Para nitrofenol spektrofotometrik yöntem, α-rhamnosidaz ve β-glukosidazın enzim aktivitesini tespit etmek için substrat olarak p-nitrofenol- α-rhamnoside (pNP- α- Rha) ve p-nitrofenol-β-D-glukopiranoside (pNP- β-Glu) kullanır. Li Ping, enzimatik hidroliz için p-nitrofenol -β-glukozit (pNPG) çözeltisine Aspergillus niger β-glukozidaz ekleme deneyinde p-nitrofenol spektrofotometre yöntemini kullandı ve absorbans değeri 400 nm ultraviyole dalga boyunda ölçüldü. Ve absorbans değerine dayanarak, β-glukozidazın enzim aktivitesini hesaplarlar. Bu yöntem güçlü substrat özgüllüğüne sahiptir, ancak standart substrat pahalıdır ve gıdalardaki glikozitleri hidrolize etmek için naringinazın enzim aktivitesi belirlenemez, bu nedenle bu yöntem naringinazın endüstriyel büyük ölçekli hazırlanmasında enzim aktivitesinin tespiti için uygun değildir.
Davis spektrofotometre yönteminin prensibi, naringinin hafif alkali koşullar altında 90% dietilen glikol ile kromojenik bir reaksiyon reaksiyonu meydana getirebilmesi ve sarı naringin kalkon üretiminin 420 nm dalga boyuna sahip ultraviyole ışık altında tespit edilebilmesidir. Ölçülen absorbans değerine göre, kalan substrat naringin miktarı hesaplanabilir ve ardından naringinaz aktivitesi hesaplama yoluyla elde edilebilir. Wang Weina ve arkadaşları geliştirilmiş bir Davis yöntemi kullanmış, substrat olarak naringini almış ve enzimatik hidroliz için Aspergillus niger FFCC 848'in sıvı fermantasyonu ile üretilen naringinazı eklemiştir. Absorbans 420 nm ultraviyole ışık altında ölçülmüş ve ardından enzim aktivitesi hesaplanmıştır. Enzim aktivitesini ölçmek için Davis spektrofotometre yönteminin kullanımı basittir, hızlıdır, bu nedenle bu yöntem, fermantasyon yoluyla naringinaz üretiminin ve immobilize naringinaz aktivitesinin eeal zaman tespitinde yaygın olarak kullanılmaktadır.
1-2 Yüksek performanslı sıvı kromatografisi
Yüksek performanslı sıvı kromatografisinin (HPLC) prensibi, HPLC'nin tüm hidroliz işlemi sırasında substrat naringin, ara ürün purunin ve nihai ürün naringenin'i doğru bir şekilde belirleyip kantitatif olarak analiz edebilmesi ve ardından enzim aktivitesini hesaplayabilmesidir. Chen Yuelong ve diğerleri, naringin, arbutin, mirisetin ve ürünlerinin alıkonma süresini belirlemek için HPLC'yi kullandılar ve 1.5'ten daha yüksek bir çözünürlükle tam ayırma elde ettiler ve hidroliz sürecinde naringinazın çoklu glikozitler üzerindeki etkisini etkili bir şekilde izlediler, aynı zamanda enzim aktivitesi doğru bir şekilde belirlendi. HPLC yöntemi yüksek doğruluk avantajlarına sahiptir ve safsızlıkların girişimini önleyebilir, ancak Davis yöntemiyle karşılaştırıldığında, bu yöntem daha uzun bir tespit süresine ve daha karmaşık bir işleme sahiptir.
