terendah yang dicari, atau melakukan perhitungan satu titik.
Saat ini, penerapan metode QM prinsip pertama pada seluruh molekul enzim sangat intensif secara komputasi, pada dasarnya terbatas pada perhitungan satu titik, dan masih kurang praktis. Model QM/MM (Gbr. 2) umumnya digunakan untuk molekul besar [11]. Dalam model ini, sistem molekuler dibagi menjadi setidaknya dua bagian: bagian yang terlibat langsung dalam reaksi kimia diperlakukan dengan model QM, dan sisanya diperlakukan dengan mekanika molekuler (MM). Ada beberapa strategi yang berbeda untuk menangani batas dan interaksi QM-MM [41]. Dalam model QM / MM prinsip pertama, perhitungan QM jauh lebih mahal daripada MM. oleh karena itu, metode optimasi konformasi sebagian besar digunakan untuk wilayah QM untuk memprediksi atau mensimulasikan geometrinya, dan simulasi dinamika molekuler dapat digunakan untuk mengambil sampel bagian MM [42]. Ini berarti bahwa hasil komputasi mungkin lebih sensitif terhadap struktur awal wilayah QM sistem. Dalam hal ini, perhitungan dengan model struktur awal yang berbeda diperlukan untuk mendapatkan hasil yang dapat diandalkan. Jika metode semi-empiris [43] atau teori ikatan valensi empiris [44-45] digunakan untuk bagian QM , dimungkinkan untuk mengeksplorasi ruang konformasi secara lebih lengkap dan mengurangi efek struktur awal dengan pengambilan sampel QM/MM MD yang lebih lama.
Gbr. 2 Mekanik kuantum (QM)/Molekul Mekanika (MM) model
Gbr. 2 Model mekanika kuantum (QM) / mekanika molekuler (MM).
2.2
Penerapan metode ini
Keduanya model QM [10] dan model QM/MM [41] telah digunakan secara luas untuk prediksi teoretis dan pengujian mekanisme kimiawi reaksi yang dikatalisis oleh enzim. Hasilnya dapat membantu kita untuk melihat residu kunci mana yang berpartisipasi dalam proses reaksi kimia, menemukan langkah pembatas laju reaksi, memodelkan struktur zat antara reaksi dan kondisi transisi, menganalisis bagaimana mereka berinteraksi dengan lingkungan enzim, dll. Dibandingkan dengan model cluster QM, model QM / MM dapat mensimulasikan lingkungan enzim secara lebih realistis di mana pusat reaksi kimia berada. QM / MM telah banyak digunakan untuk memprediksi / menguji secara teoritis mekanisme kimiawi katalisis enzim dan untuk menganalisis serta memprediksi kemungkinan efek residu asam amino lingkungan pada proses katalitik. [46]. Pada prinsipnya, hasil-hasil ini dapat digunakan untuk memandu desain pustaka mutasi evolusi terarah dengan tujuan meningkatkan aktivitas katalitik dan mengubah kekhususan atau selektivitas. Penelitian yang lebih menantang adalah mendapatkan enzim buatan yang sama sekali baru berdasarkan desain pusat aktif baru dari awal dari model struktur keadaan transisi QM atau QM/MM yang diprediksi [47].
3
Pemodelan media kontinum elektrostatik
3.1
Prinsip dari metode ini
Katalisis enzim hampir selalu dilakukan dalam lingkungan larutan tertentu. Efek pelarut memiliki pengaruh yang sangat penting pada sifat enzim. Model untuk menghitung efek pelarut dari perlakuan kimia terbagi dalam dua kategori: model pelarut eksplisit, misalnya, dalam medan gaya mekanika molekuler atau model QM, di mana setiap molekul pelarut dan setiap atom di dalamnya secara eksplisit dimasukkan dalam model; dan model pelarut implisit atau model medium kontinum [48], di mana molekul dan atom pelarut tidak termasuk dalam model dan apa yang disebut "bidang rata-rata pelarut" digunakan untuk menangani efek pelarut. yang tidak menyertakan molekul dan atom pelarut, tetapi memperlakukan efek pelarut dengan apa yang disebut "bidang rata-rata pelarut". Keuntungan dari model pelarut eksplisit adalah mampu memperlakukan zat terlarut dan pelarut dengan cara yang sepenuhnya konsisten, secara realistis memodelkan interaksi spesifik seperti ikatan hidrogen zat terlarut-pelarut, ikatan garam, dan sebagainya. Kerugiannya adalah jumlah molekul pelarut yang besar dan intensif secara komputasi. Selain itu, kenaikan stokastik pelarut berkontribusi secara signifikan terhadap energi total sistem, dan rata-rata sampel simulasi yang panjang harus dilakukan untuk menghilangkan efek kenaikan tersebut. Model pelarut tersembunyi menggambarkan efek rata-rata pelarut, dan kenaikan dan penurunan termodinamika pelarut telah dirata-ratakan.
