Modifizierung von Protease-produzierenden Stämmen
Protease ist eine Enzymklasse, die die Hydrolyse von Peptidbindungen in Proteinen katalysiert und in Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen weit verbreitet ist. Mit einem Anteil von etwa 60% an der Gesamtmenge der Enzyme ist sie eines der am häufigsten verwendeten Enzympräparate in der industriellen Enzymbranche. Mikrobielle Proteasequellen sind reichlich vorhanden, vielfältig und leicht zu produzieren, so dass sie die Hauptquelle für Proteasen auf dem Markt darstellen. Die kommerzielle Produktion von Protease kann bis zum Beginn des letzten Jahrhunderts zurückverfolgt werden, im Jahr 1908 haben die Deutschen begonnen, Bauchspeicheldrüsenenzym Gerben Leder zu verwenden, im Jahr 1911, die Vereinigten Staaten Wallerstein Unternehmen produziert Papain als Klärmittel für Bier. in den frühen sechziger Jahren, die Niederlande produziert Waschmittel mit dem Zusatz von Protease. Darüber hinaus auch mit der praktischen Durchführung hitzebeständig, säurebeständig, salzbeständig Protease Produktion Bakterien Auswahl und Zucht, sowie Erdöl als Rohstoff Fermentation Produktion von alkalischen Protease Forschung kombiniert.
Es gibt viele Arten von Proteasen, und ihr Molekulargewicht, ihre räumliche Struktur und ihre Funktion sind sehr unterschiedlich, aber jede Familie von Proteasen verfügt über eine hoch konservierte strukturelle Domäne. Derzeit sind mehr als 100 Arten von Proteasen kristallisiert oder hochgereinigt worden, und viele von ihnen sind hinsichtlich ihrer Primär- und Stereostruktur (Tertiärstruktur) aufgeklärt worden.
2 Modifizierung von Proteasestämmen
Die Konstruktion von Bakterien zur effizienten Expression von Proteasen und die Optimierung ihrer enzymatischen Eigenschaften sind das Hauptanliegen in- und ausländischer Wissenschaftler. Die dabei verwendeten Methoden sind: Mutationszüchtung, Protoplasmafusion, Konstruktion gentechnisch veränderter Bakterien und gerichtete In-vitro-Evolutionstechnologie.
2.1 Mutagenesezüchtung und Protoplasmafusion
Die Mutagenesezüchtung erfolgt hauptsächlich durch Strahlenmutagenese oder einige chemische Reagenzien, um Mutationen im genetischen Material des Bakteriums zu induzieren und mutierte Stämme mit hervorragenden Eigenschaften zu erhalten. Nach der UV-Mutagenese von enzymproduzierenden Stämmen durch Cai Wanling et al. erhöhte sich deren Enzymaktivität um 16% im Vergleich zum ursprünglichen Stamm. Yanli Li et al. überprüften die neutrale Protease-produzierende Enzymaktivität von Aspergillus oryzae ZW-06 durch Co60-gerichtete Mutagenese auf bis zu 15.000 U/g trockenen Quark, was 74% höher war als die Aktivität vor der Mutagenese. Huang Hongying et al. kombinierten die Technologie der N+-Ionenimplantation mit niedriger Energie auf den Wildtyp Bacillus licheniformis viermal mit verschiedenen physikalisch-chemischen Mitteln der Mutagenese, um einen ertragreichen Stamm zu erhalten, der eine rohe Enzymaktivität von 12425. 9 U/mL, 17,1 mal höher als der Ausgangsstamm.
Die protoplasmatische Fusionstechnologie ist ein Verfahren, bei dem die Zellen eines biparentalen Stammes zur protoplasmatischen Fusion entmauert werden, um ihre Genome auszutauschen und zu rekombinieren, um stabile Rekombinanten zu erhalten. Pan Yanyun et al. beispielsweise nutzten die protoplasmatische Fusionsmethode, um Bacillus licheniformis 2709 mit Bacillus subtilis BD105 zu fusionieren, der den Klonierungsvektor für alkalische Proteasegene pDW2 enthält, um einen ertragreichen Stamm A16 zu erhalten, dessen Fermentationsenzymproduktion 50%-100% höher ist als die von 2709 und dessen Enzymproduktion im Schüttelkolbentest bis zu 30.000 U/mL beträgt.