1-3 Naringinaz enzim aktivitesi için geliştirilmiş tayin yöntemi
Geliştirilmiş Davis yöntemini kullanarak: 0,8 mL 0,8 g-L-1 pH 4,5 tamponu ile hazırlanan naringin çözeltisi, 40 mg immobilize naringinaz (veya 0,2 mL serbest naringinaz) içeren reaksiyon sistemine eklenmiştir. 30 dakika boyunca 50 ℃ sabit sıcaklıktaki su banyosuna yerleştirin. Reaksiyon enzimatik hidroliz çözeltisinden 0,1 mL alın ve 5 mL dietilen glikol (90% hacim fraksiyonu) ve 0,1 mL NaOH çözeltisi (4 mol-L-1) tüplere koyun ve eşit şekilde karıştırdıktan sonra 10 dakika bekletin. Karışık çözeltinin absorbansını 420 nm'de ölçün.
Naringinaz enziminin aktivitesinin tanımı (U): pH 4.5, 50 ℃ koşulunda, 1 enzim aktivitesi birimi, dakikada 1 μg naringini parçalamak için gereken enzim miktarıdır. Enzim aktivite oranı ( U-g-1 veya U-mL-1) şu şekilde tanımlanır: pH 4.5, 50 ℃ koşulunda, 1 g immobilize naringinaz (veya 1 mL serbest naringinaz) tarafından sergilenen enzim aktivitesi. Bağıl enzim aktivitesi aşağıdaki formüle göre hesaplanır:
Standart eğrinin belirlenmesi: Standart glikozit naringin çözeltisinin kütle konsantrasyonu 0, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6 g - L olarak ayarlanmıştır.-1daha sonra 0,1 mL çözelti alınarak 5 mL dietilen glikol (90% , v/v) ve 0,1 mL sodyum hidroksit çözeltisi ( 4 mol-L-1). Karışım eşit şekilde karıştırıldıktan ve 10 dakika bekletildikten sonra, karışık çözeltinin ışık absorpsiyon değeri 420 nm'de ölçülmüş ve buna göre standart eğri çizilmiştir.
2. Naringinaz enzim çözeltisinin hazırlanması
4°C'de saklanan Aspergillus niger FFCC uv-11 eğimli besiyerine aktarılmış ve olgun sporlar 96 saat boyunca 30°C'de sabit sıcaklık kültürü ile elde edilmiştir. Daha sonra, sporlar 0.9% kütle fraksiyonu ile steril normal salin ile yıkanmıştır. spor süspansiyonunun absorbans değeri 600 nm'de ölçülmüştür (OD600 değeri), steril salin ile OD600 değeri 0.200'e ayarlanmıştır. Daha sonra 10% hacim fraksiyonuna sahip spor süspansiyonu 100 mL fermantasyon ortamına (250 mL konik şişe) inoküle edilmiştir, Elde edilen fermantasyon suyu 4 ℃ ve 6000 r-dk'da santrifüj edilmiştir.-1 soğutmalı santrifüjde 10 dakika boyunca. Daha sonra emme filtresinden geçirerek süpernatant sıvı elde etmek için gerekli naringin enzim enzim sıvısını elde edin. Daha sonra kullanmak üzere 4 ℃'de soğutun.
3. Kitosan İmmobilize Naringinaz Enziminin Hazırlanması
3.0 g kitosan, 100 mL hacim fraksiyonu 2% asetik asit çözeltisi ile çözülerek 0.3 g - L-1 Kitosan kolloidal çözeltisi, hava kabarcıklarını gidermek için 20 dakika boyunca sonikasyona tabi tutulmuş ve tamamen çözünmesine izin verilmiştir. Kitosan kolloidal çözeltisi bir iğne ile damla damla 0,5 g - L-1 Düzgün bir pelet oluşturmak için NaOH kondensatı (1000 mL). Oda sıcaklığında 3 saat bekletildi ve peletler nötr hale gelene kadar tekrar tekrar damıtılmış su ile yıkandı ve kitosan mikroküreleri elde etmek için su bir filtre kağıdı tarafından emildi. 0,4 g kitosan mikroküreler tartılmış, 6% hacim fraksiyonlu 0,4 ml glutaraldehit eklenmiş ve mikroküreler, sabit sıcaklık ve 25 ℃ 150 r-min titreşimden sonra mikrokürelerin yüzeyinde glutaraldehit kalmayıncaya kadar distile su ile tekrar tekrar yıkanmıştır.-1 Çapraz bağlı kitosan mikroküreler filtre kağıdı ile kurutularak elde edilmiştir.
