碳效率是决定途径过程可行性的主要因素之一，也是决定单位底物生成物速率的主要因素。决定碳效率的因素有两个：一是从底物到产物的电子平衡，这可以通过底物和产物的还原程度计算出来；二是现有代谢途径的设计主要是为了提高反应速率而不是高碳产量。第一个因素与底物和产物的化学成分密切相关。第二个因素可以通过重新设计代谢途径来克服，这样可以保留底物中的碳，或者在某些情况下，在生成物形成过程中同化底物中的碳。

1.中的氧化还原平衡 酵母 新陈代谢 高效生物生产化学品所需的代谢途径的效率取决于多种因素，如氧化还原平衡、能量平衡、热力学可行性、化学计量平衡、通量耦合、反馈抑制、产物毒性、动力学等。细胞代谢通过将电子从底物转移到不同的代谢产物来维持细胞生长和氧化还原平衡。因此，生产所需代谢物的最佳生物合成途径应该是氧化还原中性的，途径产率（YP）应该达到或非常接近底物-目标产物组合的最大理论产率（YE）。YP 取决于所涉及的途径，并根据其化学计量学来确定，而 YE 则是底物可生成的最大产物量，可根据底物与产物之比 γS/γP 计算得出，其中 γS 和 γP 分别是底物和产物的还原度。还原度可定义为化合物中每个碳原子的可用电子当量数。因此，YE 需要考虑将底物转化为产物时的电子平衡，这可能需要脱羧以导致碳损失，或羧化以提供额外的碳吸收。下图描述了酵母的中心代谢途径。图 1. 酵母菌中心碳代谢途径，突出显示了羧化/脱羧步骤与底物和产物还原程度变化之间的关系。相应底物、中间代谢产物和产物的还原程度由红色（γ=0）到黄色（γ=4）再到蓝色（γ=6）的颜色变化表示。
根据底物和目标产物的还原度，可以分为三种情况：当底物和目标产物的还原度相同时，存在底物完全转化为产物的理想情况。也就是说，实际产物产量可以接近最大理论产量（YE），但代谢过程中会产生用于形成生物质和维持细胞生长的副产物，从而降低产物产量。例如，乳酸（γ = 4.0）的还原程度与葡萄糖（γ = 4.0）相同。因此，乳酸的生成过程是一个氧化还原中性途径，具有平衡的化学计量学，同时允许产生 ATP，从而使速率接近最大理论产量。总之，对于其他底物-产物，很少能找到这种不会产生过多还原力的途径。
当产物的还原性高于底物时，形成产物所需的氧化反应会产生额外的氧化当量（NAD+、NADP+、FADH+）。为了减少这些氧化当量，细胞需要将碳氧化成二氧化碳和/或其他副产物（例如，在磷酸戊糖途径（PPP）、TCA 循环或磷酸木糖（XuMP）循环中），以维持氧化还原平衡。这一过程可能会影响底物转化为目标产物的整体效率。例如脂肪酸、乙醇和甘油。
Yu 等人[1]通过构建一条同化还原代谢途径，成功地将酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的脂肪酸产量提高到 40%，该途径的特点是通过重复脱羧循环为细胞提供额外的 NADH、NADPH 和 ATP。
由于需要提供 NADH，从葡萄糖生产乙醇也会将一些底物氧化成 CO2 和甘油。然而，酵母发酵乙醇的天然途径保留了葡萄糖的还原程度（γ = 4.0），当二氧化碳和乙醇成为最终产物时，总体平均还原程度为 γ = 4.0。同样，当酿酒酵母使用甘油（γ=4.66）作为唯一碳源生产 1,2-丙二醇（1,2-PDO）（γ=5.33）时，代谢工程改造提供了额外的 NADH 以促进 1,2-PDO 的合成，实现了迄今为止在酵母中最高的产量，大于 4 克/升 1,2-PDO。
当产物的还原度低于底物时，在生成产物的过程中会产生还原当量和产物。过量还原当量的常见再氧化机制是通过呼吸链进行氧化，产生过量的 ATP 和/或释放热量。因此，产物产量低于可用电子所能达到的理论最高产量。另外，多余的还原当量可以通过将部分碳源还原成还原副产物来消耗。这种底物-产物组合具有固定碳的潜力，从而提高目标代谢物的产量。正如从葡萄糖生产柠檬酸（γ = 3.0）一样，由于 NADH 的形成而产生的能量溢出意味着细胞可以通过制造目标化合物简单地获得能量，但代价是产量损失。因此，合成柠檬酸的天然生化途径效率较低，这为实现接近固定碳的最大理论增益率提供了机会。
