1. Methode zum Nachweis der Naringinase-Enzymaktivität
1-1 Spektralphotometer-Methode
Die p-Nitrophenol-Spektralphotometer-Methode verwendet p-Nitrophenol-α-Rhamnosid ( pNP- α-Rha) und p-Nitrophenol-β-D-Glucopyranosid ( pNP- β-Glu) als Substrat, um die Enzymaktivität der α-Rhamnosidase und β-Glucosidase nachzuweisen. Li Ping benutzte die p-Nitrophenol-Spektrophotometer-Methode, in dem Experiment der Zugabe von Aspergillus niger β-Glucosidase in die Lösung von p-Nitrophenol-β-Glucosid ( pNPG ) zur enzymatischen Hydrolyse, und der Wert der Absorption wurde bei 400 nm ultravioletter Wellenlänge gemessen. Anhand des Absorptionswerts wird die Enzymaktivität der β-Glucosidase berechnet. Diese Methode hat eine hohe Substratspezifität, aber das Standardsubstrat ist teuer, und die Enzymaktivität der Naringinase zur Hydrolyse von Glykosiden in Lebensmitteln kann nicht bestimmt werden, so dass diese Methode nicht für den Nachweis der Enzymaktivität bei der industriellen Herstellung von Naringinase im großen Maßstab geeignet ist.
Das Prinzip der Davis-Spektralphotometer-Methode besteht darin, dass Naringin unter leicht alkalischen Bedingungen eine chromogene Reaktion mit 90% Diethylenglykol eingehen kann, und die Bildung des gelben Naringinchalkons kann unter ultraviolettem Licht mit einer Wellenlänge von 420 nm nachgewiesen werden. Anhand des gemessenen Absorptionswerts kann die verbleibende Menge des Substrats Naringin berechnet werden, und die Naringinase-Aktivität kann dann durch Berechnung ermittelt werden. Wang Weina et al. verwendeten eine verbesserte Davis-Methode, nahmen Naringin als Substrat und fügten Naringinase hinzu, die durch Flüssigfermentation von Aspergillus niger FFCC 848 zur enzymatischen Hydrolyse hergestellt wurde. Die Absorption wurde unter 420 nm ultraviolettem Licht gemessen und anschließend die Enzymaktivität berechnet. Die Davis-Spektralphotometer-Methode zur Messung der Enzymaktivität ist einfach zu bedienen und schnell, so dass diese Methode weit verbreitet ist, um die Naringinase-Produktion durch Fermentation und die Aktivität der immobilisierten Naringinase in kurzer Zeit zu bestimmen.
1-2 Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
Das Prinzip der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) besteht darin, dass die HPLC das Substrat Naringin, das Zwischenprodukt Purunin und das Endprodukt Naringenin während des gesamten Hydrolyseprozesses genau bestimmen und quantitativ analysieren kann, um dann die Enzymaktivität zu berechnen. Chen Yuelong und andere benutzten HPLC, um die Retentionszeit von Naringin, Arbutin, Myriketin und ihren Produkten zu bestimmen, und erreichten eine vollständige Trennung mit einer Auflösung von mehr als 1,5, und überwachten effektiv die Wirkung von Naringinase auf mehrere Glykoside im Hydrolyseprozess, wobei gleichzeitig die Enzymaktivität genau bestimmt wurde. Die HPLC-Methode hat den Vorteil einer hohen Genauigkeit und kann die Einmischung von Verunreinigungen vermeiden, aber im Vergleich zur Davis-Methode hat diese Methode eine längere Nachweiszeit und eine kompliziertere Bedienung.
