Anteriormente, mencionamos a conversão de rutina e isoquercitrina. Entre os vários métodos de conversão, o método de conversão com o melhor rendimento e pureza é o uso de métodos catalisados por enzimas, como a α-L-ramnosidase por microrganismos e a Hesperidinase. E a α-L-ramnosidase é geralmente combinada com a β-D-glucosidase para formar a naringinase e desempenhar um papel de catálise e, nos primeiros estudos, os pesquisadores equipararam o conceito de "α-L-ramnosidase" com "Ningrinase". Então, vamos primeiro apresentar o conhecimento básico de naringinase.
A naringinase pode hidrolisar substâncias amargas como a naringina e a hesperidina em frutas cítricas, por isso é usada para desamarrar sucos cítricos e recebeu esse nome. O principal componente amargo das frutas cítricas é a naringina, que pode ser degradada pela naringinase em duas etapas: na primeira etapa, a α-L-ramnosidase hidrolisa a naringina em ramnose e purunina; na segunda etapa, a β-D-glucosidase hidrolisa ainda mais a prunina em naringenina e glicose sem sabor amargo. O mecanismo de hidrólise é mostrado na Figura 1. Entre elas, a purunina contém apenas um terço do amargor.
Figura 1 O mecanismo de hidrólise da naringina pela naringinase
Já em 1938 e 1958, a naringinase foi obtida de sementes de aipo e folhas de toranja por Hall e Ting, respectivamente. Depois disso, os pesquisadores obtiveram a naringinase de outros animais e plantas. Além de animais e plantas, a naringinase está mais amplamente presente em microorganismos. A naringinase usada atualmente na pesquisa e na produção industrial também é derivada principalmente de microrganismos. Entre eles, os fungos naturais são a principal fonte de naringinase, como Aspergillus niger, Aspergillus oryzae e Penicillium. Uma pequena quantidade de naringinase é derivada de levedura. E algumas outras naringinases são derivadas de bactérias, cujas propriedades enzimáticas e escopo de aplicação têm uma grande diferença em relação às dos fungos. A Tabela 1 mostra a naringinase e suas propriedades de diferentes fontes estudadas por alguns acadêmicos.
Tabela 1 Naringinase de diferentes fontes e suas propriedades
Fontes
Cepas
Substrato
Temperatura ideal /°C
OptimumpH
Peso molecular /kDa
planta
Sementes de aipo
Naringina
–
–
–
Folhas de grapefruit
Naringina
50
4.0
–
Fagopyrum esculentum
p-NPR、Rutina
–
–
70
animal
Turbo cornutus
Naringina、p-NPR、Rutina
–
2.8, 4.5~5.0
–
Fígado de porco
diosgenina
42
7.0
47
bactérias
Sphingomonas sp. R1
Naringina
50
8.0
110
Thermomicrobium sp.
p-NPR
70
7.9, 5.0~6.9
104, 107
Pediococcus acidilactici
p-NPR、Rutina、hesperidina
50，70
5.5, 4.5
74, 241
Brevundimonas sp.
Naringina
20~37
6.0~7.0
–
Bifidobacterium dentium
p-NPR、Naringina、Rutina、Poncirina、ginsenosídeo
35
6.0
100
fungo
Aspergillus niger
Naringina、Rutina、hesperidina
40~60
4.0~5.0
65
A. kawachii
Naringina、p-NPR、hesperidina
50
4.0
90
A. oryzae
Naringina、p-NPR、hesperidina、neohesperidina
45
5.0
23
Penicillium decumbens
Naringina、p-NPR、Rutina
–
7.0
120
P. corylopholum
Naringina、Rutina
57
6.5
67
levedura
Pichia angusta
Naringina、Rutina、hesperidina、quercitrina
40
6.0
90
Cryptococcus laurentii
Naringina
–
–
–
Williopsis californica
Naringina
–
–
–
Comparando as propriedades da naringinase derivada de bactérias e fungos na Tabela 1, pode-se observar que, embora o peso molecular da naringinase derivada de fungos seja menor do que o da bactéria, ela é mais adequada para a reação em condições ácidas, portanto, é adequada para a desbancarização do suco cítrico; e para as naringinases derivadas de bactérias, o ambiente de pH ideal para a glicosidase é moderado ou fracamente alcalino, e ela tem uma temperatura de reação mais ampla e boa estabilidade de temperatura.
