Modification des souches productrices de protéases

La protéase est une classe d'enzymes qui catalyse l'hydrolyse des liaisons peptidiques dans les protéines. Elle est largement répandue chez les animaux, les plantes et les micro-organismes et constitue l'une des préparations enzymatiques les plus utilisées dans les espèces d'enzymes industrielles, représentant environ 60% de la quantité totale d'enzymes. Les sources microbiennes de protéases sont abondantes, diversifiées et faciles à produire, devenant ainsi la principale source de protéases sur le marché. La production commerciale de protéases remonte au début du siècle dernier : en 1908, les Allemands ont commencé à utiliser des enzymes pancréatiques pour le tannage du cuir ; en 1911, la société américaine Wallerstein a produit de la papaïne comme agent clarifiant pour la bière ; au début des années soixante, les Pays-Bas ont produit des détergents en y ajoutant de la protéase. En outre, la recherche sur la protéase alcaline a été combinée à des travaux pratiques de sélection et d'élevage de bactéries résistantes à la chaleur, à l'acide et au sel, ainsi qu'à la production de protéase alcaline à partir de pétrole comme matière première de fermentation.

 

Il existe de nombreux types de protéases, dont le poids moléculaire, la taille, la structure spatiale et la fonction sont très différents, mais chaque famille de protéases conserve un domaine structurel hautement conservé. À l'heure actuelle, plus de 100 types de protéases ont été cristallisés ou hautement purifiés, et nombre d'entre eux ont été élucidés en termes de structures primaire et stéréo (structure tertiaire).

 

 

2 Modification des souches de protéase

La construction de bactéries d'ingénierie pour l'expression efficace de la protéase et l'optimisation de ses propriétés enzymatiques ont été le point de mire des chercheurs nationaux et étrangers, et les moyens habituellement utilisés sont : la reproduction par mutation, la fusion protoplasmique, la construction de bactéries génétiquement modifiées et la technologie de l'évolution directionnelle in vitro.

 

2.1 Sélection par mutagenèse et fusion protoplasmique

La sélection par mutagenèse fait principalement appel à la mutagenèse par rayonnement ou à certains réactifs chimiques pour induire des mutations dans le matériel génétique de la bactérie afin d'obtenir des souches mutantes présentant d'excellentes caractéristiques. Par exemple, après mutagenèse UV de souches productrices d'enzymes par Cai Wanling et al, leur activité enzymatique a augmenté de 16% par rapport à la souche d'origine. Yanli Li et al. ont criblé l'activité enzymatique de production de protéase neutre d'Aspergillus oryzae ZW-06 jusqu'à 15 000 U/g de caillé sec par mutagenèse dirigée par Co60, ce qui représente une augmentation de 74% par rapport à l'activité avant mutagenèse. Huang Hongying et al. ont combiné la technologie d'implantation d'ions N+ à faible énergie sur le Bacillus licheniformis de type sauvage pendant quatre fois avec différents moyens physicochimiques de mutagenèse, pour obtenir une souche à haut rendement, l'activité enzymatique brute étant de 12425. 9 U/mL, soit 17,1 fois plus que la souche de départ.

 

 

La technologie de fusion protoplasmique est un processus dans lequel les cellules d'une souche biparentale sont désinstallées pour la fusion protoplasmique, afin d'échanger et de recombiner leurs génomes pour obtenir des recombinants stables. Par exemple, Pan Yanyun et al. ont utilisé la méthode de fusion protoplasmique pour fusionner Bacillus licheniformis 2709 avec Bacillus subtilis BD105, qui contient le vecteur de clonage du gène de la protéase alcaline pDW2, afin d'obtenir une souche A16 à haut rendement, dont la production d'enzymes de fermentation est supérieure de 50%-100% à celle de 2709, et dont la production d'enzymes peut atteindre 30 000 U/mL dans le test de la fiole agitée.

 

2.2 Construction de bactéries pour le génie génétique

La construction de bactéries d'ingénierie nécessite généralement des hôtes d'expression et des vecteurs d'expression ou des éléments d'expression appropriés. Tout d'abord, le gène cible est cloné dans le vecteur d'expression pour obtenir le vecteur recombinant, puis transformé dans l'hôte d'expression, soumis au processus de criblage, et enfin obtenu le processus de souche à haut rendement. Il est également possible d'intégrer les fragments du gène cible exogène directement dans le génome de l'hôte pour obtenir des souches à haut rendement.