1-3 Verbesserte Methode zur Bestimmung der Naringinase-Enzymaktivität
Anwendung der verbesserten Davis-Methode: 0,8 mL von 0,8 g-L-1 Naringinlösung, die mit pH 4,5-Puffer hergestellt wurde, in das Reaktionssystem mit 40 mg immobilisierter Naringinase (oder 0,2 mL freier Naringinase) gegeben. Das System wird für 30 Minuten in ein Wasserbad mit konstanter Temperatur von 50 ℃ gestellt. 0,1 mL der enzymatischen Hydrolyse-Reaktionslösung werden mit 5 mL Diethylenglykol (Volumenanteil 90%) und 0,1 mL NaOH-Lösung (4 mol-L-1) in die Röhrchen geben und 10 Minuten stehen lassen, nachdem sie gleichmäßig gemischt wurden. Messen Sie die Absorption der gemischten Lösung bei 420 nm.
Definition der Aktivität des Enzyms Naringinase (U): Bei einem pH-Wert von 4,5 und 50 ℃ ist 1 Enzymaktivitätseinheit die Menge an Enzym, die erforderlich ist, um 1 μg Naringin pro Minute abzubauen. Verhältnis der Enzymaktivität ( U-g-1 oder U-mL-1) ist definiert als: bei einem pH-Wert von 4,5, 50 ℃, Enzymaktivität von 1 g immobilisierter Naringinase (oder 1 ml freier Naringinase). Die relative Enzymaktivität wird nach der folgenden Formel berechnet:
Bestimmung der Standardkurve: Die Massenkonzentration der Naringin-Standardglykosidlösung wird auf 0, 0,4, 0,8, 1,2, 1,6 g - L eingestellt.-1und dann 0,1 mL Lösung zur Reaktion mit 5 mL Diethylenglykol (90% , v / v) und 0,1 mL Natriumhydroxidlösung ( 4 mol-L-1). Nachdem die Mischung gleichmäßig gemischt wurde und 10 Minuten lang stand, wurde der Lichtabsorptionswert der gemischten Lösung bei 420 nm gemessen und die Standardkurve entsprechend erstellt.
2. Herstellung der Naringinase-Enzymlösung
Der bei 4 ℃ gelagerte Aspergillus niger FFCC uv-11 wurde auf das Schrägmedium übertragen, und die reifen Sporen wurden durch Kultur bei konstanter Temperatur bei 30 ℃ für 96 h erhalten. Dann wurden die Sporen mit steriler normaler Kochsalzlösung mit einem Massenanteil von 0,9% gewaschen. Der Wert der Absorption der Sporensuspension wird bei 600 nm (OD600-Wert) gemessen, mit steriler Kochsalzlösung wurde der OD600-Wert auf 0,200 eingestellt. Und dann die Sporensuspension mit der Volumenfraktion von 10% Inokulation Betrag zu 100 mL Fermentationsmedium (250 mL Erlenmeyerkolben), Die erhaltene Fermentationsbrühe wurde bei 4 ℃ und 6000 r-min zentrifugiert-1 für 10 min in einer gekühlten Zentrifuge. Dann durch den Saugfilter, um den Überstand Flüssigkeit erforderlich Naringin Enzym Enzym Flüssigkeit zu erhalten. Kühlen Sie es bei 4 ℃ für die spätere Verwendung.
3. Herstellung des mit Chitosan immobilisierten Naringinase-Enzyms
Man nehme 3,0 g Chitosan und löse es in 100 mL des Volumenanteils von 2% Essigsäurelösung auf, um 0,3 g - L-1 Die kolloidale Chitosanlösung wurde 20 Minuten lang beschallt, um Luftblasen zu entfernen, und vollständig aufgelöst. Die kolloidale Chitosanlösung wurde tropfenweise mit einer Nadel in 0,5 g - L-1 NaOH-Kondensat (1000 mL), um ein glattes Pellet zu bilden. Die Pellets wurden wiederholt mit destilliertem Wasser gewaschen, um sie zu neutralisieren, und das Wasser wurde durch ein Filterpapier absorbiert, um die Chitosan-Mikrokugeln zu erhalten. 0,4 g Chitosan-Mikrokugeln wurden gewogen, 0,4 ml Glutaraldehyd mit einem Volumenanteil von 6% wurden hinzugefügt, und die Mikrokugeln wurden wiederholt mit destilliertem Wasser gewaschen, bis nach konstanter Temperatur und Vibration bei 25 ℃ 150 r-min kein Glutaraldehyd mehr auf der Oberfläche der Mikrokugeln war.-1 Die vernetzten Chitosan-Mikrosphären wurden durch Trocknen mit Filterpapier gewonnen.
