Karbon verimliliği, bir yol sürecinin uygulanabilirliğini tanımlayan ana faktörlerden biridir ve birim substrat başına ürün oranının ana belirleyicisidir. Karbon verimliliğini iki faktör belirler: substrat ve ürünün indirgenme derecesinden hesaplanabilen substrattan ürüne elektron dengesi ve mevcut metabolik yolların öncelikle yüksek karbon veriminden ziyade daha yüksek reaksiyon hızları için tasarlanmış olması. İlk faktör, substrat ve ürünün kimyasal bileşimi ile yakından ilgilidir. İkinci faktör, substratın karbonunun tutulmasına veya bazı durumlarda ürün oluşumu sırasında asimile edilmesine olanak tanıyan metabolik yolun yeniden tasarlanmasıyla aşılabilir.
1. Redoks dengesi maya Metabolizma Kimyasalların verimli biyolojik üretimi için gerekli olan metabolik yolların etkinliği redoks dengesi, enerji dengesi, termodinamik fizibilite, stokiyometrik denge, akı bağlanması, geri besleme inhibisyonu, ürün toksisitesi, kinetik ve benzeri gibi çeşitli faktörlere bağlıdır. Hücresel metabolizma, elektronları substratlardan farklı metabolitlere aktararak hücre büyümesini ve redoks dengesini korur. Bu nedenle, istenen bir metabolitin üretimi için en uygun biyosentetik yol redoks-nötr olmalı ve yol verimi (YP) substrat-hedef ürün kombinasyonunun maksimum teorik veriminde (YE) veya buna çok yakın olmalıdır.YP, ilgili yola bağlıdır ve stokiyometrisine göre belirlenir; YE ise substrattan oluşabilecek maksimum ürün miktarıdır ve γS ve γP'nin sırasıyla substrat ve ürünün indirgenme derecesi olduğu γS/γP substrat/ürün oranından hesaplanabilir. İndirgeme derecesi, bileşiğin karbon atomu başına mevcut elektron eşdeğerlerinin sayısı olarak tanımlanabilir. Bu nedenle YE, bir substratın bir ürüne dönüştürülmesi için elektron dengesini dikkate almalıdır; bu da karbon kaybına yol açan dekarboksilasyon veya ek karbon alımı sağlamak için karboksilasyon gerektirebilir. Aşağıdaki şekil maya merkezi metabolik yolunu göstermektedir. Şekil 1. Maya merkezi karbon metabolik yolu, karboksilasyon/dekarboksilasyon adımları ile substrat ve ürün indirgeme derecesindeki değişiklikler arasındaki ilişkiyi vurgulamaktadır. İlgili substratların, ara metabolitlerin ve ürünlerin indirgenme derecesi kırmızıdan (γ=0) sarıya (γ=4) ve maviye (γ=6) renk değişimi ile gösterilmektedir.
Substrat ve hedef ürünün indirgenme derecesine göre, üç duruma ayrılabilir: substrat ve hedef ürün aynı indirgenme derecesine sahip olduğunda, substratın tamamen ürüne dönüştürüldüğü ideal bir durum vardır. Yani, gerçek ürün verimi maksimum teorik verime (YE) yakın olabilir, ancak metabolik süreç biyokütle oluşumu ve hücre büyümesinin sürdürülmesi için yan ürünler üretecek ve bu da ürün verimini azaltacaktır. Glikozla (γ = 4.0) aynı indirgenme derecesine sahip olan laktik asit (γ = 4.0) buna bir örnektir. Bu nedenle, laktat üretim süreci, dengeli bir stokiyometriye sahip redoks-nötr bir yoldur ve ATP üretimine izin verir, bu da maksimum teorik verime yakın bir oranla sonuçlanır. Genel olarak, diğer substrat-ürünler için, aşırı indirgeme gücü üretmeyen bu tür yollar bulmak nadirdir.
Ürün substrattan daha fazla indirgendiğinde, ürünü oluşturmak için gereken oksidasyon reaksiyonları ek oksidatif eşdeğerler (NAD+, NADP+, FADH+) üretir. Bu oksidatif eşdeğerleri azaltmak için hücrenin redoks homeostazını korumak amacıyla karbonu CO2'ye ve/veya diğer yan ürünlere (örneğin pentoz fosfat yolunda (PPP), TCA döngüsünde veya ksilüloz fosfat (XuMP) döngüsünde) oksitlemesi gerekir. Bu süreç, hedef ürünlere substrat dönüşümünün genel verimliliğini etkileyebilir. Örnekler arasında yağ asitleri, etanol ve gliserol bulunur.
