Metode spektrofotometri para nitrofenol menggunakan p-nitrofenol- α-rhamnoside (pNP- α-Rha) dan p-nitrofenol-β-D-glukopiranosida (pNP- β-Glu) sebagai substrat, untuk mendeteksi aktivitas enzim α-rhamnosidase dan β-glukosidase. Li Ping menggunakan metode spektrofotometer p-nitrofenol, dalam percobaan penambahan Aspergillus niger β-glukosidase ke dalam larutan p-nitrofenol -β-glukosida (pNPG) untuk hidrolisis enzimatik, dan nilai absorbansi diukur pada panjang gelombang ultraviolet 400 nm. Dan berdasarkan nilai absorbansi, mereka menghitung aktivitas enzim β-glukosidase. Metode ini memiliki spesifisitas substrat yang kuat, tetapi substrat standar mahal, dan aktivitas enzim naringinase untuk menghidrolisis glikosida dalam makanan tidak dapat ditentukan, sehingga metode ini tidak cocok untuk mendeteksi aktivitas enzim dalam persiapan naringinase skala besar industri.
Prinsip metode spektrofotometer Davis adalah bahwa naringin dapat terjadi reaksi reaksi kromogenik dengan dietilen glikol 90% dalam kondisi sedikit basa, dan produksi kalkon naringin kuning dapat dideteksi di bawah sinar ultraviolet dengan panjang gelombang 420 nm. Menurut nilai absorbansi yang diukur, jumlah naringin substrat yang tersisa dapat dihitung, dan kemudian aktivitas naringinase dapat diperoleh dengan perhitungan. Wang Weina et al. menggunakan metode Davis yang ditingkatkan, mengambil naringin sebagai substrat, dan menambahkan naringinase yang dihasilkan oleh fermentasi cair Aspergillus niger FFCC 848 untuk hidrolisis enzimatik. Absorbansi diukur di bawah sinar ultraviolet 420 nm, dan kemudian menghitung aktivitas enzim. Metode spektrofotometer Davis untuk mengukur aktivitas enzim ini sederhana dalam pengoperasiannya, memiliki kecepatan yang cepat, sehingga metode ini banyak digunakan dalam deteksi waktu nyata produksi naringinase dengan fermentasi dan aktivitas naringinase yang diimobilisasi.
1-2 Kromatografi cair kinerja tinggi
Prinsip kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) adalah bahwa HPLC dapat secara akurat menentukan dan menganalisis secara kuantitatif substrat naringin, produk perantara purunin dan produk akhir naringenin selama seluruh proses hidrolisis, dan kemudian menghitung aktivitas enzim. Chen Yuelong dan yang lainnya menggunakan HPLC untuk menentukan waktu retensi naringin, arbutin, myricetin dan produknya, dan mencapai pemisahan lengkap dengan resolusi lebih besar dari 1,5, dan secara efektif memantau efek naringinase pada beberapa glikosida dalam proses hidrolisis, pada saat yang sama, aktivitas enzim ditentukan secara akurat. Metode HPLC memiliki keunggulan akurasi yang tinggi dan dapat menghindari gangguan pengotor, tetapi dibandingkan dengan metode Davis, metode ini memiliki waktu deteksi yang lebih lama dan pengoperasian yang lebih rumit.
1-3 Metode penentuan yang lebih baik untuk aktivitas enzim naringinase
Menggunakan metode Davis yang telah disempurnakan: 0,8 mL 0,8 g-L-1 Larutan naringin yang dibuat dengan buffer pH 4,5 ditambahkan ke dalam sistem reaksi yang mengandung 40 mg naringinase amobil (atau 0,2 mL naringinase bebas). Tempatkan dalam penangas air bersuhu konstan 50℃ selama 30 menit. Ambil 0,1 mL larutan hidrolisis enzimatik reaksi dan tambahkan 5 mL dietilen glikol (fraksi volume 90%) dan 0,1 mL larutan NaOH (4 mol-L-1) dalam tabung, dan diamkan selama 10 menit setelah mencampurnya secara merata. Ukur absorbansi larutan campuran pada 420 nm.
Definisi aktivitas enzim naringinase (U): pada kondisi pH 4,5, 50℃, 1 unit aktivitas enzim adalah jumlah enzim yang dibutuhkan untuk mendegradasi 1 μg naringin per menit. Rasio aktivitas enzim (U-g-1 atau U-mL-1) didefinisikan sebagai: pada kondisi pH 4,5, 50 ℃, aktivitas enzim yang ditunjukkan oleh 1 g naringinase terimobilisasi (atau 1 mL naringinase bebas). Aktivitas enzim relatif dihitung menurut rumus berikut ini:
Penentuan kurva standar: konsentrasi massa larutan standar glikosida naringin yang disusun 0, 0,4, 0,8, 1,2, 1,6 g - L-1kemudian diambil 0,1 mL larutan untuk direaksikan dengan 5 mL dietilen glikol (90%, v/v) dan 0,1 mL larutan natrium hidroksida (4 mol-L-1). Setelah campuran tercampur rata dan didiamkan selama 10 menit, nilai serapan cahaya larutan campuran diukur pada 420 nm, dan kurva standar digambar sesuai dengan itu.
