Wie sieht der Prozess der Bioenzymproduktion aus?

1. die Herstellung von Enzymen

Enzyme werden aus Mikroorganismen, Tieren und Pflanzen gewonnen, aber die Hauptquelle sind Mikroorganismen. Da Mikroorganismen mehr Vorteile als Pflanzen und Tiere haben, werden in der Regel ausgezeichnete enzymproduzierende Stämme ausgewählt, um Enzyme durch Fermentation zu produzieren. Um die Enzymkonzentration in der Fermentationsbrühe zu erhöhen, werden hervorragende Stämme ausgewählt, gentechnisch veränderte Bakterien entwickelt und die Fermentationsbedingungen optimiert. Die industrielle Produktion erfordert besondere Leistungen neuer Enzyme, wie z. B. hochtemperaturbeständige α-Amylase, alkaliresistente Protease und Lipase usw. Daher müssen wir Stämme erforschen und entwickeln, die eine besondere Leistung neuer Enzyme erbringen.

2. die Zubereitung von Enzymen

Die Technologie der Enzymabtrennung und -reinigung ist das Herzstück des aktuellen biotechnologischen "Nachbehandlungsprozesses". Mit einer Vielzahl von Trennungs-und Reinigungstechniken, von mikrobiellen Zellen und ihre Fermentationsbrühe, oder tierischen und pflanzlichen Zellen und ihre Kulturbrühe in der Trennung und Reinigung von Enzymen, von hochaktiven Enzympräparate von unterschiedlicher Reinheit gemacht, um Enzympräparate weiter in allen Aspekten der Volkswirtschaft verwendet werden, müssen die Aktivität von Enzympräparaten, Reinheit und Ausbeute zu verbessern, die Notwendigkeit, die neue Trennung und Reinigungstechniken zu studieren.

3. die Immobilisierung von Enzymen und Zellen

Die Forschung zur Immobilisierung von Enzymen und Zellen ist die zentrale Aufgabe der Enzymtechnik. Um die Stabilität von Enzymen zu verbessern, Enzympräparate wiederzuverwenden, den Anwendungsbereich von Enzympräparaten zu erweitern, wird eine Vielzahl von Immobilisierungsmethoden für die Immobilisierung von Enzymen verwendet, die Herstellung von immobilisierten Enzymen, wie z.B. immobilisierte Glukose-Isomerase, immobilisierte Carbamoylase, usw., die Bestimmung von immobilisierten Enzymen und immobilisierten Enzymen für die Anwendung verschiedener Aspekte der Entwicklung der Forschung. Immobilisierte Enzyme haben nach wie vor eine starke Vitalität. Es wird von verschiedenen Bereichen wie Biochemie, Chemietechnik, Mikrobiologie, Polymere und Medizin sehr geschätzt.

Immobilisierte Zellen werden auf der Grundlage von immobilisierten Enzymen entwickelt. Für die Immobilisierung von mikrobiellen, tierischen und pflanzlichen Zellen werden verschiedene Immobilisierungsmethoden verwendet, um eine Vielzahl immobilisierter biologischer Zellen herzustellen. Die Untersuchung der enzymatischen Eigenschaften immobilisierter Zellen, insbesondere der kinetischen Eigenschaften, sowie die Erforschung und Entwicklung immobilisierter Zellen für verschiedene Anwendungen ist heutzutage ein wichtiges Thema in der Enzymtechnik.

Die Immobilisierungstechnologie ist ein wichtiger Meilenstein in der Modernisierung der Enzymtechnologie. Sie ist eine bahnbrechende Technologie, um die Unzulänglichkeiten natürlicher Enzyme in industriellen Anwendungen zu überwinden und die Eigenschaften der Enzymreaktion voll zur Geltung zu bringen. Man kann sagen, dass es keine moderne Enzymtechnologie ohne die Entwicklung der Immobilisierungstechnologie gibt.

