1. Método de detecção da atividade da enzima naringinase
1-1 Método do espectrofotômetro
O método espectrofotométrico do para-nitrofenol usa p-nitrofenol-α-ramnosídeo (pNP- α- Rha) e p-nitrofenol-β-D-glucopiranosídeo (pNP- β-Glu) como substrato, para detectar a atividade enzimática da α-ramnosidase e da β-glucosidase. Li Ping usou o método do espectrofotômetro de p-nitrofenol, no experimento de adição de β-glicosidase de Aspergillus niger na solução de p-nitrofenol-β-glicosídeo (pNPG) para hidrólise enzimática, e o valor da absorbância foi medido no comprimento de onda ultravioleta de 400 nm. Com base no valor da absorbância, calcula-se a atividade enzimática da β-glucosidase. Esse método tem forte especificidade de substrato, mas o substrato padrão é caro, e a atividade enzimática da naringinase para hidrolisar glicosídeos em alimentos não pode ser determinada, portanto, esse método não é adequado para a detecção da atividade enzimática na preparação industrial em larga escala da naringinase.
O princípio do método do espectrofotômetro Davis é que a naringina pode ocorrer em uma reação cromogênica com dietilenoglicol 90% em condições levemente alcalinas, e a produção de chalcona amarela de naringina pode ser detectada sob luz ultravioleta com comprimento de onda de 420 nm. De acordo com o valor de absorbância medido, a quantidade restante do substrato naringina pode ser calculada e, em seguida, a atividade da naringinase pode ser obtida por cálculo. Wang Weina et al. usaram um método Davis aprimorado, tomaram a naringina como substrato e adicionaram naringinase produzida por fermentação líquida de Aspergillus niger FFCC 848 para hidrólise enzimática. A absorbância foi medida sob luz ultravioleta de 420 nm e, em seguida, calculada a atividade enzimática. O método do espectrofotômetro Davis para medir a atividade da enzima é simples de operar e tem uma velocidade rápida, portanto, esse método é amplamente usado na detecção em tempo real da produção de naringinase por fermentação e da atividade da naringinase imobilizada.
1-2 Cromatografia líquida de alto desempenho
O princípio da cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) é que a HPLC pode determinar com precisão e analisar quantitativamente o substrato naringina, o produto intermediário purunina e o produto final naringenina durante todo o processo de hidrólise e, em seguida, calcular a atividade enzimática. Chen Yuelong e outros usaram a HPLC para determinar o tempo de retenção da naringina, arbutina, miricetina e seus produtos, e obtiveram uma separação completa com uma resolução superior a 1,5, monitorando com eficácia o efeito da naringinase em vários glicosídeos no processo de hidrólise e, ao mesmo tempo, a atividade da enzima foi determinada com precisão. O método HPLC tem as vantagens da alta precisão e pode evitar a interferência de impurezas, mas, em comparação com o método Davis, esse método tem um tempo de detecção mais longo e uma operação mais complicada.
1-3 Método aprimorado de determinação da atividade da enzima naringinase
Usando o método Davis aprimorado: 0,8 mL de 0,8 g-L-1 Uma solução de naringina preparada com tampão de pH 4,5 foi adicionada ao sistema de reação contendo 40 mg de naringinase imobilizada (ou 0,2 mL de naringinase livre). Coloque-o em um banho-maria com temperatura constante de 50 ℃ por 30 minutos. Pegue 0,1 mL da solução de hidrólise enzimática da reação e adicione 5 mL de dietilenoglicol (fração volumétrica de 90%) e 0,1 mL de solução de NaOH (4 mol-L-1) em tubos e deixe em repouso por 10 minutos após misturá-los uniformemente. Meça a absorbância da solução misturada a 420 nm.
A definição da atividade da enzima naringinase (U): em uma condição de pH 4,5, 50 ℃, 1 unidade de atividade enzimática é a quantidade de enzima necessária para degradar 1 μg de naringina por minuto. Taxa de atividade enzimática ( U-g-1 ou U-mL-1) é definida como: na condição de pH 4,5, 50 ℃, a atividade enzimática exibida por 1 g de naringinase imobilizada (ou 1 mL de naringinase livre). A atividade enzimática relativa é calculada de acordo com a fórmula a seguir:
Determinação da curva padrão: a concentração de massa da solução padrão de glicosídeo naringina está disposta em 0, 0,4, 0,8, 1,2, 1,6 g - L-1e, em seguida, 0,1 mL da solução foi levado para reação com 5 mL de dietilenoglicol (90% , v / v) e 0,1 mL de solução de hidróxido de sódio ( 4 mol-L-1). Depois que a mistura foi homogênea e permaneceu em repouso por 10 minutos, o valor de absorção de luz da solução mista foi medido a 420 nm, e a curva padrão foi desenhada de acordo.