因此，可以根据γS和γP来选择用于所需产品的底物，从而最大限度地提高产量。酵母的首选底物葡萄糖可用于合成与葡萄糖具有相同 γ 的产品，如乙醇（加 CO2）或乳酸。虽然葡萄糖是首选底物，但葡萄糖与食品或饲料生产直接竞争。因此，甘油、甲醇和二氧化碳等几种更便宜的碳源被认为是有前途的底物。
甲醇（γ = 6.0）是一种具有高度还原性的 C1 原料。使用甲醇作为碳源的主要优势之一是它的还原能力，在微生物（如甲基营养酵母）中，它能形成 NADH 并产生 ATP。然而，由于该途径的第一个反应是使用氧作为电子受体将甲醇氧化为甲醛，因此酵母每吸收一份甲醇就会损失一份 NADH。最近的研究表明，通过在酒精氧化酶缺陷菌株（Mut-）中过量表达内源甲醇脱氢酶（Adh2），Komagataella phaffii 能够更有效地利用甲醇，从而使每份甲醇产生更多的 NADH 和 ATP。
另一种有前景的碳源是二氧化碳，它是一种高度氧化的化合物（γ=0），可被自养生物还原，产生用于生物合成的有机化合物。因此，将二氧化碳引入酵母新陈代谢的一种方法是共底物转化，即将二氧化碳与另一种碳源一起转化为还原程度低于共底物的产物。在柠檬酸、马来酸和琥珀酸等γ值低于葡萄糖的有机酸的生物合成过程中，这种策略可将二氧化碳纳入工业发酵过程，以提高碳产量。

2.如何平衡产物减少的程度？微生物代谢过程的进化通常是基于细胞的快速生长，而不是特定产物的生产。因此，细胞更倾向于快速新陈代谢而不是高产碳。因此，细胞在新陈代谢过程中提高碳保留能力是代谢工程中最大的挑战之一，这阻碍了微生物工厂实现高产化学品生产。2.1 以 CO2 为底物将无机碳纳入细胞代谢 有不同的途径：CO2 分子通过羧化作用形成有机化合物；CO2 通过还原作用转化为甲酸或 CO，并被生物质同化。羧化反应由羧化酶催化，如自养 CO2 固定途径 CBB 循环中的 RuBisCO 或参与提供中心代谢前体的途径酶 Pck 和 Pyc。碳还原原理是 CO2 被甲酸脱氢酶或 CO 脱氢酶还原成甲酸或 CO，如还原乙酰辅酶 A 途径中的还原乙酰辅酶 A。.1.1 异源 CBBase 酶在酵母中固定 CO2 的表达在 S. cerevisiae 生产乙醇的过程中，Guadalupe-Medina 等人[2]利用 CO2 作为电子受体来利用过剩的还原力，即、Xia 等人[3 ]发现，当使用木糖作为乙醇生产的底物时，厌氧发酵过程中会出现氧化还原失衡。Gassler 等[4] 在甲基营养酵母 K. phaffii 中构建了一个功能性 CBB 循环，该循环通过甲醇提供能量和还原力，并以 CO2 为碳源生产乳酸和丙二酸。
还原甘氨酸途径被认为是利用甲酸进行有氧生长的最有效途径。原甘氨酸途径的所有酶都存在于麦角菌中，但它不能利用甲酸作为底物进行生长。过量表达内源途径酶可导致还原甘氨酸途径的功能性表达，该途径允许从甲酸和 CO2 作为辅助底物合成甘氨酸，以维持缺乏甘氨酸的菌株的生长。该途径依赖于高浓度的二氧化碳（10%）。最近，在 K. phaffii 中发现了一种天然抗氧还原甘氨酸途径，但这种途径的天然活性不足以支持细胞生长。
2.1.3 TCA 循环的简化分支（rTCA）
还原 TCA 循环（rTCA）是原核生物中的一种二氧化碳固定途径。rTCA 是氧化 TCA 循环的逆过程，通过固定两个二氧化碳分子形成一个乙酰辅酶 A 分子。迄今为止，酵母中还没有实现完整的反向 TCA 循环。Yan等人[5]在Pdc和Fum1缺陷菌株中过表达了编码Pyc2和rTCA循环前三个酶Mdh3R、EcFumC和FrdS1的基因，结果琥珀酸产量高达13克/升，产率为0.Malubhoy 等人[ 5] 通过 rTCA 循环途径合成了 35 克/升的丁二酸，甘油产量为 0.63 摩尔/摩尔，同时该过程还实现了二氧化碳的净固定。
2.2 避免不必要的脱羧反应