4. Molekulare Veränderung von Enzymen

Auch bekannt als molekulare Modifikation von Enzymen. Um die Stabilität des Enzyms zu verbessern, die Antigenität zu verringern, die Halbwertszeit von medizinischen Bakterien im Körper zu verlängern, werden verschiedene Modifizierungsmethoden verwendet, um die Struktur des Enzymmoleküls zu verändern, um ein natürliches Enzym zu schaffen, das nicht über einige hervorragende Eigenschaften verfügt (wie z. B. höhere Stabilität, keine Antigenität, Widerstand gegen Protease-Hydrolyse usw.), und sogar eine neue Enzymaktivität zu schaffen, um die Anwendung des Enzyms zu erweitern, um den Wert der Enzymanwendung zu erhöhen und größere wirtschaftliche und soziale Vorteile zu erzielen. und soziale Vorteile.

Die molekulare Modifikation von Enzymen kann unter zwei Gesichtspunkten durchgeführt werden:

(1) Verwenden Sie die Protein-Engineering-Technologie, um das Gen für die Struktur des Enzymmoleküls zu modifizieren, in der Erwartung, ein neues Enzym (mutiertes Enzym) mit ausgezeichneten Eigenschaften und hoher Aktivität zu erhalten, das eine angemessene Primärstruktur und Raumstruktur aufweist.

(2) Chemische oder enzymatische Veränderung der Primärstruktur von Enzymproteinen oder chemische Veränderung des Enzymmoleküls mit chemischer Veränderung der Seitenkettengruppe. Dadurch werden die enzymatischen Eigenschaften verändert. Diese Enzyme sind besonders nützlich für die Grundlagenforschung in der Enzymologie und in der Medizin.

Bei den Mikroorganismen, die für die Herstellung von Enzymen verwendet werden, handelt es sich um Fadenpilze, Hefen und Bakterien in drei großen Gruppen, wobei es sich hauptsächlich um aerobe Bakterien handelt. Die Stämme und Verwendungszwecke mehrerer wichtiger industrieller Enzyme sind nachstehend aufgeführt:

Amylase

Amylasen hydrolysieren Stärke, um pastöse Malzoligosaccharide und Maltose zu erzeugen. Die Herstellung erfolgt überwiegend durch Tiefenfermentation mit Bacillus subtilis und Bacillus licheniformis der Gattung Bacillus, wobei letzterer hitzebeständige Enzyme produziert. Tiefe und halbfeste Fermentationen mit Stämmen von Aspergillus und Rhizopus werden ebenfalls für die Lebensmittelverarbeitung verwendet [6] . Amylasen werden hauptsächlich bei der Zuckerherstellung, der Textilentschlichtung, der Behandlung von Fermentationsrohstoffen und der Lebensmittelverarbeitung eingesetzt. Glucoamylase kann Stärke zu Glukose hydrolysieren, die heute fast ausschließlich durch Tiefenfermentation von Aspergillus niger hergestellt wird, und wird in der Zuckerproduktion, der Alkoholproduktion und der Verarbeitung von Fermentationsrohstoffen eingesetzt.

Protease

Die Verwendung von Stämmen und die Produktion der meisten Sorten. Mit Flechten-förmigen Bacillus, kurze kleine Bacillus und Bacillus subtilis, um tiefe Gärung Produktion von bakteriellen Protease; mit Streptomyces, Aspergillus tiefe Gärung Produktion von neutralen Protease und Aspergillus saure Protease, für Leder Enthaarung, Pelz Erweichung, Pharmazeutika, die Lebensmittelindustrie verwendet; mit Trichoderma spp. einige der Bakterien in halbfesten Gärung Produktion von Lab bei der Herstellung von Käse anstelle von Lab aus dem Magen des ursprünglichen Kalb extrahiert.