0,4 g kitosan mikroküresi, 0,4 mL üye sayısı 6% glutaraldehit, 150 r - dk'da-1 25 ℃ sıcaklık salınımında 2 saat sonra, mikro küre yüzeyine pentil Dialdehit olmayan damıtılmış su ile tekrar tekrar yıkanır ve çapraz bağlı kitosan mikroküreleri elde etmek için filtre kağıdı kurutulur. 4 mL naringinaz enzim çözeltisi alınır, 0,4 g çapraz bağlı kitosan mikrokürelere eklenir, 25 ℃ sabit sıcaklıkta, 150 r-min'de çalkalanır-1 Taşıyıcının yüzeyinde kalan enzim çözeltisini pH 4.5 tamponu ile durulayın, immobilize naringinaz elde etmek için filtre kağıdındaki suyu emdirin ve daha sonra kullanmak üzere 4 ℃'de buzdolabında saklayın.
4. Manyetik silikon bazlı kitosan (MSC) mikrokürelerin hazırlanması
Manyetik silikon bazlı nanopartiküllerin (MS) hazırlanma süreci Şekil 1'de gösterilmektedir.
Şekil 1 Manyetik silikon bazlı nanopartiküllerin hazırlanmasının şematik diyagramı
( 1) İlk olarak, manyetik Fe3O4 Sitrik asit ile modifiye edilmiş nanopartiküller kimyasal birlikte çöktürme yöntemi ile hazırlanmıştır ve deneysel prosedür şu şekildedir: 2.25 g FeCl3-6H2O ve 1,61 g FeSO4-7H2O, 100 mL deiyonize su ile doldurulmuş üç boyunlu balona eklenir, sistemin sıcaklığı azot gazı koşullarında 85 ℃'ye ısıtılır. 1000 r-dk altında karıştırın-1 ve hızla 10 mL konsantre amonyaklı su dökün. Çözelti siyaha döndükten sonra 153 mg sodyum sitrat ekleyin. 30 dakikalık reaksiyondan sonra, üretimi bir mıknatısla ayırın ve katı fazı birkaç kez deiyonize su ve etanol ile yıkayın. Fe3O4 Elde edilen nanopartiküller daha sonra kullanılmak üzere kurutulur.
(2) Ardından, Şekil 1'de gösterilen sol-jel yöntemiyle manyetik silikon bazlı nanopartiküller (MS) hazırlanmıştır. Deneysel adımlar şunları içerir: 0.1 g Fe3O4 nanopartiküller, 40 mL susuz etanol, 10 mL damıtılmış su ve 1,2 mL konsantre amonyaklı su içeren karışık bir çözelti içine homojen bir şekilde dağıtılmıştır. Karıştırma koşulu altında 300 r-min-1, Fe içeren çözelti damlacıkları3O4 nanopartiküller 30 mL susuz etanol içinde dağılmış TEOS'a (0,4 mL) eklenmiş ve silikon bazlı nanopartiküllerin reaksiyonu oda sıcaklığında 12 saat boyunca gerçekleştirilmiştir. Ürünler susuz etanol ve damıtılmış su ile birkaç kez yıkanarak manyetik silika bazlı nanopartiküller (MS) elde edilmiş ve bunlar daha sonra kullanılmak üzere kurutulmuştur.