Untuk mempermudah perlakuan, kami biasanya memisahkan efek pelarut nonpolar (efek hidrofobik) dari efek pelarut polar dalam model pelarut tersembunyi. Pengalaman telah menunjukkan bahwa energi bebas solvasi zat terlarut nonpolar sebanding dengan luas permukaan yang dapat diakses pelarut (SASA). Oleh karena itu, model solvasi SASA sering digunakan untuk komponen ini. Parameter dalam model ini meliputi jari-jari atom yang diperlukan untuk menghitung SASA, jari-jari molekul pelarut (1,4 Ã… untuk molekul air), dan konstanta proporsionalitas untuk energi bebas solvasi yang sebanding dengan SASA. Parameter ini umumnya ditentukan dengan menyesuaikan nilai eksperimental dari energi bebas solvasi molekul kecil.
Model yang paling umum digunakan untuk mempertimbangkan efek pelarut polar memperlakukan wilayah yang ditempati oleh pelarut sebagai media kontinu dengan konstanta dielektrik tertentu (78,4 untuk air), dan wilayah zat terlarut ditempati oleh media dengan konstanta dielektrik yang rendah (biasanya bernilai 2-8) atau ruang hampa udara (konstanta dielektrik 1) (Gbr. 3A). Medium kontinu terpolarisasi oleh medan elektrostatik yang dihasilkan oleh distribusi muatan di wilayah zat terlarut, dan distribusi muatan terpolarisasi yang dihasilkan pada gilirannya menghasilkan medan elektrostatik di wilayah zat terlarut yang bekerja pada muatan zat terlarut. Medan listrik yang dihasilkan oleh muatan terpolarisasi disebut medan reaksi. Oleh karena itu, model medium kontinu elektrostatik juga dikenal sebagai model medan reaksi. Pada model medium kontinu tanpa ion bebas di wilayah pelarut, hubungan antara potensial elektrostatik ruang dan distribusi muatan ruang memenuhi persamaan Poisson. Untuk lingkungan larutan yang mengandung ion bebas, distribusi spasial ion dipengaruhi oleh potensial elektrostatik spasial. Dengan mempertimbangkan faktor ini, hubungan antara potensial elektrostatik spasial dan distribusi muatan spasial memenuhi persamaan Poisson-Boltzmann (persamaan PB) Persamaan PB adalah persamaan diferensial parsial yang menyangkut hubungan antara distribusi potensial elektrostatik dan distribusi muatan dan dielektrik dalam ruang tiga dimensi, dan dapat diselesaikan secara numerik. Metode numerik yang paling umum untuk menyelesaikan persamaan PB untuk sistem makromolekul seperti enzim adalah metode beda hingga (FD), yang secara kolektif disebut sebagai model FDPB (Gambar 3B) [14]. Dengan FDPB, dimungkinkan untuk menghitung potensial elektrostatik dalam tiga dimensi berdasarkan distribusi muatan ruang zat terlarut, yang pada gilirannya memungkinkan penghitungan sifat-sifat lain seperti energi bebas elektrostatik. Dalam perhitungan QM untuk sistem molekul kecil, medan reaksi sering kali secara ekuivalen digantikan oleh medan listrik yang dihasilkan oleh distribusi muatan permukaan pada permukaan molekul, dan model yang sesuai disebut model medium kontinu terpolarisasi (PCM).