Glukose-Isomerase

Eine Art hat sich in den 70er Jahren rasch entwickelt. Streptomyces-Zellen werden zunächst durch tiefe Fermentation gewonnen, und nach der Immobilisierung wird die Glukoselösung in einen Sirup umgewandelt, der etwa 50% Fruktose enthält, die in der Lebensmittelindustrie anstelle von Saccharose verwendet werden kann. Mit Amylase, Glucoamylase und Glucose-Isomerase, etc. wird aus Maisstärke in Sirup hat sich zu einem der aufstrebenden Zuckerindustrie.

Auswahl der Expressionssysteme
1 E. coli-Expressionssystem
①pET-Expressionssystem wird bevorzugt
② Die rekombinante Proteinexpression und -reinigung kann unter Verwendung von solubilisierten Tags erfolgen, wobei MBP die erste Wahl ist.
③ Bevorzugt pET24 oder pET28 (falls eine Reinigung erforderlich ist) mit BL21(DE3), TB-Medium 37°, Wachstum auf 1-1,5 OD, 18 ℃ Wachstum für 1 Stunde auf 3 OD, 0,5 mM IPTG-Induktion für 19 Stunden auf OD bis 10.
④ Rettungsmaßnahmen für hohe Expression und geringe Löslichkeit: Abkühlung auf bis zu 15 ℃; Wechsel des Mediums zu 2xYT oder ZYP5052 (selbstinduziert), Wechsel des Expressionswirts; Trunkierung der N-terminalen und/oder C-terminalen 2-10 Aminosäurereste; Expression durch Fusion mit hochlöslichen Proteinen wie MBP; chemische Induktion molekularer Chaperone, Koexpression molekularer Chaperone/interagierender Proteine oder Bereitstellung von Liganden.
⑤ Vor- und Nachteile des E. coli-Expressionssystems
Vorteile: am bequemsten, am effektivsten
Nachteile: schwache Fähigkeit zur Sekretion und Expression; Schwierigkeiten bei der Bildung von Disulfidbindungen; keine posttranslationale Modifikation

2 Hefe-Expressionssystem (Picrosporum)
Vorteile: stabile Integration exogener Gene; der Promotor des Alkoholoxidase-Gens ist stark, und die Expression kann durch Methanol streng reguliert werden; rekombinante Proteine können in intrazellulärer oder extrazellulärer Form exprimiert werden; enthält Funktionen zur posttranslationalen Modifikation, wie sie bei eukaryotischen Expressionssystemen üblich sind; es gibt kommerzielle Wirte/Vektoren, die einfach zu handhaben sind; die Amplifikation ist einfach, und die Fermentationsdichte ist extrem hoch.
Nachteile: einzigartige Form der posttranslationalen Verarbeitung; Problem der übermäßigen Glykosylierung.

3 Die erste Wahl ist das in der Literatur beschriebene Expressionssystem, die zweite Wahl ist das E. coli-System, und das Hefe-System wird verwendet, wenn die Expression in E. coli inaktiv ist. Je nach Quelle des Gens, um das Expressionssystem zu bestimmen, wird das Gen mit Affinitäts-Tags versehen, um die Reinigung zu erleichtern.

Enzymatische Veränderung
①Rationales Design: basierend auf der Proteinstruktur und den Informationen über die Funktion des kodierenden Gens und dem Rekombinations-Expressionstest.
Verfahren: Zunächst wird die Enzymstruktur aus der BRENDA-Datenbank entnommen, dann die Enzymstruktur modifiziert und die Enzymstruktur mit Alphafold2 vorhergesagt, dann eine Docking-Analyse zwischen Enzym und Ligandenmolekül mit der PyMOL-Software durchgeführt und schließlich die Gensequenzen entsprechend der neuen Enzymstruktur in der Richtung mutiert und dann rekombinant exprimiert, um ein neues Enzym zu erhalten (um die thermische Stabilität, die katalytische Effizienz und die Substratspezifität des Enzyms zu verbessern).
② Irrationales Design: Hochfrequente Mutation oder Rekombination kodierender Sequenzen und rekombinante Expression sowie Hochdurchsatztests