2. Preparação da solução de enzima naringinase
O Aspergillus niger FFCC uv-11 armazenado a 4 ℃ foi transferido para o meio slant, e os esporos maduros foram obtidos por meio de cultura em temperatura constante a 30 ℃ por 96 h. Em seguida, os esporos foram lavados com solução salina normal estéril com uma fração de massa de 0,9%. O valor da absorbância da suspensão de esporos é medido a 600 nm (valor OD600), com solução salina estéril seu valor OD600 foi ajustado para 0,200. Em seguida, a suspensão de esporos com a fração de volume de 10% foi inoculada em 100 mL de meio de fermentação (frasco cônico de 250 mL). O caldo de fermentação obtido foi centrifugado a 4 ℃ e 6000 r-min-1 por 10 minutos em uma centrífuga refrigerada. Em seguida, passe pelo filtro de sucção para obter o fluido sobrenadante necessário para a enzima naringina. Refrigere-o a 4 ℃ para uso posterior.
3. Preparação da enzima naringinase imobilizada em quitosana
Tomamos 3,0 g de quitosana e dissolvemos 100 mL de fração volumétrica da solução de ácido acético 2% para preparar 0,3 g - L-1 A solução coloidal de quitosana foi submetida a ultrassom por 20 minutos para remover as bolhas de ar e permitir que ela se dissolvesse completamente. A solução coloidal de quitosana foi injetada gota a gota com uma agulha em 0,5 g - L-1 NaOH condensado (1000 mL) para formar uma pelota lisa. Deixe repousar em temperatura ambiente por 3 horas, e os grânulos foram lavados repetidamente com água destilada até ficarem neutros, e a água foi absorvida por um papel de filtro para obter as microesferas de quitosana. Foram pesadas 0,4 g de microesferas de quitosana, foram adicionados 0,4 ml de glutaraldeído com fração de volume 6% e as microesferas foram lavadas repetidamente com água destilada até que não houvesse glutaraldeído na superfície das microesferas após temperatura constante e vibração a 25 ℃ 150 r-min.-1 As microesferas de quitosana com ligações cruzadas foram obtidas por secagem com papel de filtro.
Ele disse que 0,4 g de microesferas de quitosana, adicionar 0,4 mL de número de membro de créditos 6% glutaraldeído, a 150 r - min-1 Depois de 2 horas, lavadas repetidamente com água destilada, as microesferas não são pentil dialdeído e o papel de filtro é seco para obter microesferas de quitosana reticuladas. Pegue 4 mL de solução de enzima naringinase, adicione-a a 0,4 g de microesferas de quitosana reticuladas, agite a uma temperatura constante de 25 ℃, 150 r-min-1 por 2 h, e coloque-o em um refrigerador a 4 ℃ para acoplamento de adsorção por 4 h. Enxágue a solução enzimática residual na superfície do transportador com tampão de pH 4,5, absorva a água no papel de filtro para obter a naringinase imobilizada e armazene-a em um refrigerador a 4 ℃ para uso posterior.
4. Preparação de microesferas magnéticas de quitosana à base de silício (MSC)
O processo de preparação de nanopartículas magnéticas à base de silício (MS) é mostrado na Figura 1.
Figura 1 Diagrama esquemático da preparação de nanopartículas magnéticas à base de silício
( 1) Primeiro, o Fe3O4 modificadas com ácido cítrico foram preparadas pelo método de co-precipitação química, e o procedimento experimental que compreende: 2,25 g de FeCl3-6H2O e 1,61 g de FeSO4-7H2O são adicionados a um balão de três gargalos preenchido com 100 mL de água deionizada, a temperatura do sistema foi aquecida a 85 ℃ sob a condição de gás nitrogênio. Agite sob 1000 r-min-1 e despeje rapidamente 10 mL de água de amônia concentrada. Depois que a solução ficar preta, adicione 153 mg de citrato de sódio. Após 30 minutos de reação, separe a produção com um ímã e lave a fase sólida com água deionizada e etanol várias vezes. O Fe3O4 As nanopartículas obtidas são secas para uso posterior.
