Quais são as características e aplicações das várias enzimas das matérias-primas de IVD?

A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é uma técnica de biologia molecular usada para amplificar fragmentos específicos de DNA, que é considerada uma replicação de DNA fora do organismo, por meio da qual quantidades mínimas de fragmentos de DNA são amplificadas a tal ponto que podem ser facilmente identificadas e reconhecidas.

Nas reações de PCR, as "enzimas" desempenham um papel fundamental, e cada tipo de "enzima" tem uma atividade e uma função diferentes. Então, quais são os tipos de enzimas existentes? E quais são as aplicações no campo de IVD?

DNA polimerase

Definição: É um tipo de enzima que usa o DNA como molde, replica-se da extremidade 5-terminal para a extremidade 3-terminal do DNA e catalisa a polimerização das moléculas de dNTP do substrato para formar o DNA secundário.

Principais atividades e funções: catalisar a síntese de DNA. 1, polimerização. 2, 3, → 5, atividade de exonuclease - função de revisão 3, 5, → 3, atividade de exonuclease - função de reparo de excisão 4, função de hidrólise de pirofosfato 5, troca de pirofosfato.

As polimerases de DNA comuns no campo de IVD incluem: Enzima Taq hot-start, que usa modificação química para encerrar a atividade da enzima Taq antes que o sistema de reação seja aquecido a 70°C, inibindo assim a amplificação não específica. DNA polimerase de alta fidelidade, contendo um centro de polimerização e um centro de clivagem, o centro de polimerização tem uma atividade de polimerase 5′-3′, responsável pela polimerização; o centro de clivagem tem uma atividade de exonuclease 3′-5′ (também conhecida como atividade de revisão), responsável pela excisão dos nucleotídeos não pareados. O centro de clivagem tem uma atividade de exonuclease (também conhecida como atividade de revisão), responsável pela excisão de nucleotídeos não pareados.

transcriptase reversa

Definição: Uma enzima que usa o RNA como molde e sintetiza uma única fita de DNA complementar ao molde de RNA na direção 5′-3′.

Principais atividades e funções: 1. Atividade de DNA polimerase dirigida por RNA. 2. Atividade da RNase H. 3. Atividade da DNA polimerase direcionada ao DNA.

Aplicação no campo de IVD: 1, reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa (RT-PCR) 2, construção de biblioteca de cDNA 3, sequenciamento de RNA 4, RT-qPCR , 2019 New Crown Nucleic Acid Detection configured system reagents, inevitavelmente se juntará à transcriptase reversa. Isso se deve ao fato de que os vírus de RNA devem ser transcritos reversamente para o DNA a fim de realizar reações de PCR.

RNA polimerase

Definição: uma cadeia de DNA ou RNA como modelo de polimerase, porque na célula com a informação genética da transcrição do DNA, também conhecida como transcriptase.

Principais atividades e funções: 1, com o DNA como molde; 2, catalisa a síntese de ácidos nucleicos por meio de reações de polimerização; 3, faz com que os nucleotídeos formem ligações 3,→5,-fosfodiéster; 4, transcreve a sequência do molde na direção 5′-3′ de acordo com o princípio do emparelhamento complementar de bases.

As polimerases de RNA comuns no campo de IVD incluem a polimerase de RNA T7, que catalisa especificamente o processo de formação de RNA na direção 5'→3′. Atualmente, no diagnóstico in vitro, a tecnologia SAT é a aplicação da polimerase de RNA T7 para amplificação de RNA. Essa tecnologia tem sido amplamente utilizada na detecção de patógenos, triagem de vírus sanguíneos e detecção microbiana ambiental.

Proteinase K

Definição: A proteinase K é uma enzima proteolítica potente isolada da Candida albicans e é um reagente essencial para a extração de DNA.

Função principal: degradar as proteínas da membrana e as proteínas ligadas ao DNA e promover a liberação do DNA. Aplicação no campo de IVD: para o isolamento e a extração de plasmídeo, DNA genômico e RNA. Na detecção de ácido nucleico viral, a proteinase K pode clivar e inativar as proteínas do capsídeo viral, liberando o genoma viral para concluir a extração do ácido nucleico.

Enzima UDG

Definição: também conhecido como uracil-DNA glicosilase, uracil-N-glicosilase ou UNGase. É a estrutura química que forma os monômeros de DNA e RNA e codifica as informações genéticas.

Função: Controle eficiente da contaminação residual por PCR. Aplicação em IVD: Os reagentes de PCR para testes clínicos contêm a enzima UDG para evitar a contaminação.

Endonuclease

Definição: classe de enzimas que reconhecem uma sequência específica de nucleotídeos e clivam a ligação fosfodiéster entre dois desoxirribonucleotídeos em um local específico de cada cadeia, denominadas enzimas de restrição.