Model yang paling umum digunakan untuk menjelaskan efek pelarut polar memperlakukan wilayah yang ditempati oleh pelarut sebagai media kontinu dengan konstanta dielektrik tertentu (78,4 untuk air), sedangkan wilayah zat terlarut diperlakukan seolah-olah ditempati oleh media dengan konstanta dielektrik yang rendah (biasanya bernilai 2-8) atau ruang hampa udara (konstanta dielektrik 1) (Gbr. 3A). Medium kontinu terpolarisasi oleh medan elektrostatik yang dihasilkan oleh distribusi muatan di wilayah zat terlarut, dan distribusi muatan terpolarisasi yang dihasilkan pada gilirannya menghasilkan medan elektrostatik di wilayah zat terlarut yang bekerja pada muatan zat terlarut. Medan listrik yang dihasilkan oleh muatan terpolarisasi disebut medan reaksi. Oleh karena itu, model medium kontinu elektrostatik juga dikenal sebagai model medan reaksi. Pada model medium kontinu tanpa ion bebas di wilayah pelarut, hubungan antara potensial elektrostatik ruang dan distribusi muatan ruang memenuhi persamaan Poisson. Untuk lingkungan larutan yang mengandung ion bebas, distribusi spasial ion dipengaruhi oleh potensial elektrostatik spasial. Dengan mempertimbangkan faktor ini, hubungan antara potensial elektrostatik spasial dan distribusi muatan spasial memenuhi persamaan Poisson-Boltzmann (persamaan PB) Persamaan PB adalah persamaan diferensial parsial yang menyangkut hubungan antara distribusi potensial elektrostatik dan distribusi muatan dan dielektrik dalam ruang tiga dimensi, dan dapat diselesaikan secara numerik. Metode numerik yang paling umum untuk menyelesaikan persamaan PB untuk sistem makromolekul seperti enzim adalah metode beda hingga (FD), yang secara kolektif disebut sebagai model FDPB (Gambar 3B) [14]. Dengan FDPB, dimungkinkan untuk menghitung potensial elektrostatik dalam tiga dimensi berdasarkan distribusi muatan ruang zat terlarut, yang pada gilirannya memungkinkan penghitungan sifat-sifat lain seperti energi bebas elektrostatik. Dalam perhitungan QM dari sistem molekul kecil, medan reaksi sering kali secara ekuivalen digantikan oleh medan listrik yang dihasilkan oleh distribusi muatan permukaan pada permukaan molekul, dan model yang sesuai disebut model medium kontinu terpolarisasi (PCM).
Gbr. 3 Model kontinum elektrostatik (A) dan Poisson-Boltzmann beda hingga (FDPB) metode (B)
Gbr. 3 Model kontinum elektrostatik (A) dan metode beda hingga Poisson-Boltzmann (FDPB) (B).
3.2
Penerapan metode ini
Salah satu aplikasi penting dari model kontinum adalah untuk mempelajari keadaan protonasi gugus rantai samping asam amino yang bermuatan dalam molekul enzim. Perangkat lunak PROPKA memprediksi pKa dari setiap gugus yang dapat dipisahkan dengan menyelesaikan persamaan PB untuk menghitung energi bebas elektrostatik untuk keadaan protonasi yang berbeda [50]. Distribusi potensial elektrostatik permukaan molekul enzim merupakan faktor penting yang mempengaruhi selektivitas substrat enzim. Mengingat struktur spasial dan keadaan protonasi molekul enzim, distribusi potensial elektrostatik permukaan molekul enzim dapat dihitung dengan metode FDPB, yang juga memprediksi efek mutasi pada residu asam amino atau perubahan pH lingkungan, perubahan konsentrasi ion, dll., pada potensial elektrostatik permukaan [14].
Ketika mempelajari langkah-langkah kimiawi katalisis enzim dengan model kluster QM, sering kali perlu menggunakan model PCM untuk mensimulasikan pengaruh elektrostatik lingkungan pada zona reaksi. Jika proses reaksi melibatkan perubahan signifikan dalam distribusi muatan, hasil perhitungan QM vakum tanpa menggunakan media kontinu tidak masuk akal dan bahkan dapat menyebabkan kesimpulan kualitatif yang salah. Dalam model QM/MM, pusat reaksi umumnya dikelilingi oleh molekul terlarut yang diperlakukan dengan cara MM, dan umumnya tidak perlu mempertimbangkan bidang reaksi medium kontinu. Namun, jika muatan bersih sistem berubah sebelum dan sesudah reaksi (misalnya, perhitungan potensial redoks), kemungkinan kontribusi lingkungan larutan di luar batas sistem terhadap energi bebas reaksi perlu diperhitungkan, dan dalam hal ini hasil QM / MM dapat dikoreksi dengan menggunakan model medium kontinum.