( 2) Em seguida, nanopartículas magnéticas à base de silício (MS) foram preparadas pelo método sol-gel, mostrado na Figura 1. As etapas experimentais incluem: 0,1 g de Fe3O4 foram uniformemente dispersas em uma solução mista contendo 40 mL de etanol anidro, 10 mL de água destilada e 1,2 mL de água de amônia concentrada. Sob a condição de agitação de 300 r-min-1, gotículas de solução contendo Fe3O4 foram adicionadas ao TEOS (0,4 mL) disperso em 30 mL de etanol anidro, e a reação das nanopartículas à base de silício foi realizada durante 12 horas em temperatura ambiente. Os produtos foram lavados com etanol anidro e água destilada por várias vezes para obter nanopartículas magnéticas à base de sílica (MS), que foram secas para uso posterior.
As microesferas de MSC foram preparadas pelo método de reticulação de emulsão, conforme mostrado na Figura 2. As etapas experimentais incluíram: 0,125 g de nanopartículas de sílica magnética (MS) uniformemente dispersas em 10 mL de solução de quitosana com fração de massa de 2,5% preparada por quitosana dissolvida em solução de ácido acético com fração de volume de 5,0% e, em seguida, adicione a solução de quitosana em uma emulsão contendo 60 mL de cera de parafina líquida e 1,8 mL de twain 80, gota a gota. Depois de agitar por 30 minutos em uma condição de banho-maria de 40 ℃ e 800 r-min-1，adicione 2,0 mL de glutaraldeído e reaja por 1 h. Em seguida, o pH do sistema foi ajustado para 9,0 com 1 mol-L-1 NaOH, e a reação foi continuada por 1 h. Os produtos foram lavados com éter de petróleo, etanol e água destilada várias vezes para obter microesferas de MSC, que foram secas a vácuo para uso posterior.
Figura 2 Diagrama esquemático da preparação de microesferas magnéticas de quitosana à base de silício
5. Preparação de microesferas magnéticas de quitosana à base de silício epoxídico (MSCE)
0,5 g de microesferas secas de MSC preparadas pelo método 4 foram pesadas e adicionadas a um frasco cônico de 50 mL. Em seguida, 2,0 mL de solução de NaOH, solução de epicrolohidrina e NaBH4 foram adicionados ao frasco com uma determinada concentração, respectivamente. E a reação foi realizada por oscilação de temperatura constante por um determinado tempo. O mecanismo de reação da preparação do MSCE é mostrado na Figura 3.
Figura 3 Princípio de preparação de microesferas magnéticas de quitosana à base de silicone com base em epóxi
Após a ativação, as microesferas ativadas são lavadas repetidamente com água destilada até que não haja grupos OH- e epóxi livres na superfície para obter microesferas magnéticas de quitosana à base de silicone à base de epóxi (MSCE). O método de detecção é o seguinte: pegue 3,0 mL do sobrenadante da lavagem e adicione de 1 a 2 gotas de fenolftaleína. Depois de agitar, se não ficar vermelho, significa que não há OH- livre com MSCE; pegue 3,0 mL do sobrenadante da lavagem e adicione 3,0 mL de 1,3 mol-L-1 tiossulfato de sódio e 1 a 2 gotas de fenolftaleína. Se a solução não ficar vermelha após a agitação, significa que não há grupos epóxi livres no MSCE. A equação da reação de detecção do grupo epóxi é a seguinte
6 Preparação da enzima naringinase imobilizada em MSCE
5,0 g de MSCE preparado pelo método 5 foram adicionados a 50 mL de solução de enzima naringinase com um determinado pH, e a reação foi oscilada em um banho-maria de temperatura constante, conforme mostrado na Figura 4. Após a reação, as microesferas foram lavadas com solução tampão várias vezes até que nenhuma naringinase livre fosse encontrada na superfície das microesferas. As microesferas foram drenadas por um funil de Brinella para obter a enzima naringinase imobilizada MSCE, que foi refrigerada a 4 ℃ para uso posterior.
Figura 4 Princípio de preparação da enzima naringinase imobilizada em MSCE
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