L'efficienza del carbonio è uno dei principali fattori che definiscono la vitalità di un processo di percorso ed è il principale determinante del tasso di prodotto per unità di substrato. Due fattori determinano l'efficienza del carbonio: il bilancio di elettroni dal substrato al prodotto, che può essere calcolato dal grado di riduzione del substrato e del prodotto, e il fatto che le vie metaboliche esistenti sono principalmente progettate per ottenere tassi di reazione più elevati piuttosto che alte rese di carbonio. Il primo fattore è strettamente legato alla composizione chimica del substrato e del prodotto. Il secondo fattore può essere superato riprogettando la via metabolica, che consente di trattenere o, in alcuni casi, assimilare il carbonio del substrato durante la formazione del prodotto.

1. Equilibrio redox in lievito metabolismo L'efficienza delle vie metaboliche necessarie per una produzione biologica efficiente di sostanze chimiche dipende da una serie di fattori come l'equilibrio redox, il bilancio energetico, la fattibilità termodinamica, l'equilibrio stechiometrico, l'accoppiamento dei flussi, l'inibizione a feedback, la tossicità dei prodotti, la cinetica e così via. Il metabolismo cellulare mantiene la crescita delle cellule e l'equilibrio redox trasferendo gli elettroni dai substrati ai diversi metaboliti. Pertanto, la via biosintetica ottimale per la produzione di un metabolita desiderato dovrebbe essere neutrale dal punto di vista redox e la resa della via (YP) dovrebbe essere pari o molto vicina alla massima resa teorica (YE) della combinazione substrato-prodotto target.La YP dipende dal percorso coinvolto ed è determinata sulla base della sua stechiometria, mentre la YE è la quantità massima di prodotto che può essere formata dal substrato e può essere calcolata dal rapporto substrato-prodotto γS/γP calcolato dove γS e γP sono il grado di riduzione del substrato e del prodotto, rispettivamente. Il grado di riduzione può essere definito come il numero di elettroni equivalenti disponibili per ogni atomo di carbonio del composto. Pertanto, l'YE deve tenere conto del bilancio di elettroni per la conversione di un substrato in un prodotto, che può richiedere la decarbossilazione con conseguente perdita di carbonio o la carbossilazione per fornire un ulteriore assorbimento di carbonio. La figura seguente illustra la via metabolica centrale del lievito. Figura 1. Via metabolica centrale del carbonio del lievito, che evidenzia la relazione tra le fasi di carbossilazione/decarbossilazione e le variazioni del grado di riduzione del substrato e del prodotto. Il grado di riduzione dei substrati, dei metaboliti intermedi e dei prodotti corrispondenti è indicato dal cambiamento di colore dal rosso (γ=0) al giallo (γ=4) al blu (γ=6).
In base al grado di riduzione del substrato e del prodotto target, si possono distinguere tre casi: quando il substrato e il prodotto target hanno lo stesso grado di riduzione, esiste una situazione ideale in cui il substrato viene completamente convertito in prodotto. Cioè, la resa effettiva del prodotto può essere vicina alla resa teorica massima (YE), ma il processo metabolico produrrà sottoprodotti per la formazione della biomassa e il mantenimento della crescita cellulare, riducendo la resa del prodotto. Un esempio è l'acido lattico (γ = 4,0), che ha lo stesso grado di riduzione del glucosio (γ = 4,0). Pertanto, il processo di produzione del lattato è un percorso redox-neutro con una stechiometria bilanciata, pur consentendo la generazione di ATP, che risulta in un tasso vicino alla massima resa teorica. Complessivamente, per altri substrati-prodotti, è raro trovare percorsi di questo tipo che non generino un potere riducente eccessivo.
Quando il prodotto è più ridotto del substrato, le reazioni di ossidazione necessarie per formare il prodotto generano equivalenti ossidativi aggiuntivi (NAD+, NADP+, FADH+). Per ridurre questi equivalenti ossidativi, la cellula deve ossidare il carbonio a CO2 e/o altri sottoprodotti (ad esempio, nella via del pentoso fosfato (PPP), nel ciclo TCA o nel ciclo dello xilulosio fosfato (XuMP)) per mantenere l'omeostasi redox. Questo processo può influenzare l'efficienza complessiva della conversione dei substrati in prodotti target. Tra gli esempi vi sono gli acidi grassi, l'etanolo e il glicerolo.