Sebagai metode yang menyeimbangkan efisiensi dan akurasi, MM/PBSA dapat digunakan untuk menganalisis afinitas kompleks protein-protein dan protein-molekul kecil [49]. Untuk mencapai pembatalan kesalahan, biasanya dilakukan simulasi dinamika molekul pelarut eksplisit dari kompleks untuk mendapatkan kumpulan konformasi; untuk setiap konformasi kompleks, hitung energi MM / PBSA dari kompleks secara keseluruhan, dan masing-masing monomer yang membentuk kompleks, dan perkirakan energi bebas pengikatan dengan menggunakan rata-rata selisih antara energi MM / PBSA secara keseluruhan dan energi monomer untuk seluruh konformasi. Metode ini dapat digunakan untuk menganalisis residu hotspot yang memengaruhi afinitas substrat dan juga dapat digunakan untuk memprediksi perubahan selektivitas substrat pada mutan.
4
Metode lain
4.1
Docking Molekuler
Docking mengacu pada proses komputasi untuk memprediksi struktur (dan afinitas) suatu kompleks berdasarkan struktur monomer. Docking protein molekul kecil adalah alat utama untuk penyaringan virtual berbasis struktur obat, yang mana beberapa algoritme telah dikembangkan [13]. Algoritme dan model ini juga dapat diterapkan pada pengikatan kompleks substrat-enzim. Penyaringan obat virtual memerlukan pertimbangan sejumlah besar molekul kecil yang berbeda, dan karena alasan efisiensi komputasi, perubahan struktural reseptor (atau hanya rantai samping) sering kali tidak diperhitungkan dalam perhitungan penambatan molekuler. Berbeda dengan penyaringan virtual, dalam studi docking substrat-enzim hanya satu atau beberapa substrat yang berbeda yang sering dipertimbangkan, dan perubahan struktural pada enzim pada prinsipnya dapat diperhitungkan secara lebih lengkap. Cara paling mudah untuk mencapai hal ini adalah dengan mendapatkan struktur enzim yang beragam dengan metode pengambilan sampel konformasi seperti MD, yang dipasangkan secara terpisah ke substrat. Dalam pengikatan substrat-enzim, sering kali juga dimungkinkan untuk menggunakan pengaturan spasial relatif dari substrat dan gugus fungsi katalitik untuk menyaring/mengevaluasi hasil pengikatan.
4.2
Prediksi pori-pori molekul kecil berdasarkan geometri
Sejumlah penelitian eksperimental telah mengungkapkan bahwa beberapa mutasi yang jauh dari pusat aktif dapat berdampak besar pada kinerja katalitik enzim. Beberapa situs ini dapat bertindak dengan mengubah pori pengikatan substrat/pelepasan produk, dan ukuran pori, sifat fisikokimia residu di sekitar pori, dll. dapat mengubah laju lintasan substrat/produk dan memengaruhi selektivitas substrat. Metode prediksi pori dapat digunakan untuk menemukan residu panas yang relevan dan memberikan dasar untuk desain pustaka evolusi terarah. Beberapa metode berbasis struktur geometris tersedia untuk memprediksi lubang permukaan protein, rongga internal, pori-pori yang menghubungkan berbagai daerah, dll. [51-53]. Metode-metode ini menggunakan struktur spasial statis sebagai input, dan sebagian besar menggunakan metode geometris dan teori grafik untuk merealisasikan prediksi dengan efisiensi komputasi yang tinggi.
