1.柚皮苷酶活性的检测方法

1-1 分光光度法

对硝基苯酚分光光度法以对硝基苯酚-α-鼠李糖苷（pNP- α- Rha）和对硝基苯酚-β-D-吡喃葡萄糖苷（pNP- β-Glu）为底物，检测α-鼠李糖酶和β-葡萄糖苷酶的酶活性。李平采用对硝基苯酚分光光度法，在实验中将黑曲霉β-葡萄糖苷酶加入对硝基苯酚-β-葡萄糖苷（pNPG）溶液中进行酶水解，在400 nm紫外波长处测定吸光度值。根据吸光度值计算出β-葡萄糖苷酶的酶活性。该方法具有较强的底物特异性，但标准底物价格昂贵，且无法测定柚皮苷酶水解食品中苷类化合物的酶活，因此该方法不适合工业化大规模制备柚皮苷酶时的酶活检测。

戴维斯分光光度法的原理是在微碱性条件下，柚皮苷可与 90% 二甘醇发生显色反应，在波长为 420 nm 的紫外光下检测黄色柚皮苷查尔酮的生成。根据所测得的吸光度值，可以计算出底物柚皮苷的剩余量，进而计算得到柚皮苷酶的活性。Wang Weina 等采用改进的 Davis 法，以柚皮苷为底物，加入黑曲霉 FFCC 848 液体发酵产生的柚皮苷酶进行酶解。在 420 纳米紫外光下测量吸光度，然后计算酶活性。戴维斯分光光度法测量酶活力操作简单，速度快，因此被广泛应用于发酵产生柚皮苷酶和固定化柚皮苷酶活力的实时检测。

1-2 高效液相色谱法

高效液相色谱法（HPLC）的原理是在整个水解过程中，对底物柚皮苷、中间产物嘌呤素和最终产物柚皮苷进行准确测定和定量分析，进而计算出酶的活性。陈跃龙等采用高效液相色谱法测定了柚皮苷、熊果苷、杨梅素及其产物的保留时间，实现了完全分离，分辨率大于1.5，有效监测了水解过程中柚皮苷酶对多种苷类的作用，同时准确测定了酶活性。HPLC法具有准确度高、可避免杂质干扰等优点，但与Davis法相比，该方法检测时间较长，操作较为复杂。

1-3 改良的柚皮苷酶活性测定方法

使用改进的戴维斯方法：0.8 mL 0.8 g-L^-1 将用 pH 4.5 缓冲溶液配制的柚皮苷溶液加入含有 40 毫克固定化柚皮苷酶 （或 0.2 毫升游离柚皮苷酶）的反应体系中。将其置于 50 ℃ 恒温水浴中 30 分钟。取 0.1 mL 反应酶水解液，加入 5 mL 二甘醇（体积分数为 90%）和 0.1 mL NaOH 溶液（4 mol-L^-1)放入试管中，混合均匀后放置 10 分钟。在 420 纳米波长处测量混合溶液的吸光度。

柚皮苷酶活性（U）的定义：在 pH 值为 4.5、温度为 50 ℃ 的条件下，每分钟降解 1 μg 柚皮苷所需的酶量为 1 个酶活性单位。酶活比（U-g^-1 或 U-mL^-1) 的定义是：在 pH 值为 4.5、温度为 50 ℃ 的条件下，1 克固定化柚皮苷酶 （或 1 毫升游离的柚皮苷酶 ）所显示的酶活性。相对酶活按下式计算 ：

相对酶活 /% = 酶活/最大酶活×100

标准曲线的测定：柚皮苷标准溶液的质量浓度分别为 0、0.4、0.8、1.2、1.6 g-L^-1然后取 0.1 mL 溶液与 5 mL 二甘醇 (90% , v / v) 和 0.1 mL 氢氧化钠溶液 ( 4 mol-L ) 反应。^-1).混合均匀后放置 10 分钟，在 420 纳米波长处测量混合溶液的光吸收值，并绘制相应的标准曲线。

2.制备柚皮苷酶酶液

将 4 ℃ 下保存的黑曲霉 FFCC uv-11 转移到斜面培养基中，在 30 ℃ 下恒温培养 96 h 得到成熟孢子。孢子悬浮液的吸光度值（OD600 值）在 600 纳米波长下测量，用无菌生理盐水将其 OD600 值调至 0.200。然后将体积分数为 10% 的孢子悬浮液接种到 100 mL 发酵培养基（250 mL 锥形瓶）中。^-1 在冷冻离心机中离心 10 分钟。然后通过抽吸过滤器得到上清液，即所需的柚皮苷酶酶液。冷却至 4 ℃备用。

3.壳聚糖固定化柚皮苷酶的制备

取 3.0 克壳聚糖，用 100 毫升体积分数为 2% 的醋酸溶液溶解，配制成 0.3 克 - L^-1 壳聚糖胶体溶液，超声 20 分钟以去除气泡并使其完全溶解。用针将壳聚糖胶体溶液一滴一滴地注入 0.5 g - L^-1 用 NaOH 冷凝液（1000 mL）形成光滑的颗粒。室温下静置 3 小时，用蒸馏水反复洗涤至中性，用滤纸吸干水分，得到壳聚糖微球。称取 0.4 g 壳聚糖微球，加入 0.4 ml 戊二醛（体积分数为 6%），用蒸馏水反复冲洗微球，直至微球表面无戊二醛为止，恒温振荡 25 ℃ 150 r-min。^-1 交联壳聚糖微球经滤纸干燥后即得。

