Modifica dei ceppi produttori di proteasi

La proteasi è una classe di enzimi che catalizza l'idrolisi dei legami peptidici nelle proteine, ampiamente presente in animali, piante e microrganismi, ed è uno dei preparati enzimatici più utilizzati nelle specie enzimatiche industriali, rappresentando circa 60% della quantità totale di enzimi. Le fonti microbiche di proteasi sono abbondanti, diverse e facili da produrre, tanto da diventare la principale fonte di proteasi sul mercato. La produzione commerciale di proteasi può essere fatta risalire all'inizio del secolo scorso; nel 1908 i tedeschi hanno iniziato a utilizzare l'enzima pancreatico per la concia delle pelli; nel 1911, l'azienda statunitense Wallerstein ha prodotto papaina come agente chiarificante per la birra; all'inizio degli anni Sessanta, i Paesi Bassi hanno prodotto detergenti con l'aggiunta di proteasi. Inoltre, in combinazione con la pratica, si è proceduto alla selezione e all'allevamento di batteri per la produzione di proteasi resistenti al calore, agli acidi e ai sali, nonché alla ricerca sul petrolio come materia prima di fermentazione per la produzione di proteasi alcaline.

 

Esistono molti tipi di proteasi e le loro dimensioni in termini di peso molecolare, struttura spaziale e funzione sono molto diverse, ma ogni famiglia di proteasi mantiene un dominio strutturale altamente conservato. Attualmente, più di 100 tipi di proteasi sono stati cristallizzati o altamente purificati e molti di essi sono stati elucidati in termini di strutture primarie e stereo (struttura terziaria).

 

 

2 Modifica dei ceppi di proteasi

La costruzione di batteri ingegnerizzati per l'espressione efficiente della proteasi e l'ottimizzazione delle sue proprietà enzimatiche è stata il punto focale degli studiosi nazionali e stranieri, e i mezzi solitamente utilizzati sono: riproduzione di mutazioni, fusione protoplasmatica, costruzione di batteri geneticamente modificati e tecnologia di evoluzione direzionale in vitro.

 

2.1 Riproduzione per mutagenesi e fusione protoplasmatica

L'allevamento per mutagenesi avviene principalmente attraverso la mutagenesi con radiazioni o alcuni reagenti chimici per indurre mutazioni nel materiale genetico del batterio e ottenere ceppi mutanti con caratteristiche eccellenti. Ad esempio, dopo la mutagenesi UV di ceppi produttori di enzimi da parte di Cai Wanling et al, la loro attività enzimatica è aumentata di 16% rispetto al ceppo originale. Yanli Li et al. hanno controllato l'attività enzimatica di produzione di proteasi neutre dell'Aspergillus oryzae ZW-06 fino a 15.000 U/g di cagliata secca mediante mutagenesi diretta con Co60, con un aumento di 74% rispetto a quella precedente alla mutagenesi. Huang Hongying et al. hanno combinato la tecnologia di impianto di ioni N+ a bassa energia sul Bacillus licheniformis wild-type per quattro volte con diversi mezzi fisico-chimici di mutagenesi, per ottenere un ceppo ad alta resa, con un'attività enzimatica grezza di 12425. 9 U/mL, 17,1 volte superiore a quella del ceppo di partenza.

 

 

La tecnologia della fusione protoplasmatica è un processo in cui le cellule di un ceppo biparentale vengono de-murate per la fusione protoplasmatica, in modo da scambiare e ricombinare i loro genomi per ottenere ricombinanti stabili. Ad esempio, Pan Yanyun et al. hanno utilizzato il metodo della fusione protoplasmatica per fondere il Bacillus licheniformis 2709 con il Bacillus subtilis BD105, che contiene il vettore di clonazione del gene della proteasi alcalina pDW2, per ottenere il ceppo ad alta resa A16, con una produzione di enzimi di fermentazione 50%-100% superiore a quella del 2709 e una produzione di enzimi fino a 30.000 U/mL nel test in shake flask.

 

2.2 Costruzione di batteri di ingegneria genetica

La costruzione di batteri ingegnerizzati richiede solitamente ospiti di espressione e vettori di espressione o elementi di espressione adeguati. In primo luogo, il gene target viene clonato nel vettore di espressione per ottenere il vettore ricombinante, quindi trasformato nell'ospite di espressione, attraverso il processo di screening, e infine si ottiene il ceppo ad alta resa. È anche possibile integrare i frammenti del gene target esogeno direttamente nel genoma dell'ospite per ottenere ceppi ad alta resa.