Ab-initio-Entwurfsprozess: 1. Entwicklung eines Kraftfelds und eines Sampling-Algorithmus 2. Hochdurchsatztests 3. Strukturidentifizierung

Gezielte Evolution von Proteinen
①Auswahl der Original-Gene
②Einrichtung einer Bibliothek mit verschiedenen Genmutationen
Verknüpfung mehrerer mutierter Gene in Vektoren und deren Expression in entsprechenden Stämmen
④ Wählen Sie ein hochwertiges mutiertes Gen durch Screening aus und exprimieren Sie das mutierte Gen dann in großen Mengen.

Methoden zur Erzeugung von Mutantengenbibliotheken
①In vivo hochfrequente Zufallsmutation: Verwendung von E. coli XL1-Red als Genreplikationswirt (defektes DNA-Schadensreparatursystem)
Bei einer Kultivierung bis zum Plateaustadium tritt im Durchschnitt 1 Basenmutation in 2Kb auf.
②Random-Mutagenese-Kit: Mutationsrate 0,1 -1,6% /PCR, entspricht 1-16 Basenmutationen/Gen
③ Punkt-für-Punkt-Sättigungsmutagenese

Natürliche Evolution: Spontane Mutation, Rekombination, natürliche Selektion
Landwirtschaftliche Evolution: Spontanmutation, Züchtung, Screening
Evolution im Labor: Beschleunigte Mutationsrate, molekulare Züchtung, Screening

DNA-Mischung
Experimentelle Strategie für das Protein-Engineering
Wählen Sie das Ausgangsgen aus, um ein Inaktivierungssystem und/oder eine Screening-Methode zu entwickeln.
Wenn die Struktur-Funktions-Beziehung bekannt ist, sollten Sie zunächst die Methode des rationalen Designs anwenden.
③Feinabstimmung von Zufallsmutationen und Hochdurchsatz-Screening
④ Entwerfen Sie nur dann von Grund auf neu, wenn es kein geeignetes Ausgangsgen gibt.

Techniken der Proteinforschung
1 Physikalische und chemische Eigenschaften im Zusammenhang mit der Abtrennung und Aufreinigung von Proteinen
Molekulare Größe (Dialyse, Ultrafiltration, Gelfiltration, Zentrifugation)
②Molekulare Form (Gradientenzentrifugation, Elektrophorese)
(iii) Geladene Eigenschaften (Elektrophorese, Ionenaustauschchromatographie)
(iv) Solubilisierungseigenschaften (Versalzung, Ausfällung in organischen Lösungsmitteln)
⑤ Unterschiede in der spezifischen Bindung an Liganden (Immunaffinitätschromatographie, Bioaffinitätschromatographie, Metallchelat-Affinitätschromatographie)
(vi) Adsorptionseigenschaften (hydrophobe Chromatographie)
(vii) Denaturierung und Denaturierung (Denaturierung und Denaturierung von Harnstoff)

2 Proteinexpressionssystem
① Bakterielles Expressionssystem: kurzer Zyklus, hohe Effizienz, geringe Kosten, aber keine posttranslationale Modifikation. Hauptsächlich verwendet für die Produktion von prokaryotischen Proteinen, einfache eukaryotische Proteine.
Auswahl des Expressionsvektors: pet-Serie, pGEX-Serie, PQE30......
Auswahl der Expressionsstämme: BL21(DE3), Rosetta, M15......
Induktionsbedingungen: IPTG-Konzentration, Temperatur und Zeitdauer
Aufreinigung: Ni-NTA (His-Tag), Strep-Perlen, GST.....