生物脱羧主要发生在糖酵解、PPP 和 TCA 循环等分解代谢途径中，在这些途径中，脱羧反应释放出 CO2，并通常与氧化反应相关，以再生 NADH 和 NADPH。脱羧反应也发生在终产物前体代谢物途径中，途径中的脱羧反应都会降低从底物到产物的碳产量。例如，丙酮酸脱羧反应产生的代谢物乙酰辅酶 A 会导致二氧化碳形式的碳损失 33%，这就降低了任何以乙酰辅酶 A 为前体的过程的理论产物产量。例如 TCA 循环、脂肪酸和氨基酸的生物合成。因此，为了克服乙酰辅酶 A 合成过程中的碳损失，研究人员通过设计新的碳保留途径来避免不必要的脱羧步骤。Hellgren 等人[6] 在非氧化性糖酵解途径（NOG）的基础上构建了一种循环碳保留途径（GATHCYC），该途径可从一分子 6-磷酸果糖（F6P）生成三分子乙酰辅酶 A，且该途径不会损失碳。使用该途径后，3-羟基丙酸的产量增加了 109%。在正丁醇生产菌株中引入 GATHCYC 途径后，正丁醇产量增加到 1.75 克/升，二氧化碳排放量减少了 35.2%。

3.以生产丁二酸为例
除了氧化还原平衡和碳保留外，热力学可行性和能量平衡也是设计最佳代谢途径的关键因素。热力学可行性是指在生理相关标准条件下的吉布斯自由能变化（ΔrG'm），它决定了代谢途径是否可行。细胞能量也应保持平衡，以产生更多的目标化合物，因为需能产物会导致底物碳损失以满足能量需求，而氧化产物则会导致能量过剩，并可能导致散热。琥珀酸（SA）是 TCA 循环的中间代谢产物。本节重点讨论生产琥珀酸的不同策略，并对不同的天然和工程琥珀酸合成途径的 ATP 化学计量、氧化还原平衡、二氧化碳固定、热力学可行性和碳保护进行评估。琥珀酸有三种合成途径：氧化型 TCA 循环（oTCA）、还原型 TCA 循环（rTCA）和乙醛酸途径（GS）。oTCA 循环的理论最高产量较低，但在有氧条件下生产琥珀酸具有副产品少和热力学代谢属性更有利的优势。gS 是生产琥珀酸的另一种方法，它绕过了异柠檬酸和丁酰辅酶 A 之间的两个脱羧步骤，以防止碳损失并提供额外的 NADH。rTCA 可固定 CO2，效率是 oTCA 途径的两倍。需要注意的是，产率（YP）是一个局部参数，它只考虑了途径中的净化学计量，而没有考虑 NAD(P)H 再生或 ATP 生成过程中的碳损失。然而，最大理论产量（YE）是一个全局参数，它考虑了电子平衡，因此也考虑了 NAD(P)H 的再生。因此，在某些情况下，YP 可能高于 YE。SA 的 rTCA 循环合成主要由瘤胃细菌在厌氧条件下进行。相反，对于酵母来说，rTCA 循环在热力学上是不利的，会导致细胞 NADH 供应不足。下图比较了不同碳源下通过 oTCA 循环或 rTCA 循环合成 SA 的吉布斯自由能变化。其中包括葡萄糖、甘油、通过部分 CBB 循环的木糖、通过还原甘氨酸途径同化甲酸或甲醇以及通过木糖磷酸途径同化甲醇。图 2.利用 TCA 循环的氧化或还原分支产生琥珀酸
酵母能够耐受较低的 pH 值，从而在下游加工过程中降低 SA 的生产成本，这使得酵母生产 SA 引起了广泛关注，尤其是能够固定 CO2 的 rTCA 循环。虽然通过糖酵解和 rTCA 循环途径从葡萄糖合成 SA 可以固定 1 摩尔 CO2/摩尔 SA，但该途径不能实现氧化还原平衡，每生产 1 摩尔 SA 需要额外的 1 摩尔 NADH。甘油 + CO2 组合的总还原量 γ = 3.5 与 SA 的还原量相同。Malubhoy 等人[5]通过固定 CO2 获得了 0.6 克/克甘油的产量，是理论最大值的 47.1%。
实现氧化还原平衡的另一种方法是利用葡萄糖和二氧化碳作为共底物。如果同时利用糖酵解、GATHCYC 和部分 TCA 循环，理论上可以实现氧化还原平衡，1 摩尔 SA 可以固定 0.5 摩尔 CO2。然而，1 摩尔 SA 需要消耗 0.33 摩尔 ATP，而 ATP 的再生需要付出代价，例如通过部分葡萄糖的呼吸作用。
图 3 通过糖酵解、GATHCYC、部分 TCA 循环和乙醛酸途径的组合，以氧化还原中性方式生产丁二酸 表 1 酵母菌合成 SA 的天然途径和工程途径比较

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