1. Metodo di rilevamento dell'attività enzimatica della naringinasi
1-1 Metodo dello spettrofotometro
Il metodo spettrofotometrico del para-nitrofenolo utilizza il p-nitrofenolo- α-rhamnoside ( pNP- α- Rha ) e il p-nitrofenolo-β-D-glucopiranoside ( pNP- β-Glu) come substrato, per rilevare l'attività enzimatica dell'α-rhamnosidasi e della β-glucosidasi. Li Ping ha utilizzato il metodo dello spettrofotometro del p-nitrofenolo, nell'esperimento di aggiunta di Aspergillus niger β-glucosidasi nella soluzione di p-nitrofenolo -β-glucoside ( pNPG ) per l'idrolisi enzimatica, e il valore di assorbanza è stato misurato alla lunghezza d'onda ultravioletta di 400 nm. Sulla base del valore di assorbanza, si calcola l'attività enzimatica della β-glucosidasi. Questo metodo ha una forte specificità di substrato, ma il substrato standard è costoso e l'attività enzimatica della naringinasi per idrolizzare i glicosidi negli alimenti non può essere determinata, quindi questo metodo non è adatto per la rilevazione dell'attività enzimatica nella preparazione industriale su larga scala della naringinasi.
Il principio del metodo dello spettrofotometro di Davis è che la naringina può reagire cromogenicamente con il glicole dietilenico 90% in condizioni leggermente alcaline e la produzione di calcone giallo di naringina può essere rilevata alla luce ultravioletta con una lunghezza d'onda di 420 nm. In base al valore di assorbanza misurato, è possibile calcolare la quantità rimanente di naringina substrato e quindi ottenere l'attività della naringinasi mediante calcolo. Wang Weina et al. hanno utilizzato un metodo Davis migliorato, hanno preso la naringina come substrato e hanno aggiunto la naringinasi prodotta dalla fermentazione liquida di Aspergillus niger FFCC 848 per l'idrolisi enzimatica. L'assorbanza è stata misurata alla luce ultravioletta di 420 nm, quindi è stata calcolata l'attività enzimatica. Il metodo dello spettrofotometro di Davis per la misurazione dell'attività enzimatica è semplice da utilizzare e ha una velocità elevata, pertanto questo metodo è ampiamente utilizzato per la rilevazione in tempo reale della produzione di naringinasi dalla fermentazione e dell'attività della naringinasi immobilizzata.
1-2 Cromatografia liquida ad alte prestazioni
Il principio della cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) è che l'HPLC può determinare con precisione e analizzare quantitativamente il substrato naringina, il prodotto intermedio purunina e il prodotto finale naringenina durante l'intero processo di idrolisi, per poi calcolare l'attività enzimatica. Chen Yuelong e altri hanno utilizzato l'HPLC per determinare il tempo di ritenzione di naringina, arbutina, miricetina e dei loro prodotti, ottenendo una separazione completa con una risoluzione superiore a 1,5 e monitorando efficacemente l'effetto della naringinasi su più glicosidi nel processo di idrolisi; allo stesso tempo, l'attività enzimatica è stata determinata con precisione. Il metodo HPLC presenta i vantaggi di un'elevata accuratezza e può evitare l'interferenza delle impurità; tuttavia, rispetto al metodo Davis, questo metodo presenta un tempo di rilevazione più lungo e un'operazione più complicata.
1-3 Metodo migliorato di determinazione dell'attività enzimatica della naringinasi
Utilizzando il metodo Davis migliorato: 0,8 mL di 0,8 g-L-1 La soluzione di naringina preparata con tampone a pH 4,5 è stata aggiunta al sistema di reazione contenente 40 mg di naringinasi immobilizzata (o 0,2 mL di naringinasi libera). Porre il tutto in un bagno d'acqua a temperatura costante di 50 ℃ per 30 minuti. Prelevare 0,1 mL della soluzione di idrolisi enzimatica di reazione e aggiungere 5 mL di glicole dietilenico (frazione di volume 90%) e 0,1 mL di soluzione di NaOH (4 mol-L-1) nelle provette e tenere a riposo per 10 minuti dopo averli mescolati uniformemente. Misurare l'assorbanza della soluzione miscelata a 420 nm.