Função: há três tipos: tipo 1: modificação e clivagem de reconhecimento, o local de clivagem está distante da sequência de reconhecimento. tipo 2: clivagem somente de reconhecimento, o local de clivagem é a sequência de reconhecimento. tipo 3: modificação e clivagem de reconhecimento, o local de clivagem e a sequência de reconhecimento estão mais próximos.

Aplicações no campo de IVD: 1, localização e isolamento de genes, 2, análise da sequência de bases moleculares do DNA, 3, edição de engenharia genética, 4, formação do mapa físico do DNA.

Enzima desconjugadora

Definição: usar a energia fornecida pela hidrólise de ATP para desfazer as ligações de hidrogênio formadas pelo emparelhamento de nucleotídeos de DNA de fita dupla para formar DNA de fita simples.

Função: desempenha uma função na catalisação da desconvolução do DNA ou RNA durante a replicação do DNA ou RNA.

Aplicação no campo de IVD: Tecnologia de amplificação isotérmica, usando enzima desconjugadora estabilizada pelo calor em vez do processo de desnaturação térmica na qPCR, para desfazer a fita dupla e estender a amplificação. Essa técnica é menos propensa à amplificação não específica e também evita o processo de elevação e redução da temperatura no ciclo de PCR, exigindo apenas equipamentos simples para detecção.

Enzima modificadora

Definição: Uma enzima que catalisa a incorporação de bases raras no RNA ou no DNA ou modifica as bases originais para evitar a destruição por endonucleases de restrição.

Função: Modificação covalente da estrutura de outras enzimas para que elas se transformem umas nas outras entre uma forma altamente ativa e uma forma relativamente menos ativa.

Aplicação em IVD: Ensaio de atividade da enzima modificadora de ácido nucleico 5mC/m6A O método HTMR fornece evidências sólidas para a descoberta e avaliação da atividade de moduladores de moléculas pequenas que têm como alvo a metilação de DNA/RNA.

Pirofosfatase

DEFINIÇÃO: uma enzima que catalisa a conversão de uma molécula de pirofosfato em duas moléculas de íons fosfato.

Função: A pirofosfatase inorgânica estável ao calor ainda é 100% ativa quando aquecida a 100°C por 4 horas, portanto, pode ser usada em reações de PCR para eliminar a inibição da PCR pelo pirofosfato inorgânico gerado e aumentar a replicação do DNA.

anticorpo taq

Definição: Anticorpo contra a Taq DNA polimerase.

Função: Durante a amplificação da PCR, o anticorpo Taq se liga à enzima Taq para inibir a atividade da DNA polimerase antes da desnaturação em alta temperatura e pode inibir efetivamente o recozimento não específico dos primers e a amplificação não específica causada pelo dímero do primer em baixa temperatura.

Aplicação em IVD: A alta eficiência de contenção do anticorpo Taq pode melhorar a sensibilidade de detecção do novo kit de detecção de ácido nucleico do coronavírus e ajudar na detecção do novo coronavírus.

O processo padrão de PCR é dividido em três etapas: Desnaturação do DNA, recozimento e extensão. A reação de inativação pode ocorrer no início da PCR por meio do aquecimento a 50 °C por 10 minutos ou 95 °C por 2 minutos, e a enzima UDG elimina a amplificação gerada pelo DNA contaminante no sistema de reação. Posteriormente, o DNA modelo é desnaturado em DNA de fita simples por meio de alta temperatura. Dois primers se unem a duas fitas de DNA modelo, respectivamente, sob DNA polimerase e temperatura adequada. Os primers são novamente estendidos sob a ação da DNA polimerase. O anticorpo Taq se liga à enzima Taq para inibir a atividade da DNA polimerase e inibir a amplificação não específica em baixas temperaturas. A adição de pirofosfatase inorgânica à reação de PCR hidrolisa o pirofosfato em ortofosfato, aumentando a eficiência da amplificação da reação.

Em 2020, diante da enorme demanda por testes de ácido nucleico, a demanda do mercado por reagentes de diagnóstico molecular aumentou drasticamente e, como resultado, o setor de enzimas de matéria-prima se desenvolveu rapidamente. Em termos de produção, devido ao alto limiar técnico da produção de enzimas de matéria-prima para testes moleculares, o mercado doméstico atual depende principalmente de importações. Nos últimos anos, juntamente com o aumento do processo de produção nacional, várias empresas de matéria-prima foram listadas e as categorias de produtos também foram gradualmente enriquecidas, mas é inegável que o setor nacional de matérias-primas para Diagnóstico in vitro ainda está nos estágios iniciais de desenvolvimento, a participação de mercado também é relativamente pequena e o futuro está fadado a ter um espaço maior para melhorias.

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Lipase	9001-62-1
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TANNASE	9025-71-2
Elastase	39445-21-1
Urease	9002-13-5
DEXTRANASE	9025-70-1
L-Láctico desidrogenase	9001-60-9
Malato desidrogenase	9001-64-3
Colesterol oxidase	9028-76-6