L'uso del glucosio come substrato per generare acidi grassi, come l'acido palmitico (γ = 5,75), riduce la resa in acidi grassi a causa dell'elevato fabbisogno di NADPH e del rilascio di CO2 durante l'estensione della catena carboniosa, con conseguente perdita di substrato.Yu et al [1] sono riusciti ad aumentare la resa in acidi grassi in Saccharomyces cerevisiae fino a 40% costruendo una via metabolica riduttiva anabolizzante caratterizzata da un ciclo di decarbossilazione ripetitivo per fornire alla cellula NADH, NADPH e ATP aggiuntivi.
La produzione di etanolo dal glucosio ossida anche alcuni substrati a CO2 e glicerolo a causa della necessità di fornire NADH. Tuttavia, la via naturale del lievito per la fermentazione dell'etanolo mantiene il grado di riduzione del glucosio (γ = 4,0), con una riduzione media complessiva di γ = 4,0 quando la CO2 e l'etanolo sono i prodotti finali. Analogamente, quando l'1,2-propandiolo (1,2-PDO) (γ=5,33) è stato prodotto dal lievito di birra utilizzando il glicerolo (γ=4,66) come unica fonte di carbonio, la modifica di ingegneria metabolica ha fornito NADH aggiuntivo per facilitare la sintesi dell'1,2-PDO, ottenendo le rese più elevate fino ad oggi nel lievito di >4 g/L di 1,2-PDO.
Quando il prodotto viene ridotto al di sotto del substrato, durante la sua produzione vengono generati sia equivalenti riducenti che prodotto. Un meccanismo comune per riossidare gli equivalenti riducenti in eccesso è l'ossidazione da parte della catena respiratoria, che genera un eccesso di ATP e/o rilascia calore. Di conseguenza, la resa del prodotto è inferiore al massimo teorico ottenibile con gli elettroni disponibili. In alternativa, gli equivalenti riducenti in eccesso possono essere consumati riducendo parte della fonte di carbonio in sottoprodotti riducenti. Questa combinazione substrato-prodotto ha il potenziale di fissare il carbonio per aumentare la resa del metabolita target. Come nella produzione di acido citrico (γ = 3,0) dal glucosio, la ricaduta energetica dovuta alla formazione di NADH significa che la cellula può semplicemente guadagnare energia producendo il composto target al costo di una perdita di resa. La scarsa efficienza della via biochimica naturale per la sintesi dell'acido citrico rappresenta quindi un'opportunità per avvicinarsi al massimo tasso teorico di guadagno che si può ottenere fissando il carbonio.
Pertanto, i substrati da utilizzare per il prodotto desiderato possono essere selezionati in base a γS e γP per massimizzare la resa. Il substrato preferito del lievito, il glucosio, può essere utilizzato per sintetizzare prodotti con lo stesso γ del glucosio, come etanolo (più CO2) o acido lattico. Sebbene il glucosio sia il substrato preferito, esso è in diretta concorrenza con la produzione di alimenti o mangimi. Pertanto, diverse fonti di carbonio più economiche come glicerolo, metanolo e CO2 sono considerate substrati promettenti.
Il metanolo (γ = 6,0) è una materia prima C1 con un elevato grado di riduzione. Uno dei principali vantaggi dell'utilizzo del metanolo come fonte di carbonio è il suo potere riducente, che in microrganismi come il lievito metilotrofico forma NADH e genera ATP. Tuttavia, poiché la prima reazione del percorso è l'ossidazione del metanolo a formaldeide utilizzando l'ossigeno come accettore di elettroni, il lievito perde un NADH per ogni porzione di metanolo assunta.Studi recenti hanno dimostrato che Komagataella phaffii è stata in grado di utilizzare il metanolo in modo più efficiente sovraesprimendo la metanolo deidrogenasi endogena (Adh2) in un ceppo con deficit di alcool ossidasi (Mut-), con conseguente produzione di NADH e ATP aggiuntivi per ogni porzione di metanolo. Questo ha permesso al ceppo Mut-Adh2 di aumentare l'intensità della produzione di proteine eterologhe in condizioni di basso consumo di ossigeno ed emissione di calore.
