Was sind die Merkmale und Anwendungen der verschiedenen Enzyme von IVD-Rohstoffen?

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist ein molekularbiologisches Verfahren zur Vervielfältigung spezifischer DNA-Fragmente, das als DNA-Replikation außerhalb des Organismus angesehen wird, wobei winzige Mengen von DNA-Fragmenten so stark vervielfältigt werden, dass sie leicht identifiziert und erkannt werden können.

Bei PCR-Reaktionen spielen "Enzyme" eine entscheidende Rolle, und jede Art von "Enzym" hat eine andere Aktivität und Funktion. Welche Arten von Enzymen gibt es also? Und was sind die Anwendungen im IVD-Bereich?

DNA-Polymerase

Definition: Es handelt sich um eine Art von Enzym, das die DNA als Vorlage verwendet, vom 5-terminalen zum 3-terminalen Ende der DNA repliziert und die Polymerisation der dNTP-Substratmoleküle zur Bildung von Tochter-DNA katalysiert.

Hauptaktivitäten und Aufgaben: Katalysieren die DNA-Synthese. 1, Polymerisation. 2, 3, → 5, Exonuklease-Aktivität - Korrekturlesen Rolle 3, 5, → 3, Exonuklease-Aktivität - Exzisionsreparatur Rolle 4, Pyrophosphat-Hydrolyse Rolle 5, Pyrophosphat-Austausch.

Zu den gängigen DNA-Polymerasen im IVD-Bereich gehören: Taq-Hot-Start-Enzym, das durch eine chemische Modifikation die Aktivität des Taq-Enzyms einstellt, bevor das Reaktionssystem auf 70 °C erhitzt wird, wodurch eine unspezifische Amplifikation verhindert wird. High-fidelity-DNA-Polymerase, die ein Polymerisationszentrum und ein Spaltungszentrum enthält, wobei das Polymerisationszentrum eine 5′-3′-Polymerase-Aktivität hat, die für die Polymerisation verantwortlich ist; das Spaltungszentrum hat eine 3′-5′-Exonuklease-Aktivität (auch als Korrekturlese-Aktivität bekannt), die für die zu entfernenden ungepaarten Nukleotide verantwortlich ist. Exonuklease-Aktivität (auch als Korrekturlese-Aktivität bekannt), die für die Exzision der ungepaarten Nukleotide verantwortlich ist.

reverse Transkriptase

Definition: Ein Enzym, das RNA als Matrize verwendet und einen einzelnen DNA-Strang synthetisiert, der zur RNA-Matrize in 5′-3′-Richtung komplementär ist.

Wichtigste Aktivitäten und Aufgaben: 1. RNA-gesteuerte DNA-Polymerase-Aktivität. 2. RNase H-Aktivität 3. DNA-geleitete DNA-Polymerase-Aktivität.

Anwendung auf dem Gebiet der IVD: 1, reverse Transkription Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) 2, cDNA-Bibliotheksaufbau 3, RNA-Sequenzierung 4, RT-qPCR , 2019 New Crown Nucleic Acid Detection konfigurierte Systemreagenzien, werden sich zwangsläufig der reversen Transkriptase anschließen. Dies liegt daran, dass RNA-Viren in DNA umgeschrieben werden müssen, um PCR-Reaktionen durchführen zu können.

RNA-Polymerase

Definition: eine DNA- oder RNA-Kette als Template-Polymerase, da in der Zelle mit der genetischen Information der DNA-Transkription, auch als Transkriptase bekannt.

Wichtigste Aktivitäten und Aufgaben: 1, mit DNA als Vorlage; 2, katalysiert die Synthese von Nukleinsäuren durch Polymerisationsreaktionen; 3, veranlasst Nukleotide zur Bildung von 3,→5,-Phosphodiesterbindungen; 4, transkribiert die Vorlagesequenz in der 5′-3′-Richtung nach dem Prinzip der Basenkomplementärpaarung.