 

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Min Zhang et al. ont ligaturé la séquence promoteur-peptide signal ( sacR ) du gène sacB avec le gène de la protéase neutre de Bacillus subtilis et l'ont cloné dans le vecteur pHP13, ont construit le vecteur de sécrétion d'expression inductible pHP13SN contenant le gène de la protéase neutre, et l'ont ensuite transformé en Bacillus subtilis DB104, qui a montré une augmentation de 48% de la viabilité de l'enzyme par rapport à celle de la souche de départ. WangHui et al. ont cloné Banpr, une protéase neutre de Bacillus amyloliquefaciens K11, et ont construit un plasmide d'expression recombinant, pUB110-Banpr, avec Bacillus amyloliquefaciens K11 comme hôte d'expression, et l'activité enzymatique dans la fermentation en fiole agitée a atteint 8995 ± 250 U/mL, et 28084 ± 1282 U/mL dans le système de fermentation de 15 L, ce qui était beaucoup plus que la souche industrielle Bacillus subtilis AS.1398 (8000-10000 U/mL).

 

2.3 Amélioration des propriétés de la protéase

Avec le développement des techniques d'évolution dirigée in vitro, des protéines aux fonctions améliorées ou nouvelles peuvent être obtenues par mutation aléatoire des gènes codants, par des techniques de DNAShuffling et par criblage dirigé sans que l'on connaisse les informations structurelles tridimensionnelles et le mécanisme d'action de la protéine cible.

 

 

La stabilité de l'enzyme est un facteur clé du succès de la commercialisation. La stabilité de l'enzyme peut être améliorée en introduisant des ponts salins, des liaisons disulfures, des interactions aromatiques et en augmentant l'affinité de l'enzyme pour les ions calcium, ce qui accroît la rigidité de la molécule par mutagenèse ciblée. Le remplacement de Gly61 ou Ser98 de la protéase BPN' par Cys, et des deux, a entraîné une augmentation de la stabilité thermique de l'enzyme sans modification de l'efficacité catalytique.

 

En remplaçant Val72 par Ile, Ala92 par Thr et Gly131 par Asp de la protéase de B. subtilis, l'enzyme mutante peut catalyser une activité de substrat 2 fois supérieure à celle de l'enzyme sauvage à 10°C. En 2005, la société danoise Novozymes a lancé une protéase à basse température, la "Polarzyme", qui peut être ajoutée à un détergent. En l'ajoutant au détergent, la température de lavage est passée de 60°C et 40°C à 30°C et 20°C, ce qui a permis d'économiser 60% d'énergie électrique, et le volume des ventes du détergent "carecoldwash" contenant de la protéase à basse température a été multiplié par sept.

 

3 Perspectives

Les protéases ont été utilisées dans une variété de domaines étroitement liés à notre vie quotidienne, et cet environnement impose des exigences élevées en matière de production et de caractérisation des protéases. Par conséquent, la compréhension approfondie du mécanisme catalytique de la protéase, la relation entre la structure spatiale et la fonction catalytique, et la modification directionnelle des souches productrices d'enzymes pour répondre aux exigences de la production industrielle constituent toujours la tendance de développement de l'ingénierie enzymatique à l'avenir. En outre, outre la sélection et l'élevage de bonnes souches, il faut s'efforcer de construire de nouveaux systèmes d'expression ou des systèmes de co-expression de gènes de protéases multiples, de construire davantage de vecteurs d'expression pour les protéases, afin de réaliser l'expression efficace de différents composants et d'améliorer encore la quantité d'expression, l'activité enzymatique et la stabilité de l'enzyme.

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Composé Glucoamylase	9032-08-0
Pullulanase	9075-68-7
Xylanase	37278-89-0
Cellulase	9012-54-8
Naringinase	9068-31-9
β-Amylase	9000-91-3
Glucose oxydase	9001-37-0
alpha-amylase	9000-90-2
Pectinase	9032-75-1
Peroxydase	9003-99-0
Lipase	9001-62-1
Catalase	9001-05-2
TANNASE	9025-71-2
Elastase	39445-21-1
Uréase	9002-13-5
DEXTRANASE	9025-70-1
L-Lactique déshydrogénase	9001-60-9
Déshydrogénase malate	9001-64-3
Cholestérol oxydase	9028-76-6