Un'altra fonte di carbonio promettente è la CO2, che è un composto altamente ossidato (γ=0) che può essere ridotto dagli autotrofi per produrre composti organici per la biosintesi. Pertanto, un modo per introdurre la CO2 nel metabolismo del lievito è la conversione del co-substrato, che converte la CO2 insieme a un'altra fonte di carbonio in un prodotto con un grado di riduzione inferiore rispetto al co-substrato. Nella biosintesi degli acidi organici, che hanno un γ inferiore a quello del glucosio, come l'acido citrico, maleico e succinico, questa strategia consente di incorporare la CO2 nei processi di fermentazione industriale per aumentare la resa di carbonio.

2. Come bilanciare il grado di riduzione dei prodotti? L'evoluzione dei processi metabolici nei microrganismi è solitamente basata sulla rapida crescita delle cellule piuttosto che sulla produzione di prodotti specifici. Pertanto, la cellula privilegia un metabolismo rapido rispetto a un'elevata produzione di carbonio. Pertanto, la capacità delle cellule di migliorare la ritenzione di carbonio durante il metabolismo è una delle maggiori sfide dell'ingegneria metabolica, che impedisce alle fabbriche microbiche di raggiungere una produzione chimica ad alto rendimento. In questo articolo si discute l'ingegneria metabolica del lievito volta a massimizzare la ritenzione di carbonio, compresa la fissazione della CO2 e ad evitare fasi di decarbossilazione non essenziali nella cellula.2.1 Integrazione del carbonio inorganico nel metabolismo cellulare utilizzando la CO2 come substrato Esistono diversi percorsi: una molecola di CO2 forma composti organici per carbossilazione; la CO2 viene convertita per riduzione in acido formico o CO, che possono essere assimilati nella biomassa. Le reazioni di carbossilazione sono catalizzate da carbossilasi, come RuBisCO nel ciclo CBB della via autotrofa di fissazione della CO2 o gli enzimi della via Pck e Pyc, coinvolti nella fornitura di precursori metabolici centrali. Il principio della riduzione del carbonio è che la CO2 viene ridotta ad acido formico o CO dalla formiato deidrogenasi o dalla CO deidrogenasi, come nella via dell'acetil coenzima A ridotto.2.1.1 Espressione di enzimi CBBase eterologhi per la fissazione della CO2 nel lievitoProduzione di etanolo in S. cerevisiae Nella produzione di etanolo in S. cerevisiae, Guadalupe-Medina et al [2] hanno utilizzato la CO2 come accettore di elettroni per sfruttare l'eccesso di potere riducente, vale a dire, la conversione della CO2 nel metabolita intermedio della via PPP Ru5P da parte degli enzimi RuBisCO e Prk della via del ciclo CBB, con un aumento di 10% nella produzione di etanolo e una diminuzione di 90% nella produzione di glicerolo come sottoprodotto.Xia et al [3 ] hanno riscontrato uno squilibrio redox durante la fermentazione anaerobica quando lo xilosio è stato utilizzato come substrato per la produzione di etanolo. L'espressione di RrRuBisCO e SoPRK ha permesso il riutilizzo della CO2 dalla decarbossilazione del piruvato e ha ridotto la resa dei sottoprodotti xilitolo e glicerolo.Gassler et al[4] hanno costruito un ciclo CBB funzionale nel lievito metilotrofico K. phaffii, che fornisce energia e potere riducente attraverso il metanolo e produce acido lattico e malonato utilizzando la CO2 come fonte di carbonio.2.1.2 Via della glicina di riduzione
La via della glicina riduttiva è considerata la via più efficiente per la crescita aerobica con l'acido formico. Tutti gli enzimi della via della pro-glicina sono presenti in S. cerevisiae, che però non può utilizzare l'acido formico come substrato per la crescita. La sovraespressione degli enzimi endogeni della via ha portato all'espressione funzionale della via della glicina ridotta, che consente la sintesi della glicina dall'acido formico e della CO2 come co-substrato per sostenere la crescita dei ceppi con deficit di glicina. La via dipende da alte concentrazioni di CO2 (10%). Recentemente, in K. phaffii è stata identificata una via per la glicina ridotta naturalmente resistente all'ossigeno, ma l'attività naturale di questa via non è sufficiente a sostenere la crescita cellulare.