Er sagte, 0,4 g Chitosan-Mikrokugeln, fügen Sie 0,4 ml Mitglied Anzahl der Kredite 6% Glutaraldehyd, bei 150 r - min-1 bei 25 ℃ Temperatur Oszillation Nach 2 h, gewaschen wiederholt mit destilliertem Wasser Mikrokugel auf die Oberfläche davon ist nicht Pentyldialdehyd und Filterpapier getrocknet werden, um vernetzte Chitosan Mikrokugeln zu erhalten. Nehmen Sie 4 mL Naringinase-Enzymlösung, fügen Sie es zu 0,4 g vernetzte Chitosan-Mikrokugeln, schütteln bei einer konstanten Temperatur von 25 ℃, 150 r-min-1 für 2 h, und legen Sie es in einem Kühlschrank bei 4 ℃ für Adsorption Coupling für 4 h. Spülen Sie die restliche Enzymlösung auf der Oberfläche des Trägers mit pH 4,5 Puffer, absorbieren das Wasser auf dem Filterpapier zu immobilisierten Naringinase zu erhalten, und speichern Sie es in einem Kühlschrank bei 4 ℃ für die spätere Verwendung.
4. Herstellung von magnetischen Chitosan-Mikrokugeln auf Siliziumbasis ( MSC)
Der Herstellungsprozess von magnetischen Nanopartikeln auf Siliziumbasis (MS) ist in Abbildung 1 dargestellt.
Abbildung 1 Schematische Darstellung der Herstellung von magnetischen Nanopartikeln auf Siliziumbasis
( 1) Erstens, magnetisches Fe3O4 Nanopartikel, die mit Zitronensäure modifiziert sind, wurden durch die chemische Co-Fällungsmethode hergestellt. Das experimentelle Verfahren umfasst: 2,25 g FeCl3-6H2O und 1,61 g FeSO4-7H2O in einen mit 100 mL entionisiertem Wasser gefüllten Dreihalskolben gegeben, die Temperatur des Systems wurde unter Stickstoff auf 85 ℃ erhitzt. Rühren unter 1000 r-min-1 und gießt schnell 10 mL konzentriertes Ammoniakwasser hinzu. Nachdem die Lösung schwarz geworden ist, fügt man 153 mg Natriumcitrat hinzu. Nach 30 Minuten Reaktionszeit trennt man die Produktion mit einem Magneten und wäscht die feste Phase mehrmals mit entionisiertem Wasser und Ethanol. Das Fe3O4 Die erhaltenen Nanopartikel werden zur späteren Verwendung getrocknet.
( 2) Dann wurden magnetische Nanopartikel auf Siliziumbasis (MS) durch die Sol-Gel-Methode hergestellt, wie in Abbildung 1 dargestellt. Die experimentellen Schritte umfassen: 0,1 g Fe3O4 Nanopartikel wurden gleichmäßig in einer gemischten Lösung aus 40 ml wasserfreiem Ethanol, 10 ml entdestilliertem Wasser und 1,2 ml konzentriertem Ammoniakwasser dispergiert. Unter der Rührbedingung von 300 U/min-1Tröpfchen einer Lösung, die Fe3O4 Nanopartikel wurden zu TEOS (0,4 ml) hinzugefügt, das in 30 ml wasserfreiem Ethanol dispergiert war, und die Reaktion der Nanopartikel auf Siliziumbasis wurde 12 Stunden lang bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Produkte wurden mehrmals mit wasserfreiem Ethanol und destilliertem Wasser gewaschen, um magnetische Nanopartikel auf Siliziumdioxidbasis (MS) zu erhalten, die zur späteren Verwendung getrocknet wurden.