Zu den gängigen RNA-Polymerasen im IVD-Bereich gehört die T7-RNA-Polymerase, die spezifisch den Prozess der RNA-Bildung in der 5'→3′-Richtung katalysiert. In der In-vitro-Diagnostik ist die SAT-Technologie derzeit die Anwendung der T7-RNA-Polymerase zur RNA-Amplifikation. Diese Technologie wird häufig zum Nachweis von Krankheitserregern, zum Screening von Blutviren und zum Nachweis von Mikroorganismen in der Umwelt eingesetzt.

Proteinase K

Definition: Proteinase K ist ein starkes proteolytisches Enzym, das aus Candida albicans isoliert wird und ein Schlüsselreagenz für die DNA-Extraktion ist.

Hauptfunktion: Abbau von Membranproteinen und DNA-gebundenen Proteinen und Förderung der Freisetzung von DNA. Anwendung im IVD-Bereich: für die Isolierung und Extraktion von Plasmid, genomischer DNA, RNA. Beim Nachweis viraler Nukleinsäuren kann Proteinase K virale Kapsidproteine spalten und inaktivieren und gleichzeitig das virale Genom zur vollständigen Nukleinsäureextraktion freisetzen.

UDG-Enzym

Definition: alias Uracil-DNA-Glycosylase, auch bekannt als Uracil-N-Glycosylase oder UNGase. Es handelt sich um die chemische Struktur, die DNA- und RNA-Monomere bildet und die genetische Information kodiert.

Funktion: Effiziente Kontrolle von PCR-Restkontaminationen. Anwendung in IVD: PCR-Reagenzien für klinische Tests enthalten UDG-Enzym zur Vermeidung von Kontaminationen.

Endonuklease

Definition: eine Klasse von Enzymen, die eine bestimmte Nukleotidsequenz erkennt und die Phosphodiesterbindung zwischen zwei Desoxyribonukleotiden an einer bestimmten Stelle in jeder Kette spaltet, die so genannten Restriktionsenzyme.

Rolle: es gibt 3 Typen: Typ 1: sowohl Modifikation als auch Erkennungsspaltung, die Spaltstelle ist weit von der Erkennungssequenz entfernt. Typ 2: nur Erkennungsspaltung, die Spaltstelle ist die Erkennungssequenz. Typ 3: sowohl Modifikation als auch Erkennungsspaltung, die Spaltstelle und die Erkennungssequenz liegen näher beieinander.

Anwendungen im IVD-Bereich: 1, Genlokalisierung und Genisolierung, 2, Analyse der molekularen DNA-Basensequenz, 3, gentechnische Bearbeitung, 4, Erstellung der physikalischen DNA-Karte.

Dekonjugierendes Enzym

Definition: Nutzung der durch die ATP-Hydrolyse bereitgestellten Energie, um die durch die Paarung von doppelsträngigen DNA-Nukleotiden gebildeten Wasserstoffbrücken zu lösen und eine einzelsträngige DNA zu bilden.

Rolle: spielt eine Rolle bei der Katalyse der Entfaltung von DNA oder RNA während der DNA- oder RNA-Replikation.

Anwendung auf dem Gebiet der IVD: Isotherme Amplifikationstechnologie, bei der ein hitzestabilisiertes dekonjugierendes Enzym anstelle des thermischen Denaturierungsprozesses bei der qPCR verwendet wird, um den Doppelstrang zu entwirren und die Amplifikation zu verlängern. Diese Technik ist weniger anfällig für unspezifische Amplifikation und vermeidet auch das Erhöhen und Senken der Temperatur im PCR-Zyklus, so dass nur einfache Geräte für den Nachweis erforderlich sind.

Modifizierendes Enzym

Definition: Ein Enzym, das den Einbau seltener Basen in RNA oder DNA katalysiert oder die ursprünglichen Basen modifiziert, um die Zerstörung durch Restriktionsendonukleasen zu verhindern.