 

[18-20 ottobre] 2024 La seconda conferenza sull'ingegneria enzimatica avanzata e le applicazioni della tecnologia enzimatica

Min Zhang et al. hanno ligato la sequenza promotore-segnale peptidica ( sacR ) del gene sacB con il gene della proteasi neutra di Bacillus subtilis e l'hanno clonata nel vettore pHP13, hanno costruito il vettore di secrezione di espressione inducibile pHP13SN contenente il gene della proteasi neutra e l'hanno poi trasformato in Bacillus subtilis DB104, che ha mostrato un aumento di 48% della vitalità dell'enzima rispetto a quella del ceppo di partenza. wangHui et al. hanno clonato Banpr, una proteasi neutra da Bacillus amyloliquefaciens K11, e hanno costruito un plasmide di espressione ricombinante, pUB110-Banpr, con Bacillus amyloliquefaciens K11 come ospite di espressione; l'attività enzimatica nella fermentazione in shake flask ha raggiunto 8995 ± 250 U/mL, e 28084 ± 1282 U/mL in un sistema di fermentazione da 15 L, che era molto più di quella del ceppo industriale Bacillus subtilis AS.1398 (8000-10000 U/mL).

 

2.3 Miglioramento delle proprietà delle proteasi

Con lo sviluppo delle tecniche di evoluzione diretta in vitro, le proteine con funzioni migliorate o nuove possono essere ottenute mediante mutazioni casuali dei geni codificanti, tecniche di DNAShuffling e screening diretto senza conoscere le informazioni strutturali tridimensionali e il meccanismo d'azione della proteina target.

 

 

La stabilità dell'enzima è un fattore chiave per il successo della commercializzazione. La stabilità dell'enzima può essere migliorata introducendo ponti salini, legami disolfuro, interazioni aromatiche e aumentando l'affinità dell'enzima per gli ioni calcio, aumentando così la rigidità della molecola attraverso una mutagenesi mirata. La sostituzione di Gly61 o Ser98 della proteasi BPN' con Cys, e di entrambi, ha portato a un aumento della stabilità termica dell'enzima senza una variazione dell'efficienza catalitica.

 

Sostituendo Val72 con Ile, Ala92 con Thr e Gly131 con Asp della proteasi di B. subtilis, l'enzima mutante è in grado di catalizzare un'attività di substrato 2 volte superiore a quella dell'enzima selvatico a 10°C. Nel 2005, l'azienda danese Novozymes ha introdotto una proteasi a bassa temperatura, "Polarzyme", che può essere aggiunta ai detergenti. Aggiungendola al detersivo, la temperatura di lavaggio è passata da 60°C e 40°C a 30°C e 20°C, con un risparmio di 60% di energia elettrica, e il volume delle vendite del detersivo "carecoldwash" con proteasi a bassa temperatura è aumentato di sette volte.

 

3 Prospettive

Le proteasi sono state utilizzate in una varietà di campi strettamente legati alla nostra vita quotidiana e questo ambiente pone elevate esigenze alla produzione e alla caratterizzazione delle proteasi. Pertanto, la comprensione approfondita del meccanismo catalitico della proteasi, la relazione tra struttura spaziale e funzione catalitica e la modifica direzionale dei ceppi produttori di enzimi per soddisfare i requisiti della produzione industriale sono ancora la tendenza di sviluppo dell'ingegneria enzimatica in futuro. Inoltre, oltre alla selezione e all'allevamento di buoni ceppi, si dovrebbe cercare di costruire nuovi sistemi di espressione o sistemi di co-espressione di più geni di proteasi, per costruire più vettori di espressione per le proteasi, in modo da realizzare l'espressione efficace di diversi componenti e migliorare ulteriormente la quantità di espressione, l'attività enzimatica e la stabilità dell'enzima.

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Composto Glucoamilasi	9032-08-0
Pullulanase	9075-68-7
Xilanasi	37278-89-0
Cellulasi	9012-54-8
Naringinasi	9068-31-9
β-amilasi	9000-91-3
Glucosio ossidasi	9001-37-0
alfa-amilasi	9000-90-2
Pectinasi	9032-75-1
Perossidasi	9003-99-0
Lipasi	9001-62-1
Catalasi	9001-05-2
TANNASIO	9025-71-2
Elastasi	39445-21-1
Ureasi	9002-13-5
DEXTRANASE	9025-70-1
L-lattico deidrogenasi	9001-60-9
Deidrogenasi malato	9001-64-3
Colesterolo ossidasi	9028-76-6