Palmitik asit (γ = 5.75) gibi yağ asitleri üretmek için substrat olarak glukoz kullanımı, yüksek NADPH gereksinimleri ve karbon zinciri uzaması sırasında substrat kaybına yol açan CO2 salınımı nedeniyle yağ asidi verimini azaltır.Yu ve arkadaşları [1], hücreye ek NADH, NADPH ve ATP sağlamak için tekrarlayan bir dekarboksilasyon döngüsü ile karakterize edilen bir anabolik indirgeyici metabolik yol oluşturarak Saccharomyces cerevisiae'de yağ asidi verimini 40%'ye kadar artırmayı başardılar.
Glikozdan etanol üretimi, NADH sağlama ihtiyacı nedeniyle bazı substratları CO2 ve gliserole de okside eder. Bununla birlikte, etanolü fermente etmek için doğal maya yolu, CO2 ve etanol nihai ürünler olduğunda genel ortalama γ = 4.0 azalma ile glikozun indirgenme derecesini (γ = 4.0) korur, bu nedenle metabolik yol, karbon kaynağının sadece 4-5%'sini gliserole dönüştürerek verim açısından çok verimlidir. Benzer şekilde, 1,2-propandiol (1,2-PDO) (γ=5.33) bira mayası tarafından tek karbon kaynağı olarak gliserol (γ=4.66) kullanılarak üretildiğinde, metabolik mühendislik modifikasyonu 1,2-PDO sentezini kolaylaştırmak için ek NADH sağlamış ve mayada bugüne kadarki en yüksek >4 g/L 1,2-PDO verimine ulaşılmıştır.
Ürün substratın altına indirgendiğinde, ürünün üretimi sırasında hem indirgeyici eşdeğerler hem de ürün üretilir. Fazla indirgeyici eşdeğerlerin yeniden oksitlenmesi için yaygın bir mekanizma, solunum zinciri tarafından oksidasyon yoluyla fazla ATP üretilmesi ve/veya ısı açığa çıkarılmasıdır. Sonuç olarak, ürün verimi mevcut elektronlarla elde edilebilecek teorik maksimumun altındadır. Alternatif olarak, fazla indirgeyici eşdeğerler, karbon kaynağının bir kısmının indirgeyici yan ürünlere indirgenmesiyle tüketilebilir. Bu substrat-ürün kombinasyonu, hedef metabolitin verimini artırmak için karbonu sabitleme potansiyeline sahiptir. Glikozdan sitrik asit (γ = 3.0) üretiminde olduğu gibi, NADH oluşumuna bağlı enerji yayılımı, hücrenin verim kaybı pahasına hedef bileşiği yaparak enerji kazanabileceği anlamına gelir. Bu nedenle sitrik asit sentezi için doğal biyokimyasal yolun zayıf verimliliği, karbon sabitleyerek elde edilebilecek maksimum teorik kazanç oranına yakın bir oran elde etme fırsatını temsil eder.
Bu nedenle, istenen üründe kullanılacak substratlar, verimi en üst düzeye çıkaran γS ve γP'ye göre seçilebilir. Maya için tercih edilen substrat olan glukoz, etanol (artı CO2) veya laktik asit gibi glukozla aynı γ değerine sahip ürünleri sentezlemek için kullanılabilir. Glikoz tercih edilen substrat olmasına rağmen, glikoz doğrudan gıda veya yem üretimi ile rekabet eder. Bu nedenle, gliserol, metanol ve CO2 gibi daha ucuz karbon kaynakları umut verici substratlar olarak kabul edilmektedir.
Metanol (γ = 6.0) yüksek derecede indirgeme özelliğine sahip bir C1 hammaddesidir. Metanolün karbon kaynağı olarak kullanılmasının temel avantajlarından biri, metilotrofik maya gibi mikroorganizmalarda NADH oluşturan ve ATP üreten indirgeme gücüdür. Ancak, yolun ilk reaksiyonu elektron alıcısı olarak oksijen kullanılarak metanolün formaldehide oksidasyonu olduğundan, maya alınan her bir porsiyon metanol için bir NADH kaybeder.Son çalışmalar, Komagataella phaffii'nin alkol oksidaz eksikliği olan bir suşta (Mut-) endojen metanol dehidrojenazı (Adh2) aşırı eksprese ederek metanolü daha verimli bir şekilde kullanabildiğini ve bunun da metanolün her bir porsiyonu için ek NADH ve ATP üretimiyle sonuçlandığını göstermiştir. bu, Mut-Adh2 suşunun düşük oksijen tüketimi ve ısı emisyonu koşulları altında heterolog proteinlerin üretim yoğunluğunu artırmasına izin vermiştir.