Definizione dell'attività dell'enzima naringinasi (U): a una condizione di pH 4,5, 50 ℃, 1 unità di attività enzimatica è la quantità di enzima necessaria per degradare 1 μg di naringina al minuto. Il rapporto di attività enzimatica ( U-g-1 o U-mL-1) è definita come: alla condizione di pH 4,5, 50 ℃, l'attività enzimatica esibita da 1 g di naringinasi immobilizzata (o 1 mL di naringinasi libera). L'attività enzimatica relativa è calcolata secondo la seguente formula :
Attività enzimatica relativa /% = attività enzimatica/attività enzimatica massima×100
Determinazione della curva standard: le concentrazioni di massa della soluzione standard del glicoside naringina sono disposte a 0, 0,4, 0,8, 1,2, 1,6 g - L-1, quindi 0,1 mL di soluzione sono stati prelevati per la reazione con 5 mL di glicole dietilenico (90% , v / v) e 0,1 mL di soluzione di idrossido di sodio ( 4 mol-L-1). Dopo aver mescolato uniformemente la miscela e averla lasciata riposare per 10 minuti, il valore di assorbimento della luce della soluzione miscelata è stato misurato a 420 nm e la curva standard è stata tracciata di conseguenza.
2. Preparazione della soluzione enzimatica di naringinasi
L'Aspergillus niger FFCC uv-11 conservato a 4 ℃ è stato trasferito nel terreno di coltura e le spore mature sono state ottenute mediante coltura a temperatura costante a 30 ℃ per 96 ore. Le spore sono state poi lavate con soluzione fisiologica normale sterile con una frazione di massa di 0,9%. Il valore dell'assorbanza della sospensione di spore è stato misurato a 600 nm (valore OD600); con la soluzione fisiologica sterile il suo valore OD600 è stato regolato a 0,200. La sospensione di spore con una frazione volumetrica di 10% è stata inoculata in 100 mL di terreno di fermentazione (matraccio conico da 250 mL).-1 per 10 minuti in una centrifuga refrigerata. Quindi, attraverso il filtro di aspirazione, ottenere il liquido surnatante necessario per l'enzima naringina. Raffreddare a 4 ℃ per l'uso successivo.
3. Preparazione dell'enzima naringinasi immobilizzato in chitosano
Si prendono 3,0 g di chitosano, con 100 mL di frazione volumetrica di soluzione di acido acetico 2% è stato sciolto per preparare 0,3 g - L-1 soluzione colloidale di chitosano, sonicata per 20 minuti per eliminare le bolle d'aria e lasciata sciogliere completamente. La soluzione colloidale di chitosano è stata iniettata goccia a goccia con un ago in 0,5 g - L-1 NaOH condensato (1000 mL) per formare un pellet liscio. Lasciato riposare a temperatura ambiente per 3 ore, il pellet è stato ripetutamente lavato con acqua distillata per neutralizzarlo e l'acqua è stata assorbita da una carta da filtro per ottenere le microsfere di chitosano. Sono stati pesati 0,4 g di microsfere di chitosano, sono stati aggiunti 0,4 ml di glutaraldeide con frazione volumetrica 6% e le microsfere sono state ripetutamente lavate con acqua distillata fino a quando non è stata rilevata la presenza di glutaraldeide sulla superficie delle microsfere dopo temperatura costante e vibrazione a 25 ℃ 150 r-min.-1 per 2 ore. Le microsfere di chitosano reticolato sono state ottenute mediante essiccazione con carta da filtro.
Ha detto 0,4 g di microsfere di chitosano, aggiungere 0,4 mL numero membro di crediti 6% glutaraldeide, a 150 r - min-1 a 25 ℃ oscillazione di temperatura Dopo 2 h, lavate ripetutamente con acqua distillata, le microsfere sono state asciugate per ottenere microsfere di chitosano reticolato. Prelevare 4 mL di soluzione enzimatica di naringinasi, aggiungerla a 0,4 g di microsfere di chitosano reticolato, agitare a una temperatura costante di 25 ℃, 150 r-min-1 per 2 ore e metterlo in frigorifero a 4 ℃ per l'accoppiamento di adsorbimento per 4 ore. Sciacquare la soluzione enzimatica residua sulla superficie del supporto con tampone a pH 4,5, assorbire l'acqua sulla carta da filtro per ottenere la naringinasi immobilizzata e conservarla in frigorifero a 4 ℃ per un uso successivo.
4. Preparazione di microsfere magnetiche di chitosano a base di silicio (MSC)
Il processo di preparazione delle nanoparticelle magnetiche a base di silicio ( MS) è illustrato nella Figura 1.
Figura 1 Schema della preparazione di nanoparticelle magnetiche a base di silicio
( 1) In primo luogo, il Fe magnetico3O4 modificate con acido citrico sono state preparate con il metodo della co-precipitazione chimica; la procedura sperimentale prevede: 2,25 g di FeCl3-6H2O e 1,61 g di FeSO4-7H2O sono aggiunti in un pallone a tre colli riempito con 100 mL di acqua deionizzata, la temperatura del sistema è stata riscaldata a 85 ℃ in condizioni di azoto gassoso. Agitare a 1000 r-min-1 e versare rapidamente 10 mL di acqua ammoniacale concentrata. Quando la soluzione diventa nera, aggiungere 153 mg di citrato di sodio. Dopo 30 minuti di reazione, separare la produzione con un magnete e lavare la fase solida con acqua deionizzata ed etanolo più volte. Il Fe3O4 Le nanoparticelle ottenute vengono essiccate per un successivo utilizzo.
