Modificação de cepas produtoras de protease
A protease é uma classe de enzima que catalisa a hidrólise de ligações peptídicas em proteínas, amplamente encontrada em animais, plantas e microrganismos, e é uma das preparações enzimáticas mais usadas em espécies de enzimas industriais, representando cerca de 60% da quantidade total de enzimas. As fontes microbianas de proteases são abundantes, diversificadas e fáceis de produzir, tornando-se a principal fonte de proteases no mercado. A produção comercial de protease pode ser rastreada até o início do século passado. Em 1908, os alemães começaram a usar a enzima pancreática para curtimento de couro; em 1911, a empresa Wallerstein dos Estados Unidos produziu papaína como agente clarificador para cerveja; no início dos anos 60, a Holanda produziu detergentes com a adição de protease. Além disso, também combinada com a prática para realizar a seleção e a criação de bactérias resistentes ao calor, aos ácidos e aos sais para a produção de protease, bem como o petróleo como matéria-prima para a produção de fermentação da pesquisa de protease alcalina.
Há muitos tipos de proteases, e seu peso molecular, tamanho, estrutura espacial e função são muito diferentes, mas cada família de proteases ainda mantém um domínio estrutural altamente conservado. Atualmente, mais de 100 tipos de proteases foram cristalizadas ou altamente purificadas, e muitas delas foram elucidadas em termos de suas estruturas primárias e estéreo (estrutura terciária).
2 Modificação de cepas de protease
A construção de bactérias de engenharia para a expressão eficiente de protease e a otimização de suas propriedades enzimáticas têm sido o ponto alto de acadêmicos nacionais e estrangeiros, e os meios normalmente usados são: reprodução por mutação, fusão protoplasmática, construção de bactérias geneticamente modificadas e tecnologia de evolução direcional in vitro.
2.1 Mutagênese, reprodução e fusão protoplasmática
A reprodução por mutagênese ocorre principalmente por meio da mutagênese por radiação ou de alguns reagentes químicos para induzir mutações no material genético da bactéria a fim de obter cepas mutantes com excelentes características. Por exemplo, após a mutagênese por UV de cepas produtoras de enzimas por Cai Wanling et al., sua atividade enzimática aumentou em 16% em comparação com a cepa original. Yanli Li et al. examinaram a atividade da enzima produtora de protease neutra do Aspergillus oryzae ZW-06 até 15.000 U/g de coalhada seca por mutagênese dirigida por Co60, que foi 74% maior do que antes da mutagênese. Huang Hongying et al. combinaram a tecnologia de implantação de íons N+ de baixa energia no Bacillus licheniformis do tipo selvagem por quatro vezes com diferentes meios físico-químicos de mutagênese, para obter uma cepa de alto rendimento, a atividade enzimática bruta de 12425. 9 U/mL, 17,1 vezes maior do que a cepa inicial.
A tecnologia de fusão protoplasmática é um processo no qual as células de uma linhagem biparental são desparafinadas para fusão protoplasmática, de modo a trocar e recombinar seus genomas para obter recombinantes estáveis. Por exemplo, Pan Yanyun et al. usaram o método de fusão protoplasmática para fundir Bacillus licheniformis 2709 com Bacillus subtilis BD105, que contém o vetor de clonagem do gene da protease alcalina pDW2, para obter uma cepa de alto rendimento A16, com produção de enzima de fermentação 50%-100% maior do que a de 2709 e produção de enzima de até 30.000 U/mL no teste de frasco agitado.
2.2 Construção de bactérias de engenharia genética
A construção de bactérias de engenharia geralmente requer hospedeiros de expressão e vetores de expressão ou elementos de expressão adequados. Primeiramente, o gene-alvo é clonado no vetor de expressão para obter o vetor recombinante, depois transformado no hospedeiro de expressão, passando pelo processo de triagem e, por fim, obtendo o processo da cepa de alto rendimento. Também é possível integrar os fragmentos exógenos do gene-alvo diretamente no genoma do hospedeiro para obter cepas de alto rendimento.