2. Persiapan larutan enzim naringinase
Aspergillus niger FFCC uv-11 yang disimpan pada suhu 4℃ dipindahkan ke media miring, dan spora matang diperoleh dengan kultur suhu konstan pada suhu 30℃ selama 96 jam. Kemudian, spora dicuci dengan garam normal steril dengan fraksi massa 0,9%. nilai absorbansi suspensi spora diukur pada 600 nm (nilai OD600), dengan garam steril nilai OD600 disesuaikan menjadi 0,200. Kemudian suspensi spora dengan fraksi volume inokulasi 10% dimasukkan ke dalam 100 mL media fermentasi (labu takar 250 mL), kaldu fermentasi yang diperoleh disentrifugasi pada suhu 4 °C dan kecepatan 6000 rpm.-1 selama 10 menit dalam sentrifus berpendingin. Kemudian melalui saringan hisap untuk mendapatkan cairan supernatan yang diperlukan cairan enzim naringin. Dinginkan pada suhu 4℃ untuk penggunaan selanjutnya.
Ambil 3,0 g kitosan, dengan 100 mL fraksi volume larutan asam asetat 2% dilarutkan untuk menyiapkan 0,3 g - L-1 Larutan koloid kitosan, disonikasi selama 20 menit untuk menghilangkan gelembung udara dan membiarkannya larut sepenuhnya. Larutan koloid kitosan disuntikkan setetes demi setetes dengan jarum ke dalam 0,5 g - L-1 Kondensat NaOH (1000 mL) untuk membentuk pelet yang halus. Diamkan pada suhu kamar selama 3 jam, dan pelet berulang kali dicuci dengan air suling hingga netral, dan air diserap oleh kertas saring untuk mendapatkan mikrosfer kitosan. 0,4 g mikrosfer kitosan ditimbang, 0,4 ml glutaraldehida dengan fraksi volume 6% ditambahkan, dan mikrosfer berulang kali dicuci dengan air suling hingga tidak ada glutaraldehida di permukaan mikrosfer setelah suhu dan getaran konstan pada suhu 25 ℃ 150 r-min-1 selama 2 jam. Mikrosfer kitosan yang telah diikat silang diperoleh dengan mengeringkan dengan kertas saring.
Dia mengatakan 0,4 g mikrosfer kitosan, tambahkan 0,4 mL nomor anggota kredit 6% glutaraldehida, pada 150 r - menit-1 Setelah 2 jam, dicuci berulang kali dengan air suling hingga permukaannya tidak mengandung pentil Dialdehida dan kertas saring dikeringkan untuk mendapatkan mikrosfer kitosan yang terikat silang. Ambil 4 mL larutan enzim naringinase, tambahkan ke 0,4 g mikrosfer kitosan ikatan silang, kocok pada suhu konstan 25 ℃, 150 r-min-1 selama 2 jam, dan letakkan di lemari es pada suhu 4 ℃ untuk adsorpsi Kopling selama 4 jam. Bilas larutan enzim sisa pada permukaan pembawa dengan buffer pH 4,5, serap air pada kertas saring untuk mendapatkan naringinase yang tidak dapat bergerak, dan simpan di lemari es pada suhu 4 ℃ untuk digunakan nanti.
4. Pembuatan mikrosfer kitosan berbasis silikon magnetik (MSC)
Proses persiapan nanopartikel berbasis silikon magnetik (MS) ditunjukkan pada Gambar 1.
Gambar 1 Diagram skematik persiapan nanopartikel berbasis silikon magnetik
(1) Pertama, magnetik Fe3O4 nanopartikel yang dimodifikasi dengan asam sitrat dibuat dengan metode ko-presipitasi kimia, dan prosedur percobaan yang terdiri dari: 2,25 g FeCl3-6H2O dan 1,61 g FeSO4-7H2O ditambahkan ke dalam labu leher tiga yang diisi dengan 100 mL air deionisasi, suhu sistem dipanaskan hingga 85 ℃ dalam kondisi gas nitrogen. Aduk di bawah 1000 r-min-1 dan dengan cepat menuangkan 10 mL air amonia pekat. Setelah larutan menjadi hitam, tambahkan 153 mg natrium sitrat. Setelah 30 menit reaksi, pisahkan hasil produksi dengan magnet, dan cuci fase padat dengan air deionisasi dan etanol beberapa kali. Fe3O4 nanopartikel yang diperoleh dikeringkan untuk digunakan nanti.