4.3
Metode Perbandingan Pusat Aktif
Saat ini, sejumlah besar data struktur 3D enzim dengan jenis dan famili struktur yang berbeda telah terakumulasi dalam Protein 3D Structure Database (PDB). Jika kita membandingkan enzim yang berbeda, kita akan menemukan bahwa beberapa di antaranya memiliki tingkat kemiripan yang tinggi pada pusat aktif (contoh tipikal adalah pusat aktif triad katalitik yang dimiliki oleh protease serin), meskipun urutan struktur keseluruhan tidak serupa. Metode perbandingan struktur pusat aktif [54-55] dapat digunakan untuk secara otomatis mengambil pusat aktif enzim lain yang mirip dengan pusat aktif enzim saat ini. Menumpuk beberapa pusat aktif yang serupa bersama-sama dalam ruang tiga dimensi dan menganalisis persamaan dan perbedaan antara pusat aktif yang berbeda dapat memberikan informasi yang berharga untuk pemilihan lokasi mutasi.
5
Ringkasan
Demi kejelasan penyajian, pengenalan kami mengenai berbagai metode di atas dikategorikan. Dalam praktiknya, berbagai jenis metode yang berbeda tidak saling terpisah. Metode-metode tersebut dapat digunakan dalam kombinasi dengan berbagai cara untuk menjawab pertanyaan-pertanyaan yang kita minati dengan lebih baik. Misalnya, dalam simulasi kompleks enzim-substrat, docking molekuler dapat digunakan untuk mendapatkan konformasi awal dari simulasi; kumpulan konformasi yang diperoleh dari simulasi MD dapat digunakan untuk analisis prediksi pori, docking molekuler, simulasi QM/MM, dll.Model MM yang menuliskan keadaan transisi yang diperoleh dari model QM atau QM / MM dapat dibangun dan digunakan untuk simulasi MD klasik dalam waktu lama untuk menganalisis efek naik turunnya konformasi pada proses kimia, atau untuk mensimulasikan sejumlah besar mutan untuk mewujudkan penyaringan virtual mutan berdasarkan simulasi MD; pendekatan MM / PBSA, yang telah kami sebutkan, merupakan kombinasi dari pemodelan MD dan pemodelan medium kontinum, dan seterusnya.
Studi tentang sistem biomolekul seperti protein dengan metode kimia komputasi memiliki sejarah lebih dari 40 tahun. Metode-metode ini telah digunakan secara luas dalam penelitian enzim industri sambil terus mengembangkan diri. Tim peneliti Tiongkok dalam bidang kimia komputasi dan rekayasa enzim industri berkembang dan kemampuan penelitian mereka meningkat pesat. Penerapan kimia komputasi dalam rekayasa enzim akan diperluas dan diperdalam seiring dengan semakin eratnya kombinasi silang kedua disiplin ilmu ini. Rekayasa protein, evolusi terarah, dan teknik lainnya telah memberikan dampak yang besar pada penelitian enzim industri. Pengembangan metode komputasi di masa depan, terutama terobosan metode desain enzim baru, diharapkan dapat membawa terobosan teknologi baru untuk penelitian enzim industri di era biologi sintetik.
Hubungi Kami Sekarang!
Jika Anda membutuhkan Harga, silakan isi informasi kontak Anda di formulir di bawah ini, kami biasanya akan menghubungi Anda dalam waktu 24 jam. Anda juga bisa mengirim email kepada saya info@longchangchemical.com selama jam kerja (8:30 pagi hingga 6:00 sore UTC+8 Senin-Sabtu) atau gunakan obrolan langsung situs web untuk mendapatkan balasan secepatnya.
| Senyawa Glukoamilase | 9032-08-0 |
| Pullulanase | 9075-68-7 |
| Xilanase | 37278-89-0 |
| Selulase | 9012-54-8 |
| Naringinase | 9068-31-9 |
| β-Amilase | 9000-91-3 |
| Glukosa oksidase | 9001-37-0 |
| alfa-Amilase | 9000-90-2 |
| Pektinase | 9032-75-1 |
| Peroksidase | 9003-99-0 |
| Lipase | 9001-62-1 |
| Katalase | 9001-05-2 |
| TANNASE | 9025-71-2 |
| Elastase | 39445-21-1 |
| Urease | 9002-13-5 |
| DEXTRANASE | 9025-70-1 |
| L-Laktat dehidrogenase | 9001-60-9 |
| Dehidrogenase malat | 9001-64-3 |
| Kolesterol oksidase | 9028-76-6 |