( 2) Poi, sono state preparate nanoparticelle magnetiche a base di silicio (MS) con il metodo sol-gel, come mostrato nella Figura 1. Le fasi sperimentali comprendono: 0,1 g di Fe3O4 sono state disperse uniformemente in una soluzione mista contenente 40 mL di etanolo anidro, 10 mL di acqua dedistillata e 1,2 mL di acqua ammoniacale concentrata. In condizioni di agitazione di 300 r-min-1, gocce di soluzione contenente Fe3O4 sono state aggiunte a TEOS (0,4 mL) disperso in 30 mL di etanolo anidro e la reazione delle nanoparticelle a base di silicio è stata condotta per 12 ore a temperatura ambiente. I prodotti sono stati lavati con etanolo anidro e acqua distillata per diverse volte per ottenere nanoparticelle magnetiche a base di silice (MS), che sono state essiccate per il successivo utilizzo.
Le microsfere di MSC sono state preparate con il metodo della reticolazione in emulsione, come mostrato in Figura 2. Le fasi sperimentali comprendevano: 0,125 g di nanoparticelle di silice magnetica (MS) disperse uniformemente in 10 mL di soluzione di chitosano con frazione di massa pari a 2,5% preparata da chitosano disciolto in soluzione di acido acetico con frazione di volume pari a 5,0%, quindi aggiungere la soluzione di chitosano in un'emulsione contenente 60 mL di paraffina liquida e 1,8 mL di twain 80 goccia a goccia. Dopo un'agitazione di 30 minuti in condizioni di bagnomaria a 40 ℃ e 800 giri/min.-1Aggiungere 2,0 mL di glutaraldeide e far reagire per 1 h. Quindi il pH del sistema è stato regolato a 9,0 con 1 mol-L-1 NaOH, e la reazione è proseguita per 1 h. I prodotti sono stati lavati più volte con etere di petrolio, etanolo e acqua distillata per ottenere microsfere MSC, che sono state essiccate sotto vuoto per il successivo utilizzo.
Figura 2 Schema della preparazione di microsfere di chitosano magnetico a base di silicio
5. Preparazione di microsfere di chitosano magnetico a base di silicio epossidico ( MSCE)
0,5 g di microsfere essiccate di MSC preparate con il metodo 4 sono stati pesati e aggiunti in un matraccio conico da 50 mL. Quindi sono stati aggiunti 2,0 mL di soluzione di NaOH, soluzione di epicroloidrina e NaBH4 sono stati aggiunti nel pallone con una certa concentrazione. La reazione è stata condotta con oscillazione costante della temperatura per un certo tempo. Il meccanismo di reazione della preparazione dell'MSCE è illustrato nella Figura 3.
Figura 3 Il principio di preparazione delle microsfere di chitosano magnetico a base di epossidico e silicio
Dopo l'attivazione, le microsfere attivate vengono lavate ripetutamente con acqua distillata fino all'assenza di gruppi OH- ed epossidici liberi sulla superficie per ottenere microsfere di chitosano magnetico a base di silicio epossidico (MSCE). Il metodo di rilevamento è il seguente: prelevare 3,0 mL del surnatante di lavaggio e aggiungere 1~2 gocce di fenolftaleina. Dopo aver agitato, se non diventa rosso, significa che non c'è OH- libero con MSCE; prendere 3,0 mL del surnatante di lavaggio e aggiungere 3,0 mL di 1,3 mol-L-1 sodio tiosolfato e 1 ~2 gocce di fenolftaleina; se la soluzione non diventa rossa dopo l'agitazione, significa che non ci sono gruppi epossidici liberi nell'MSCE. L'equazione di reazione per la rilevazione del gruppo epossidico è la seguente:
6 Preparazione dell'enzima naringinasi immobilizzato in MSCE
5,0 g di MSCE preparato con il metodo 5 sono stati aggiunti a 50 mL di soluzione enzimatica di naringinasi con un determinato pH e la reazione è stata fatta oscillare sotto un bagno d'acqua a temperatura costante, come illustrato nella Figura 4. Dopo la reazione, le microsfere sono state lavate con soluzione tampone per diverse volte fino a quando non è stata trovata naringinasi libera sulla superficie delle microsfere. Le microsfere sono state drenate con un imbuto di Brinella per ottenere l'enzima naringinasi immobilizzato in MSCE, che è stato refrigerato a 4 ℃ per un uso successivo.
Figura 4 Il principio di preparazione dell'enzima naringinasi immobilizzato in MSCE
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