2.2 Konstruktion von gentechnischen Bakterien
Für die Konstruktion von Ingenieurbakterien werden in der Regel geeignete Expressionswirte und Expressionsvektoren oder Expressionselemente benötigt. Zunächst wird das Zielgen in den Expressionsvektor kloniert, um den rekombinanten Vektor zu erhalten, dann wird es in den Expressionswirt transformiert, durchläuft den Screening-Prozess und erhält schließlich den Hochertragsstamm-Prozess. Es ist auch möglich, die exogenen Zielgenfragmente direkt in das Genom des Wirts zu integrieren, um ertragreiche Stämme zu erhalten.
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Min Zhang et al. ligierten die Promotor-Signalpeptid-Sequenz (sacR) des sacB-Gens mit dem neutralen Proteasegen von Bacillus subtilis und klonierten sie in den Vektor pHP13, konstruierten den induzierbaren Expressionssekretionsvektor pHP13SN, der das neutrale Proteasegen enthält, und transformierten ihn dann in Bacillus subtilis DB104, der eine um 48% erhöhte Lebensfähigkeit des Enzyms im Vergleich zum Ausgangsstamm zeigte. wangHui et al. klonierten Banpr, eine neutrale Protease aus Bacillus amyloliquefaciens K11, und konstruierten ein rekombinantes Expressionsplasmid, pUB110-Banpr, mit Bacillus amyloliquefaciens K11 als Expressionswirt. Die Enzymaktivität in der Schüttelkolbenfermentation erreichte 8995 ± 250 U/mL und 28084 ± 1282 U/mL in einem 15-Liter-Fermentationssystem, was viel mehr war als die des Industriestamms Bacillus subtilis AS.1398 (8000-10000 U/mL).
2.3 Verbesserung der Protease-Eigenschaften
Mit der Entwicklung gerichteter In-vitro-Evolutionstechniken können Proteine mit verbesserten oder neuartigen Funktionen durch zufällige Mutation kodierender Gene, DNAShuffling-Techniken und gerichtetes Screening ohne Kenntnis der dreidimensionalen Strukturinformationen und des Wirkmechanismus des Zielproteins gewonnen werden.
Die Stabilität des Enzyms ist ein Schlüsselfaktor für den Erfolg der Vermarktung. Die Enzymstabilität kann durch die Einführung von Salzbrücken, Disulfidbindungen, aromatischen Wechselwirkungen und die Erhöhung der Affinität des Enzyms für Calciumionen verbessert werden, wodurch die Steifigkeit des Moleküls durch gezielte Mutagenese erhöht wird. Der Ersatz von Gly61 oder Ser98 der Protease BPN' durch Cys bzw. von beidem führte zu einer Erhöhung der thermischen Stabilität des Enzyms ohne Änderung der katalytischen Effizienz.
Durch Ersetzen von Val72 durch Ile, Ala92 durch Thr und Gly131 durch Asp der B. subtilis-Protease kann das mutierte Enzym bei 10 °C eine 2-mal höhere Substrataktivität als das wilde Enzym katalysieren. Im Jahr 2005 stellte das dänische Unternehmen Novozymes eine Niedrigtemperatur-Protease "Polarzyme" vor, die Detergenzien zugesetzt werden kann. Durch die Zugabe von Polarzyme zum Waschmittel konnte die Waschtemperatur von 60°C und 40°C auf 30°C und 20°C gesenkt werden, wodurch 60% Strom eingespart wurden und der Absatz des Waschmittels "carecoldwash" mit Niedertemperaturprotease um das Siebenfache stieg.
3 Ausblick
Proteasen werden in einer Vielzahl von Bereichen eingesetzt, die eng mit unserem täglichen Leben verbunden sind, und dieses Umfeld stellt hohe Anforderungen an die Produktion und Charakterisierung von Proteasen. Daher sind ein tieferes Verständnis des katalytischen Mechanismus der Protease, die Beziehung zwischen räumlicher Struktur und katalytischer Funktion und die gezielte Modifikation von enzymproduzierenden Stämmen, um den Anforderungen der industriellen Produktion gerecht zu werden, auch in Zukunft der Entwicklungstrend des Enzym-Engineering. Darüber hinaus sollte neben der Auswahl und Züchtung guter Stämme versucht werden, neue Expressionssysteme oder Koexpressionssysteme für mehrere Proteasegene zu konstruieren und weitere Expressionsvektoren für Proteasen zu konstruieren, um die effektive Expression verschiedener Komponenten zu realisieren und die Expressionsmenge, Enzymaktivität und Enzymstabilität weiter zu verbessern.
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