② Hefeexpressionssystem: kurzer Zyklus, hohe Effizienz, geringe Kosten, posttranslationale Modifikation vorhanden. Es kommt zu einer unangemessenen Glykosylierung, hohe Mannose-Modifikation. Hauptsächlich für die Herstellung von intrazellulären/sekretorischen Proteinen, disulfidbindenden Proteinen und glykosylierten Proteinen verwendet.

(iii) Bakteriophagen-Expressionssystem: hohe Genkapazität, proteinlöslich, geeignet für die Produktion von toxischen Proteinen, posttranslationale Modifikationen ähnlich wie bei Säugetieren. Die Kultivierungsbedingungen sind rau und es fehlen einige Glykosylierungsmodifikationen. Hauptsächlich verwendet für die Produktion von Membranproteinen, großvolumigen Proteinen, viralen Impfstoffen, Signalproteinen, Zytokinen und Kinasen.
Das Baculovirus-Genom hat eine enorme Kapazität für exogene Geninsertionen von bis zu 38 kb.
Baculoviren werden in Insektenzellen produziert und vermehren sich nicht in Säugetierzellen.
Vorteile: Baculoviren können effizient in Säugetierzelllinien, einschließlich Primär- und Stammzellen, transduziert werden.
Sicherheit (keine Replikation in Säugetierzellen) und keine beobachtbaren zytopathischen Wirkungen
Gefroren gelagerte vortransduzierte Zellen können auch als Testpräparatzellen verwendet werden
Übertragbarkeit (für die Analyse von pharmakologisch relevanten Zelltypen)
Schnelligkeit der Testentwicklung (keine Notwendigkeit, Zeit mit der Herstellung stabiler Zelllinien zu verbringen)

④ Säugetier-Expressionssysteme: lange Zykluszeit, geringe Effizienz, Vorhandensein posttranslationaler Modifikationen, hohe Bioaktivität der Proteine. Hauptsächlich für die Herstellung komplexer eukaryotischer Proteine, die präzise PTM erfordern.
Transiente Expression von Proteinen: PEI- oder Liposomen-Transfektionsreagenzien
Stabile Zelllinienentwicklung: Flp-In™ Jump-In™ Zellentwicklungsplattformen
Induzierbare Expression: Tetracyclin-regulierte Expression
Expression durch Viren: lentivirales Expressionssystem für die Funktionsanalyse; adenovirales Expressionssystem für die Proteinproduktion

3 Proteinaufreinigung
Warum müssen wir Proteine aufreinigen?
Charakterisierung der Struktur und Funktion von Proteinen von Interesse.
(ii) Untersuchung von Proteinregulierung und Proteininteraktionen
③ Antikörper erzeugen
Reinigungsmethoden
Basierend auf physikalischen/chemischen Eigenschaften
Proteingröße: Dialyse, Ultrafiltration, Gelfiltrationschromatographie
Proteinladung: Ionenaustauschchromatographie
Hydrophobizität von Proteinen: Chromatographie mit hydrophober Wechselwirkung

Basierend auf biologischen Eigenschaften: Affinitätschromatographie

①Dialyse
Einflussfaktoren: MWCO des Dialyseschlauchs; Puffervolumen; Dialysezeit; Häufigkeit des Wechsels des Dialysepuffers

Ultrafiltration
Zentrifugalfiltration: Die Größe der Proteine ist kleiner als die Porengröße des Filterröhrchens, sie werden auf den Boden des Röhrchens zentrifugiert.

③ Gel-Filtrations-Chromatographie
Trennen von Proteinen unterschiedlicher Größe

Ionenaustauschchromatographie
Kationenaustauschersäule: Gel ist negativ geladen, Protein ist positiv geladen
Anionenaustauschersäule: Gel ist positiv geladen, Protein ist negativ geladen
Mittel
Inerter Träger: Agarose, Dextran
Geladene Gruppen: Carboxymethyl: negativ geladen, Diethylamino: positiv geladen
Ausgleichende Ionen: negativ geladene Gruppen: H+ oder Na+ positiv geladene Gruppen: OH- oder Cl-
Schrittweise oder Gradientenelution von Proteinen durch Erhöhung der Salzkonzentration oder Änderung des pH-Werts.