Rolle: Kovalente Veränderung der Struktur anderer Enzyme, so dass sie sich zwischen einer hochaktiven und einer relativ weniger aktiven Form umwandeln.

Anwendung in IVD: 5mC/m6A-Aktivitätstest für Nukleinsäure-modifizierende Enzyme Die HTMR-Methode liefert überzeugende Beweise für die Entdeckung und Aktivitätsbewertung von niedermolekularen Modulatoren, die auf die DNA/RNA-Methylierung abzielen.

Pyrophosphatase

DEFINITION: Ein Enzym, das die Umwandlung eines Moleküls Pyrophosphat in zwei Moleküle Phosphat-Ionen katalysiert.

Funktion: Die hitzestabile anorganische Pyrophosphatase ist auch dann noch aktiv, wenn sie 4 Stunden lang auf 100°C erhitzt wird. Sie kann daher in PCR-Reaktionen verwendet werden, um die Hemmung der PCR durch das erzeugte anorganische Pyrophosphat aufzuheben und die DNA-Replikation zu verbessern.

Taq-Antikörper

Definition: Antikörper gegen Taq-DNA-Polymerase.

Funktion: Während der PCR-Amplifikation bindet der Taq-Antikörper an das Taq-Enzym, um die DNA-Polymerase-Aktivität vor der Denaturierung bei hoher Temperatur zu hemmen, und kann das unspezifische Annealing von Primern und die unspezifische Amplifikation, die durch Primer-Dimere bei niedriger Temperatur verursacht wird, wirksam hemmen.

Anwendung in IVD: Die hohe Eindämmungseffizienz des Taq-Antikörpers kann die Nachweisempfindlichkeit des neuen Coronavirus-Nukleinsäure-Nachweiskits verbessern und den neuen Coronavirus-Nachweis unterstützen.

Der PCR-Standardprozess ist in drei Schritte unterteilt: DNA-Denaturierung, Annealing und Extension. Die Inaktivierungsreaktion kann zu Beginn der PCR durch Erwärmung auf 50 °C für 10 Minuten oder 95 °C für 2 Minuten erfolgen, und das UDG-Enzym eliminiert die durch die kontaminierte DNA im Reaktionssystem erzeugte Amplifikation. Anschließend wird die Template-DNA bei hoher Temperatur zu einzelsträngiger DNA denaturiert. Zwei Primer verbinden sich unter der DNA-Polymerase und bei geeigneter Temperatur jeweils mit zwei Template-DNA-Strängen. Der Taq-Antikörper bindet an das Taq-Enzym, um die DNA-Polymerase-Aktivität zu hemmen und die unspezifische Amplifikation bei niedrigen Temperaturen zu verhindern. Durch Zugabe von anorganischer Pyrophosphatase zur PCR-Reaktion wird Pyrophosphat zu Orthophosphat hydrolysiert, was die Amplifikationseffizienz der Reaktion erhöht.

Im Jahr 2020 wird die Nachfrage nach molekulardiagnostischen Reagenzien angesichts der großen Nachfrage nach Nukleinsäuretests drastisch ansteigen, was zu einer rasanten Entwicklung der Enzymrohstoffindustrie führt. Aufgrund der hohen technischen Schwelle bei der Herstellung von Enzymrohstoffen für die Molekulardiagnostik ist der derzeitige Inlandsmarkt hauptsächlich von Importen abhängig. In den letzten Jahren, zusammen mit dem Anstieg der inländischen Produktion, eine Reihe von Rohstoff-Unternehmen aufgeführt, Produkt-Kategorien sind auch allmählich angereichert, aber es ist nicht zu leugnen, dass die inländische IVD-Rohstoffe Industrie ist immer noch in den frühen Stadien der Entwicklung, der Marktanteil ist auch relativ klein, die Zukunft ist verpflichtet, in einem größeren Raum für Verbesserungen bestehen.

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