IVD 原料中各种酶的特点和应用是什么？

聚合酶链式反应（PCR）是一种分子生物学技术，用于扩增特定的 DNA 片段，被视为生物体外的 DNA 复制，其中微量的 DNA 片段被扩增到很容易识别和辨认的程度。

在 PCR 反应中，"酶 "起着至关重要的作用，每种 "酶 "都有不同的活性和功能。那么，酶有哪些种类？在 IVD 领域又有哪些应用？

DNA 聚合酶

定义：它是一种以 DNA 为模板，从 DNA 的 5 端复制到 3 端，并催化底物 dNTP 分子聚合形成子 DNA 的酶。

主要活动和作用：催化 DNA 合成。1、聚合。2、3、→5、外切酶活性--校对作用 3、5、→3、外切酶活性--切除修复作用 4、焦磷酸水解作用 5、焦磷酸交换。

IVD 领域常见的 DNA 聚合酶包括Taq热启动酶，在反应体系加热到70℃之前，利用化学修饰封闭Taq酶的活性，从而抑制非特异性扩增。高保真 DNA 聚合酶，包含聚合中心和裂解中心，聚合中心具有 5′-3′ 聚合酶活性，负责聚合；裂解中心具有 3′-5′ 外切酶活性（又称校对活性），负责将未配对的核苷酸切除。(外切酶活性（又称校对活性），负责切除未配对的核苷酸。

逆转录酶

定义：一种酶，以 RNA 为模板，在 5′-3′ 方向合成与 RNA 模板互补的 DNA 单链。

主要活动和作用： 1. RNA 引导的 DNA 聚合酶活性。2.RNase H 活性 3.DNA 引导的 DNA 聚合酶活性。

应用于 IVD 领域：1、反转录聚合酶链反应（RT-PCR） 2、cDNA 文库构建 3、RNA 测序 4、RT-qPCR ，2019 全新皇冠核酸检测配置的系统试剂中，必然会加入反转录酶。这是因为 RNA 病毒必须逆转录为 DNA 才能进行 PCR 反应。

核糖核酸聚合酶

定义：一种以 DNA 或 RNA 链为模板的聚合酶，因为在细胞内具有 DNA 转录的遗传信息，又称转录酶。

主要活动和作用：1、以 DNA 为模板；2、通过聚合反应催化核酸的合成；3、使核苷酸形成 3,→5,-磷酸二酯键；4、根据碱基互补配对原理，沿 5′-3′ 方向转录模板序列。

IVD 领域常见的 RNA 聚合酶包括 T7 RNA 聚合酶，它专门催化 5'→3′ 方向的 RNA 形成过程。目前在体外诊断领域，SAT 技术就是应用 T7 RNA 聚合酶进行 RNA 扩增。该技术已广泛应用于病原体检测、血液病毒筛查和环境微生物检测。

蛋白酶 K

定义蛋白酶 K 是一种从白色念珠菌中分离出来的强力蛋白水解酶，是提取 DNA 的关键试剂。

主要功能：降解膜蛋白和 DNA 结合蛋白，促进 DNA 的游离。在 IVD 领域的应用：用于分离和提取质粒、基因组 DNA、RNA。在病毒核酸检测中，蛋白酶 K 可裂解和灭活病毒壳蛋白，同时释放病毒基因组，完成核酸提取。

UDG 酶

定义：别名尿嘧啶-DNA 糖基化酶，又称尿嘧啶-N-糖基化酶或 UNG 酶。它是形成 DNA 和 RNA 单体并编码遗传信息的化学结构。

功能：有效控制 PCR 残留污染。应用于 IVD：用于临床检测的 PCR 试剂含有 UDG 酶，可防止污染。

内切酶

定义：一类能识别特定核苷酸序列并在每条核苷酸链的特定位点上裂解两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键的酶，称为限制酶。

作用：有 3 种类型：类型 1：既有修饰又有识别裂解，裂解位点离识别序列较远；类型 2：只有识别裂解，裂解位点就是识别序列；类型 3：既有修饰又有识别裂解，裂解位点与识别序列较近。

在 IVD 领域的应用：1，基因定位和基因分离；2，DNA 分子碱基序列分析；3，基因工程编辑；4，DNA 物理图谱的形成。

脱钩酶

定义：利用 ATP 水解提供的能量，解除双链 DNA 核苷酸配对形成的氢键，形成单链 DNA。

作用：在 DNA 或 RNA 复制过程中催化 DNA 或 RNA 的解旋。

应用于 IVD 领域：等温扩增技术，利用热稳定解聚酶代替 qPCR 中的热变性过程，解开双链，延长扩增时间。这种技术不易产生非特异性扩增，也避免了 PCR 循环中升温和降温的过程，只需要简单的检测设备。

修饰酶

定义一种催化稀有碱基掺入 RNA 或 DNA 的酶，或一种修饰原始碱基以防止被限制性内切酶破坏的酶。

作用：对其他酶的结构进行共价修饰，使其在高活性形式和相对低活性形式之间相互转化。

应用于 IVD：5mC/m6A 核酸修饰酶活性检测 HTMR 方法为发现和评估针对 DNA/RNA 甲基化的小分子修饰剂提供了有力证据。

焦磷酸酶

定义：催化一分子焦磷酸转化为两分子磷酸离子的酶。

功能：热稳定性无机焦磷酸酶在 100°C 下加热 4 小时后仍具有 100% 活性，因此可用于 PCR 反应，解除生成的无机焦磷酸酶对 PCR 的抑制，促进 DNA 复制。

taq 抗体

定义抗 Taq DNA 聚合酶的抗体。

功能：在 PCR 扩增过程中，Taq 抗体与 Taq 酶结合，在高温变性前抑制 DNA 聚合酶的活性，并能有效抑制引物的非特异性退火和引物二聚体在低温下引起的非特异性扩增。

在 IVD 中的应用：Taq 抗体的高封闭性可提高新型冠状病毒核酸检测试剂盒的检测灵敏度，有助于新型冠状病毒的检测。

标准的 PCR 过程分为三个步骤：DNA 变性、退火和延伸。灭活反应可在 PCR 开始时进行，升温至 50°C 10 分钟或 95°C 2 分钟，UDG 酶可消除反应体系中污染 DNA 产生的扩增。随后，模板 DNA 经高温变性为单链 DNA。在 DNA 聚合酶和适当温度下，两条引物分别与两条模板 DNA 链退火。Taq 抗体与 Taq 酶结合，抑制 DNA 聚合酶的活性，从而抑制低温下的非特异性扩增。在 PCR 反应中加入无机焦磷酸酶，可将焦磷酸水解为正磷酸，从而提高反应的扩增效率。

原料酶是分子检测行业的上游产业链。2020年，在核酸检测的巨大需求面前，分子诊断试剂的市场需求急剧增加，原料酶行业因此得到了快速发展。在生产方面，由于分子检测原料酶生产技术门槛较高，目前国内市场主要依赖进口。近年来，随着国内生产工艺的兴起，一批原料企业上市，产品种类也逐渐丰富，但不可否认的是，国内IVD原料产业仍处于发展初期，市场份额也相对较小，未来势必存在较大的提升空间。

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