⑤ Affinitätschromatographie
Die Affinitätschromatographie ist eine Methode zur Trennung von Biomolekülen aus einem Gemisch, die auf hochspezifischen makromolekularen Bindungswechselwirkungen zwischen einem Biomolekül und einer anderen Substanz beruht.
Beispiele: Bindung von Antigenen an Antikörper, Bindung von Enzymen an Liganden, Bindung von Glutathion- und GST-Fusionsproteinen, Bindung von Anti-Biotin-Proteinen an biotinbindende Moleküle und Bindung von Metallionen an Polyhistidin-Fusionsproteine.

Immobilisierte Metallchelatchromatographie (IMAC) mit an Poly-(His) gebundenen Metallionen (Ni 2+; Co 2+; Cu 2+) ₆ markierte Proteine.

Reinigung von Strep-markierten Proteinen
Beads können Proteine mit dem Strep-Tag spezifisch adsorbieren, und mit Biotin kann das Protein dann von den Beads eluiert werden. (Das Prinzip ist ähnlich wie beim GST-Pull-Down-Experiment)

ProteinA/Protein G-Affinitätschromatographie
Gentechnisch hergestelltes Protein A und Protein G können spezifisch an die Fc-Region von Säugetier-IgG binden. Durch Bindung von Protein A und Protein G an das Säulenmaterial können IgG und seine Unterklassen und Fragmente durch Affinitätschromatographie gereinigt werden.
Protein A: Molekulargewicht 42kDa, kodiert durch das Spa-Gen, mit 5 isotypischen Immunglobulin-bindenden Strukturdomänen, die jeweils aus 3 Alpha-Helices bestehen.
Protein G: mit einem Molekulargewicht von 65 kDa, kodiert durch das spg-Gen, bindet die Fc- und Fab-Segmente des Antikörpers sowie das Albumin im Serum. Das gentechnisch veränderte Protein G entfernt die Bindungsstelle für Albumin und behält nur die Fc-Bindungsdomäne, die wirksamer ist als Protein A. Das Protein A/Protein G ist ein gentechnisch verändertes Protein, das Albumin bindet.
proteinA/protein G: ist ein gentechnisch hergestelltes Bindungsprotein. Es besteht aus 4 Protein-A- und 2 Protein-G-Immunglobulin-Bindungsdomänen, die einen breiteren Bindungsbereich haben als Protein A oder Protein G allein, und vereint deren Vorteile in einem Protein, das für die Reinigung von IgG aus fast allen Spezies eingesetzt werden kann.

Wie kann das gereinigte Protein identifiziert werden?
SDS-PAGE; HPLC; Massenspektrometrie; Western Blot; Bindungsversuche; Funktionsversuche; Strukturaufklärung.

4 Elektronenmikroskopie
Einzelteilchen-Kryo-Elektronenmikroskopie (Single-Particle-Analysis, SPA)
Kryo-Elektronentomographie-Mikroskopie (Kryo-ET)

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Verbindung Glucoamylase	9032-08-0
Pullulanase	9075-68-7
Xylanase	37278-89-0
Cellulase	9012-54-8
Naringinase	9068-31-9
β-Amylase	9000-91-3
Glukose-Oxidase	9001-37-0
alpha-Amylase	9000-90-2
Pektinase	9032-75-1
Peroxidase	9003-99-0
Lipase	9001-62-1
Katalase	9001-05-2
TANNASE	9025-71-2
Elastase	39445-21-1
Urease	9002-13-5
DEXTRANASE	9025-70-1
L-Milch-Dehydrogenase	9001-60-9
Dehydrogenase Malat	9001-64-3
Cholesterin-Oxidase	9028-76-6