MSC-Mikrokugeln wurden durch Emulsionsvernetzung hergestellt, wie in Abbildung 2 dargestellt. Die experimentellen Schritte umfassten: 0,125 g magnetische Siliziumdioxid-Nanopartikel (MS) wurden gleichmäßig in 10 mL Chitosanlösung mit einem Massenanteil von 2,5% dispergiert, die durch in Essigsäurelösung gelöstes Chitosan mit einem Volumenanteil von 5,0% hergestellt wurde, und dann wurde die Chitosanlösung tropfenweise in eine Emulsion mit 60 mL flüssigem Paraffinwachs und 1,8 mL Twain 80 gegeben. Nach 30 Minuten Rühren im 40 ℃ Wasserbad und 800 r-min-12,0 mL Glutaraldehyd zugeben und 1 h reagieren lassen. Dann wurde der pH-Wert des Systems mit 1 mol-L auf 9,0 eingestellt.-1 Die Produkte wurden mehrmals mit Petrolether, Ethanol und destilliertem Wasser gewaschen, um MSC-Mikrokugeln zu erhalten, die zur späteren Verwendung im Vakuum getrocknet wurden.
Abbildung 2 Schematische Darstellung der Herstellung von magnetischen Chitosan-Mikrokugeln auf Siliziumbasis
5. Herstellung von magnetischen Chitosan-Mikrokugeln auf Epoxidbasis ( MSCE)
0,5 g getrocknete MSC-Mikrokugeln, die nach der Methode von 4 hergestellt wurden, wurden gewogen und in einen Erlenmeyerkolben mit 50 ml Inhalt gegeben. Dann wurden 2,0 mL NaOH-Lösung, Epichrolohydrin-Lösung und NaBH4 Lösung mit einer bestimmten Konzentration in den Kolben gegeben. Die Reaktion wurde bei konstanter Temperaturschwankung für eine bestimmte Zeit durchgeführt. Der Reaktionsmechanismus zur Herstellung von MSCE ist in Abbildung 3 dargestellt.
Abbildung 3: Prinzip der Herstellung von magnetischen Chitosan-Mikrokugeln auf Epoxidbasis
Nach der Aktivierung werden die aktivierten Mikrokugeln wiederholt mit destilliertem Wasser gewaschen, bis keine freien OH- und Epoxidgruppen mehr auf der Oberfläche vorhanden sind, um magnetische Chitosan-Mikrokugeln auf Epoxidbasis (MSCE) zu erhalten. Die Nachweismethode ist wie folgt: 3,0 ml des Waschüberstands werden entnommen und 1~2 Tropfen Phenolphthalein hinzugefügt. Wenn es sich nach dem Schütteln nicht rot färbt, bedeutet dies, dass keine freien OH- mit MSCE vorhanden sind; nehmen Sie 3,0 mL des Waschüberstands und fügen Sie 3,0 mL 1,3 mol-L-1 Natriumthiosulfat und 1 ~2 Tropfen Phenolphthalein. Wenn sich die Lösung nach dem Schütteln nicht rot färbt, bedeutet dies, dass es keine freien Epoxidgruppen mit MSCE gibt. Die Reaktionsgleichung für den Nachweis von Epoxidgruppen lautet wie folgt:
6 Herstellung des MSCE-immobilisierten Naringinase-Enzyms
5,0 g der nach Methode 5 hergestellten MSCE wurden zu 50 ml Naringinase-Enzymlösung mit einem bestimmten pH-Wert hinzugefügt, und die Reaktion wurde unter einem Wasserbad mit konstanter Temperatur oszilliert, wie in Abbildung 4 dargestellt. Nach der Reaktion wurden die Mikrokugeln mehrere Male mit Pufferlösung gewaschen, bis keine freie Naringinase mehr auf der Oberfläche der Mikrokugeln zu finden war. Die Mikrokugeln wurden durch einen Brinella-Trichter abgelassen, um das MSCE-immobilisierte Naringinase-Enzym zu erhalten, das zur späteren Verwendung bei 4 ℃ gekühlt wurde.
Abbildung 4: Prinzip der Herstellung des MSCE-immobilisierten Naringinase-Enzyms
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