2.1.3 Ramo ridotto del ciclo TCA (rTCA)
Il ciclo TCA ridotto (rTCA) è una via di fissazione della CO2 presente nei procarioti. rTCA è il processo inverso del ciclo TCA ossidato e forma una molecola di acetil coenzima A fissando due molecole di CO2. Finora, il ciclo TCA inverso completo non è stato realizzato nel lievito. Un rTCA parziale è stato realizzato in Saccharomyces cerevisiae per produrre acido succinico e acido malico. yan et al [5] hanno sovraespresso i geni che codificano i primi tre enzimi del ciclo Pyc2 e rTCA, Mdh3R, EcFumC e FrdS1, in ceppi Pdc e Fum1-deficienti, ottenendo una resa di acido succinico fino a 13 g/L con una resa di 0. 21 mol/mol.Malubhoy et al [ 5] hanno sintetizzato 35 g/L di acido butandiolico con una resa di 0,63 mol/mol di glicerolo attraverso la via del ciclo rTCA, mentre il processo ha anche ottenuto la fissazione netta di CO2.
2.2 Evitare la decarbossilazione non necessaria
La decarbossilazione biologica si verifica principalmente nelle vie cataboliche come la glicolisi, il PPP e il ciclo TCA, dove la reazione rilascia CO2 ed è spesso associata all'ossidazione per rigenerare NADH e NADPH. La decarbossilazione si verifica anche nelle vie dei metaboliti precursori dei prodotti finali, dove le reazioni di decarbossilazione nella via riducono tutte la resa di carbonio dal substrato al prodotto. Ad esempio, l'acetil coenzima A, un metabolita prodotto dalla reazione di decarbossilazione del piruvato, comporta una perdita di carbonio sotto forma di CO2, che riduce la resa teorica del prodotto di qualsiasi processo che coinvolga l'acetil coenzima A come precursore. Come il ciclo TCA, la biosintesi degli acidi grassi e degli aminoacidi. Per questo motivo, per ovviare alla perdita di carbonio nella sintesi dell'acetil coenzima A, i ricercatori hanno evitato l'inutile fase di decarbossilazione progettando nuove vie di conservazione del carbonio. Hellgren et al [6] hanno costruito una via ciclica di conservazione del carbonio (GATHCYC) basata sulla via della glicolisi non ossidativa (NOG), che genera tre molecole di acetil coenzima A da una molecola di fruttosio 6-fosfato (F6P) e la via non perde carbonio. L'uso di questa via ha portato a un aumento della produzione di acido 3-idrossipropionico di 109%. L'introduzione della via GATHCYC in un ceppo produttore di n-butanolo ha determinato un aumento della produzione di n-butanolo a 1,75 g/L e una riduzione delle emissioni di CO2 di 35,2%.