 他说，将 0.4 g 壳聚糖微球，加入 0.4 mL 会员编号为 6% 的戊二醛，在 150 r - min 时^-1 25 ℃恒温振荡 2 h 后，用蒸馏水反复冲洗微球至其表面无戊基二醛，并用滤纸烘干即得交联壳聚糖微球。取 4 mL 柚皮苷酶酶液，加入到 0.4 g 交联壳聚糖微球中，在 25 ℃、150 r-min 恒温振荡。^-1 用 pH 4.5 缓冲液冲洗载体表面残留的酶液，吸干滤纸上的水分，得到固定化的柚皮苷酶，放入 4 ℃ 冰箱中保存备用。

4.制备磁性硅基壳聚糖（MSC）微球

磁性硅基纳米粒子（MS）的制备过程如图 1 所示。

图 1 磁性硅基纳米粒子的制备示意图

( 1) 首先，磁性铁₃O₄ 用化学共沉淀法制备了柠檬酸修饰的纳米粒子。₃-6H₂O 和 1.61 克 FeSO₄-7H₂O 加入装有 100 mL 去离子水的三颈烧瓶中，在氮气条件下加热至 85 ℃。在 1000 r-min 条件下搅拌^-1 并迅速倒入 10 毫升浓氨水。待溶液变黑后，加入 153 毫克柠檬酸钠。反应 30 分钟后，用磁铁分离生成物，并用去离子水和乙醇多次洗涤固相。铁₃O₄ 获得的纳米颗粒经干燥后备用。

( 2) 然后，采用溶胶-凝胶法制备了磁性硅基纳米粒子（MS），如图 1 所示。实验步骤包括0.1 g Fe₃O₄ 纳米粒子均匀地分散在含有 40 毫升无水乙醇、10 毫升蒸馏水和 1.2 毫升浓氨水的混合溶液中。在 300 r-min 的搅拌条件下^-1的液滴。₃O₄ 纳米粒子加入分散在 30 mL 无水乙醇中的 TEOS（0.4 mL），在室温下进行 12 小时的硅基纳米粒子反应。产物经无水乙醇和蒸馏水多次洗涤，得到磁性硅基纳米粒子（MS），干燥后备用。

如图 2 所示，采用乳液交联法制备了间充质干细胞微球。实验步骤包括将 0.125 g 磁性纳米二氧化硅（MS）均匀分散到 10 mL 壳聚糖溶液中，壳聚糖溶于体积分数为 5.0% 的醋酸溶液中制备的壳聚糖溶液的质量分数为 2.5%，然后将壳聚糖溶液逐滴加入到含有 60 mL 液体石蜡和 1.8 mL 吐温 80 的乳液中。在 40 ℃ 水浴和 800 r-min 条件下搅拌 30 分钟后，将壳聚糖溶液滴加到含有 60 mL 液体石蜡和 1.8 mL 吐温 80 的乳液中。^-1加入 2.0 mL 戊二醛，反应 1 小时。^-1 产物用石油醚、乙醇和蒸馏水多次洗涤，得到 MSC 微球，真空干燥备用。

图 2 磁性硅基壳聚糖微球的制备示意图

5.环氧基磁性硅基壳聚糖微球（MSCE）的制备

0.5 g of dried MSC microspheres prepared by the method of 4 were weighed and added into a conical flask of 50 mL. Then 2.0 mL of of NaOH solution, epichrolohydrin solution and NaBH₄ solution were added into the flask with a certain concentration, respectively. And the reaction was carried out by constant temperature oscillation for a certain time. The reaction mechanism of preparation of MSCE is shown in Figure 3.

Figure 3 The principle of preparation of epoxy-based magnetic silicon-based chitosan microspheres

After activation, the activated microspheres are washed repeatedly with distilled water until there are no free OH- and epoxy groups on the surface to obtain epoxy based magnetic silicon based chitosan microspheres ( MSCE). The detection method is as follows: take 3.0 mL of the washing supernatant and add 1~2 drops of phenolphthalein. After shaking, if it didn’t turn red, it means there have no free OH- with MSCE; take 3.0 mL of the washing supernatant and add 3.0 mL of 1.3 mol·L^-1 sodium thiosulfate and 1 ~2 drops of phenolphthalein, if the solution did not turning red after shaking,  it means there have no free epoxy groups with MSCE. The reaction equation of the detection of epoxy group is as follows:

6 Preparation of MSCE immobilized naringinase enzyme

5.0 g of MSCE prepared by method 5 was added to 50 mL of naringinase enzyme solution with a certain pH, and the reaction was oscillated under a constant temperature water bath, as shown in Figure 4. After the reaction, the microspheres were washed with buffer solution for several times until no free naringinase was found on the surface of the microspheres. The microspheres were drained by a Brinella funnel to obtain MSCE immobilized naringinase enzyme, which was refrigerated at 4 ℃ for later use. 

Figure 4 The principle of preparation of MSCE immobilized naringinase enzyme

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