Com o contínuo aprofundamento da pesquisa e a descoberta da naringinase com diferentes propriedades, a enzima tem sido amplamente utilizada na medicina, nos alimentos e nos cosméticos. A aplicação inicial foi a desbancarização de sucos cítricos. A naringina é a principal substância amarga dos sucos cítricos. Seu limiar de amargor na água e no suco é de cerca de 20 ppm, e seu limiar pode chegar a 50 ppm em alguns sucos cítricos. Isso mostra que quando seu conteúdo atinge 1,5 ppm, as pessoas se sentem amargas. Portanto, no processamento de suco de frutas cítricas e outras frutas, o tratamento de desbaste é um processo indispensável. A naringinase é uma enzima de alta eficiência que pode hidrolisar a naringina e outras substâncias amargas, e a naringinase pode atingir bem o objetivo de desamargurar. Huang Gaoling et al. usaram a naringinase para desinfetar o suco de mel e pomelo Guanxi e hidrolisá-lo a 60 ℃ e pH 3,6 por 100 minutos. A taxa de desbaste do suco pode chegar a mais de 97%. Chen Hong et al. usaram o Aspergillus aculeatus JMUdb058 para obter a naringinase por fermentação em estado sólido e a utilizaram para a desbancarização de sucos de frutas. A taxa de desbaste foi de 99,6%, e foi obtido um efeito de desbaste muito bom.
Ao mesmo tempo, como a naringinase contém α-L-rhamnosidase, ela pode ser usada para produzir especificamente ramnose e purunina. A ramnose é um tipo de metil pentose. Pode ser usada como um intermediário de drogas para sintetizar furaneol cardiotônico e condimentado. Também pode sintetizar aromas e, ao mesmo tempo, pode ser usada como adoçante. Também pode ser usado como agente de teste de penetração intestinal. Tem um efeito anticâncer evidente. Wei Shenghua et al. usaram a naringinase e células em repouso de levedura como catalisadores para transformar a naringina por meio de um método biológico de duas etapas para preparar cristais de ramnose com uma fração de massa superior a 98,5%. A purunina, como um tipo de flavonoide, tem funções exclusivas no campo das atividades imunológicas, anticancerígenas, antivirais e antioxidantes. Portanto, no campo dos setores de alimentos e medicamentos, a purunina tem um importante valor de aplicação. Hu Qunfang e outros usaram a fermentação em estado sólido para produzir α-L-rhamnosidase e realizaram a biotransformação da naringina em condições adequadas, e o teor de purunina no produto foi superior a 95%.
Além disso, usando a atividade reativa da naringinase, a naringinase pode ser usada para melhorar o sabor do vinho. No processo de fermentação do álcool, vários microrganismos produzem algumas substâncias voláteis livres e precursores não voláteis. A α-L-ramnosidase primeiro decompõe esses precursores não voláteis para obter o monoterpenoide β-D-Glucosídeo e, em seguida, a β-D-glucosidase continua a se decompor para liberar monoterpenoides, que têm um efeito significativo na melhoria do sabor do vinho. Manzanares et al. usaram o gene da ramnosidase rha A codificado pelo Aspergillus aculeatus para ser clonado e expresso em levedura e usado junto com a β-D-glucosidase produzida por outras cepas para a fermentação do vinho, resultando em um aumento significativo das substâncias aromáticas no vinho. Dados específicos conforme mostrado na figura 2.
Figura 2 Aplicação da naringinase na fermentação do vinho
Além disso, a naringinase também pode ser usada para produzir antibióticos e converter flavonoides. Por exemplo, a cloropolissporina é um antibiótico glicopeptídeo desglicosilado que tem uma forte resposta inibitória a bactérias Gram-positivas. Sankyo et al. descobriram que a atividade da ramnosidase na naringinase pode ser usada para sintetizar o antibiótico e descobriram que o uso combinado de antibióticos C de cloropoliesporina e antibióticos lactâmicos pode aumentar efetivamente seu efeito antibacteriano em Staphylococcus. Beekwilder et al. obtiveram a ramnosidase de uma bactéria de ácido láctico Lactobacillus plantarum e usaram a enzima na fermentação da polpa de tomate. Eles descobriram que ela pode remover a ramnose da polpa de tomate e melhorar a reação de biotransformação dos flavonoides. Portanto, as bactérias do ácido láctico podem aumentar a taxa de biotransformação dos flavonoides no sistema digestivo humano. Hu Fuliang et al. descobriram que os glicosídeos de flavona da própolis podem ser degradados pela naringinase para sintetizar agliconas, aumentando assim sua atividade antioxidante.
Em resumo, a naringinase tem perspectivas de aplicação muito amplas. A fim de aumentar a reutilização e a estabilidade da naringinase e reduzir os custos de produção industrial, a naringinase é geralmente fixada em um transportador antes da reação. No próximo artigo, vamos nos concentrar no método de fixação da enzima para sua referência.
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