(2) Kemudian, nanopartikel berbasis silikon magnetik (MS) disiapkan dengan metode sol-gel, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1. Langkah-langkah percobaan meliputi: 0,1 g Fe3O4 nanopartikel didispersikan secara seragam ke dalam larutan campuran yang mengandung 40 mL etanol anhidrat, 10 mL air suling, dan 1,2 mL air amonia pekat. Di bawah kondisi pengadukan 300 r-min-1tetesan larutan yang mengandung Fe3O4 nanopartikel ditambahkan ke TEOS (0,4 mL) yang didispersikan dalam 30 mL etanol anhidrat, dan reaksi nanopartikel berbasis silikon dilakukan selama 12 jam di bawah suhu kamar. Produk dicuci dengan etanol anhidrat dan air suling beberapa kali untuk mendapatkan nanopartikel berbasis silika magnetik (MS), yang dikeringkan untuk digunakan kemudian.
Mikrosfer MSC dibuat dengan metode ikatan silang emulsi, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2. Langkah-langkah percobaan yang dilakukan meliputi: 0,125 g nanopartikel silika magnetik (MS) didispersikan secara merata ke dalam 10 mL larutan kitosan dengan fraksi massa 2,5% yang dibuat dengan cara melarutkan kitosan ke dalam larutan asam asetat dengan fraksi volume 5,0%, lalu menambahkan larutan kitosan ke dalam emulsi yang mengandung 60 mL lilin parafin cair dan 1,8 mL twin 80 tetes demi tetes. Setelah diaduk selama 30 menit pada kondisi penangas air 40℃ dan 800 r-min-1Tambahkan 2,0 mL glutaraldehida dan bereaksi 1 jam. Kemudian pH sistem disesuaikan menjadi 9,0 dengan 1 mol-L-1 NaOH, dan reaksi dilanjutkan selama 1 jam. Produk dicuci dengan petroleum eter, etanol, dan air suling beberapa kali untuk mendapatkan mikrosfer MSC, yang dikeringkan dalam ruang hampa udara untuk digunakan kemudian.
Gambar 2 Diagram skematik persiapan mikrosfer kitosan berbasis silikon magnetik
5. Pembuatan mikrosfer kitosan berbasis silikon magnetik berbasis epoksi (MSCE)
0,5 g mikrosfer MSC kering yang dibuat dengan metode 4 ditimbang dan ditambahkan ke dalam labu takar 50 mL. Kemudian 2,0 mL larutan NaOH, larutan epiklorohidrin, dan NaBH4 Larutan ditambahkan ke dalam labu dengan konsentrasi tertentu, masing-masing. Dan reaksi dilakukan dengan osilasi suhu konstan selama waktu tertentu. Mekanisme reaksi pembuatan MSCE ditunjukkan pada Gambar 3.
Gambar 3 Prinsip persiapan mikrosfer kitosan berbasis silikon magnetik berbasis epoksi
Setelah aktivasi, mikrosfer yang telah diaktivasi dicuci berulang kali dengan air suling hingga tidak ada gugus OH dan epoksi bebas di permukaan untuk mendapatkan mikrosfer kitosan berbasis silikon magnetik berbasis epoksi (MSCE). Metode pendeteksiannya adalah sebagai berikut: ambil 3,0 mL supernatan pencucian dan tambahkan 1~2 tetes fenolftalein. Setelah dikocok, jika tidak berubah menjadi merah, itu berarti tidak ada OH- bebas dengan MSCE; ambil 3,0 mL supernatan pencuci dan tambahkan 3,0 mL 1,3 mol-L-1 natrium tiosulfat dan 1 ~ 2 tetes fenolftalein, jika larutan tidak berubah menjadi merah setelah dikocok, berarti tidak ada gugus epoksi bebas dengan MSCE. Persamaan reaksi deteksi gugus epoksi adalah sebagai berikut:
6 Persiapan enzim naringinase terimobilisasi MSCE
5,0 g MSCE yang disiapkan dengan metode 5 ditambahkan ke dalam 50 mL larutan enzim naringinase dengan pH tertentu, dan reaksi diinkubasi dalam penangas air bersuhu konstan, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4. Setelah reaksi, mikrosfer dicuci dengan larutan penyangga beberapa kali hingga tidak ada naringinase bebas yang ditemukan pada permukaan mikrosfer. Mikrosfer dikeringkan dengan corong Brinella untuk mendapatkan enzim naringinase terimobilisasi MSCE, yang didinginkan pada suhu 4 ℃ untuk digunakan nanti.
Gambar 4 Prinsip persiapan enzim naringinase terimobilisasi MSCE
Hubungi Kami Sekarang!
Jika Anda membutuhkan Harga, silakan isi informasi kontak Anda di formulir di bawah ini, kami biasanya akan menghubungi Anda dalam waktu 24 jam. Anda juga bisa mengirim email kepada saya info@longchangchemical.com selama jam kerja (8:30 pagi hingga 6:00 sore UTC+8 Senin-Sabtu) atau gunakan obrolan langsung situs web untuk mendapatkan balasan secepatnya.