3. La produzione di acido succinico come esempio
Oltre all'equilibrio redox e alla ritenzione di carbonio, la fattibilità termodinamica e il bilancio energetico sono fattori chiave nella progettazione di vie metaboliche ottimali. La fattibilità termodinamica si riferisce alla variazione di energia libera di Gibbs (ΔrG'm) in condizioni standard fisiologicamente rilevanti e determina se una via metabolica è fattibile o meno. L'energia cellulare deve essere bilanciata per produrre una quantità maggiore del composto target, poiché i prodotti che richiedono energia comportano una perdita di carbonio nel substrato per soddisfare le richieste energetiche, mentre i prodotti ossidati comportano un eccesso di energia e possibilmente una dissipazione di calore. L'acido succinico (SA) è un metabolita intermedio del ciclo TCA. In questa sezione ci si concentra su diverse strategie per la produzione di SA e si valutano la stechiometria dell'ATP, il bilancio redox, la fissazione della CO2, la fattibilità termodinamica e la conservazione del carbonio per diversi percorsi di sintesi di SA naturali e ingegnerizzati. Esistono tre vie di sintesi per l'acido succinico: il ciclo ossidativo del TCA (oTCA), il ciclo ridotto del TCA (rTCA) e la via del gliossalato (GS). Il ciclo oTCA ha una resa massima teorica inferiore, ma la produzione di acido succinico in condizioni aerobiche ha il vantaggio di avere pochi sottoprodotti e caratteristiche metaboliche termodinamiche più favorevoli. Il gS è un metodo alternativo per la produzione di acido succinico che bypassa l'acido isocitrico e il coenzima butirrico per aggirare le due fasi di decarbossilazione tra l'acido isocitrico e il coenzima butirrico per evitare la perdita di carbonio e fornire NADH aggiuntivo. rTCA fissa la CO2 ed è due volte più efficiente del percorso oTCA. È importante notare che il tasso di rendimento (YP) è un parametro locale che considera solo la stechiometria netta nel percorso e non tiene conto della perdita di carbonio durante la rigenerazione di NAD(P)H o la generazione di ATP. Tuttavia, la resa massima teorica (YE) è un parametro globale che considera il bilancio degli elettroni e quindi tiene conto anche della rigenerazione di NAD(P)H. Pertanto, in alcuni casi, la YP può essere superiore alla YE. La sintesi del ciclo rTCA della SA viene effettuata principalmente dai batteri del rumine in condizioni anaerobiche. Al contrario, per il lievito, il ciclo rTCA è termodinamicamente sfavorevole e comporta un apporto inadeguato di NADH cellulare. La figura seguente confronta la variazione dell'energia libera di Gibbs della sintesi di SA attraverso il ciclo oTCA o il ciclo rTCA con diverse fonti di carbonio. Queste includono glucosio, glicerolo, xilosio attraverso il ciclo parziale CBB, l'assimilazione di acido formico o metanolo attraverso la via della glicina ridotta e l'assimilazione di metanolo attraverso la via del fosfato di xiloglucano. Figura 2. Produzione di acido succinico tramite il ramo ossidativo o riduttivo del ciclo TCA
La capacità del lievito di tollerare un pH più basso e quindi di ridurre il costo della produzione di SA durante la lavorazione a valle ha fatto sì che la produzione di SA da parte del lievito sia oggetto di grande attenzione, in particolare il ciclo rTCA che è in grado di fissare la CO2. Sebbene la sintesi di SA dal glucosio attraverso la glicolisi e la via del ciclo rTCA possa fissare 1 mol di CO2/mol di SA, la via non è bilanciata dal punto di vista redox e richiede 1 mol di NADH aggiuntiva per ogni 1 mol di SA prodotta. Un'alternativa interessante è l'utilizzo del glicerolo come fonte di carbonio, che può fissare 1 mol di CO2/mol di SA attraverso la via rTCA, consentendo una produzione di SA bilanciata dal punto di vista ossidativo. La riduzione totale γ = 3,5 per la combinazione glicerolo + CO2 è uguale a quella della SA. Malubhoy et al [5] hanno ottenuto una resa di 0,6 g/g di glicerolo fissando la CO2, pari a 47,1% del massimo teorico.
Un altro modo per raggiungere l'equilibrio redox è quello di utilizzare glucosio e CO2 come co-substrati. Se la glicolisi, il GATHCYC e i cicli parziali TCA sono utilizzati simultaneamente, l'equilibrio redox può essere raggiunto teoricamente, con 1 mole di SA che fissa 0,5 moli di CO2. tuttavia, 1 mole di SA richiede il consumo di 0,33 moli di ATP al costo di ATP rigenerato, ad esempio attraverso la respirazione di parte del glucosio. pertanto, questo scenario deve essere realizzato in condizioni almeno leggermente aerobiche, il che aggiunge un altro fattore di costo del processo.
Fig. 3 Produzione redox-neutrale di acido butandioico attraverso una combinazione di glicolisi, GATHCYC, ciclo TCA parziale e via del gliossilato Tabella 1 Confronto tra le vie naturali e ingegnerizzate per la sintesi di SA nel lievito

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