MSC mikroküreleri Şekil 2'de gösterildiği gibi emülsiyon çapraz bağlama yöntemiyle hazırlanmıştır. Deneysel adımlar şunları içermektedir: 0,125 g manyetik silika nanopartikül (MS), hacim oranı 5,0% olan asetik asit çözeltisinde çözündürülen kitosan ile hazırlanan kütle oranı 2,5% olan 10 mL kitosan çözeltisine eşit olarak dağıtılmış ve ardından kitosan çözeltisi 60 mL sıvı parafin mumu ve 1,8 mL twain 80 içeren bir emülsiyona damla damla eklenmiştir. 40 ℃ su banyosu ve 800 dev/dak koşullarında 30 dakika karıştırıldıktan sonra-12,0 mL glutaraldehit ekleyin ve 1 saat reaksiyona sokun. Daha sonra sistemin pH'ı 1 mol-L ile 9,0'a ayarlandı.-1 Ürünler petrol eteri, etanol ve damıtılmış su ile birkaç kez yıkanarak MSC mikroküreleri elde edilmiş ve bunlar daha sonra kullanılmak üzere vakumda kurutulmuştur.
Şekil 2 Manyetik silikon bazlı kitosan mikrokürelerin hazırlanmasının şematik diyagramı
5. Epoksi bazlı manyetik silikon bazlı kitosan mikrokürelerin (MSCE) hazırlanması
4 yöntemiyle hazırlanan kurutulmuş MSC mikrokürelerinden 0,5 g tartılmış ve 50 mL'lik bir konik balona eklenmiştir. Ardından 2.0 mL NaOH çözeltisi, epikrolohidrin çözeltisi ve NaBH4 çözeltisi sırasıyla belirli bir konsantrasyonda şişeye eklenmiştir. Ve reaksiyon belirli bir süre boyunca sabit sıcaklık salınımı ile gerçekleştirilmiştir. MSCE'nin hazırlanmasına ilişkin reaksiyon mekanizması Şekil 3'te gösterilmektedir.
Şekil 3 Epoksi bazlı manyetik silikon bazlı kitosan mikrokürelerin hazırlanma prensibi
Aktivasyondan sonra, epoksi bazlı manyetik silikon bazlı kitosan mikroküreler (MSCE) elde etmek için yüzeyde serbest OH- ve epoksi grupları kalmayıncaya kadar aktifleştirilmiş mikroküreler distile su ile tekrar tekrar yıkanır. Tespit yöntemi şu şekildedir: yıkama süpernatantından 3.0 mL alınır ve 1~2 damla fenolftalein eklenir. Çalkaladıktan sonra, kırmızıya dönmediyse, MSCE ile serbest OH- olmadığı anlamına gelir; yıkama süpernatantından 3.0 mL alın ve 3.0 mL 1.3 mol-L-1 sodyum tiyosülfat ve 1 ~ 2 damla fenolftalein, çözelti çalkalandıktan sonra kırmızıya dönmediyse, MSCE ile serbest epoksi grupları olmadığı anlamına gelir. Epoksi grubunun tespitine ilişkin reaksiyon denklemi aşağıdaki gibidir:
6 MSCE immobilize naringinaz enziminin hazırlanması
Yöntem 5 ile hazırlanan 5.0 g MSCE, belirli bir pH değerine sahip 50 mL naringinaz enzim çözeltisine eklenmiş ve reaksiyon Şekil 4'te gösterildiği gibi sabit sıcaklıktaki bir su banyosu altında salınmıştır. Reaksiyondan sonra mikroküreler, mikrokürelerin yüzeyinde serbest naringinaz bulunmayana kadar birkaç kez tampon çözeltisi ile yıkandı. Mikroküreler, daha sonra kullanılmak üzere 4 °C'de soğutulan MSCE immobilize naringinaz enzimini elde etmek için bir Brinella hunisi ile boşaltıldı.
Şekil 4 MSCE immobilize naringinaz enziminin hazırlanma prensibi
Şimdi Bize Ulaşın!
Fiyata ihtiyacınız varsa, lütfen aşağıdaki forma iletişim bilgilerinizi doldurun, genellikle 24 saat içinde sizinle iletişime geçeceğiz. Bana e-posta da gönderebilirsiniz info@longchangchemical.com Çalışma saatleri içinde (8:30 - 6:00 UTC+8 Pzt.~Sat.) veya hızlı yanıt almak için web sitesi canlı sohbetini kullanın.