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Min Zhang et al. ligaram a sequência do peptídeo sinalizador do promotor (sacR) do gene sacB com o gene da protease neutra do Bacillus subtilis e o clonaram no vetor pHP13, construíram o vetor de secreção de expressão induzível pHP13SN contendo o gene da protease neutra e o transformaram no Bacillus subtilis DB104, que apresentou um aumento de 48% na viabilidade da enzima em comparação com a cepa de partida. wangHui et al. clonaram a Banpr, uma protease neutra do Bacillus amyloliquefaciens K11, e construíram um plasmídeo de expressão recombinante, pUB110-Banpr, com Bacillus amyloliquefaciens K11 como hospedeiro de expressão, e a atividade enzimática na fermentação em frasco agitado atingiu 8995 ± 250 U/mL e 28084 ± 1282 U/mL em um sistema de fermentação de 15 L, muito mais do que a da cepa industrial Bacillus subtilis AS.1398 (8000-10000 U/mL).
2.3 Melhoria das propriedades da protease
Com o desenvolvimento de técnicas de evolução dirigida in vitro, é possível obter proteínas com funções aprimoradas ou novas por meio de mutação aleatória de genes codificadores, técnicas de DNAShuffling e triagem dirigida sem o conhecimento das informações estruturais tridimensionais e do mecanismo de ação da proteína-alvo.
A estabilidade da enzima é um fator fundamental para o sucesso da comercialização. A estabilidade da enzima pode ser melhorada com a introdução de pontes de sal, ligações dissulfeto, interações aromáticas e aumento da afinidade da enzima por íons de cálcio, aumentando assim a rigidez da molécula por meio de mutagênese direcionada. A substituição de Gly61 ou Ser98 da protease BPN' por Cys, e de ambos, resultou em um aumento na estabilidade térmica da enzima sem alteração na eficiência catalítica.
Ao substituir Val72 por Ile, Ala92 por Thr e Gly131 por Asp da protease de B. subtilis, a enzima mutante pode catalisar a atividade do substrato 2 vezes maior do que a da enzima selvagem a 10°C. Em 2005, a empresa dinamarquesa Novozymes introduziu uma protease de baixa temperatura, a "Polarzyme", que pode ser adicionada ao detergente. Ao adicioná-la ao detergente, a temperatura de lavagem diminuiu de 60°C e 40°C para 30°C e 20°C, economizando 60% de energia elétrica, e o volume de vendas do detergente "carecoldwash" com protease de baixa temperatura aumentou sete vezes.
3 Perspectivas
As proteases têm sido usadas em diversos campos que estão intimamente relacionados à nossa vida cotidiana, e esse ambiente impõe altas demandas à produção e à caracterização de proteases. Portanto, a compreensão aprofundada do mecanismo catalítico da protease, a relação entre a estrutura espacial e a função catalítica e a modificação direcional das cepas produtoras de enzimas para atender aos requisitos da produção industrial ainda são a tendência de desenvolvimento da engenharia de enzimas no futuro. Além disso, além da seleção e da criação de boas linhagens, devem ser feitos esforços para tentar construir novos sistemas de expressão ou sistemas de coexpressão de vários genes de protease, para construir mais vetores de expressão para proteases, de modo a realizar a expressão eficaz de diferentes componentes e melhorar ainda mais a quantidade de expressão, a atividade e a estabilidade da enzima.
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| Composto Glucoamilase | 9032-08-0 |
| Pullulanase | 9075-68-7 |
| Xilanase | 37278-89-0 |
| Celulase | 9012-54-8 |
| Naringinase | 9068-31-9 |
| β-Amilase | 9000-91-3 |
| Glucose oxidase | 9001-37-0 |
| alfa-Amilase | 9000-90-2 |
| Pectinase | 9032-75-1 |
| Peroxidase | 9003-99-0 |
| Lipase | 9001-62-1 |
| Catalase | 9001-05-2 |
| TANNASE | 9025-71-2 |
| Elastase | 39445-21-1 |
| Urease | 9002-13-5 |
| DEXTRANASE | 9025-70-1 |
| L-Láctico desidrogenase | 9001-60-9 |
| Malato desidrogenase | 9001-64-3 |
| Colesterol oxidase | 9028-76-6 |