Gelecek vaat eden bir diğer karbon kaynağı, biyosentez için organik bileşikler üretmek üzere ototroflar tarafından indirgenebilen yüksek oranda oksitlenmiş bir bileşik (γ=0) olan CO2'dir. Bu nedenle, CO2'yi maya metabolizmasına sokmanın bir yolu, CO2'yi başka bir karbon kaynağıyla birlikte ortak substrattan daha düşük bir indirgeme derecesine sahip bir ürüne dönüştüren ortak substrat dönüşümüdür. Sitrik, maleik ve süksinik asitler gibi glikozdan daha düşük γ değerine sahip organik asitlerin biyosentezinde bu strateji, karbon verimini artırmak için CO2'nin endüstriyel fermantasyon süreçlerine dahil edilmesini sağlar.
2. Ürün azaltma derecesi nasıl dengelenir? Mikroorganizmalarda metabolik süreçlerin evrimi genellikle belirli ürünlerin üretiminden ziyade hücrelerin hızlı büyümesine dayanır. Bu nedenle, hücre yüksek karbon verimi yerine hızlı metabolizmayı tercih eder. Bu nedenle, hücrelerin metabolizma sırasında karbon tutmayı iyileştirme yeteneği, mikrobiyal fabrikaların yüksek verimli kimyasal üretime ulaşmasını engelleyen metabolik mühendislikteki en büyük zorluklardan biridir. Bu makale, CO2 fiksasyonu da dahil olmak üzere karbon tutmayı en üst düzeye çıkarmayı ve hücrede gerekli olmayan dekarboksilasyon adımlarından kaçınmayı amaçlayan mayanın metabolik mühendisliğini tartışmaktadır.2.1 İnorganik karbonun CO2'yi bir substrat olarak kullanarak hücresel metabolizmaya entegrasyonu Farklı yollar vardır: bir CO2 molekülü karboksilasyon yoluyla organik bileşikler oluşturur; CO2, indirgeme yoluyla biyokütleye asimile edilebilen formik asit veya CO'ya dönüştürülür. Karboksilasyon reaksiyonları, ototrofik CO2 fiksasyon yolunun CBB döngüsündeki RuBisCO veya merkezi metabolik öncüllerin sağlanmasında rol oynayan Pck ve Pyc yol enzimleri gibi karboksilazlar tarafından katalize edilir. Karbon indirgeme prensibi, CO2'nin indirgenmiş asetil koenzim A yolunda olduğu gibi format dehidrojenaz veya CO dehidrojenaz tarafından formik asit veya CO'ya indirgenmesidir.2.1.1 Mayada CO2 Fiksasyonu için Heterolog CBBaz Enzimlerinin İfadesi S. cerevisiae'de Etanol Üretimi S. cerevisiae etanol üretiminde, Guadalupe-Medina ve arkadaşları [2] fazla indirgeme gücünü kullanmak için CO2'yi bir elektron alıcısı olarak kullanmıştır, örn, CO2'nin CBB döngüsü yolu enzimleri RuBisCO ve Prk tarafından PPP yolu ara metaboliti Ru5P'ye dönüştürülmesi, etanol üretiminde 10%'lik bir artış ve yan ürün olarak gliserol üretiminde 90%'lik bir azalma ile sonuçlanmıştır.Xia ve arkadaşları [3 ] etanol üretimi için substrat olarak ksiloz kullanıldığında anaerobik fermantasyon sırasında bir redoks dengesizliği bulmuşlardır. RrRuBisCO ve SoPRK'nın ekspresyonu piruvat dekarboksilasyonundan CO2'nin yeniden kullanılmasını sağlamış ve yan ürünler olan ksilitol ve gliserol verimini azaltmıştır.Gassler ve arkadaşları [4] metilotrofik maya K. phaffii'de metanol yoluyla enerji ve indirgeme gücü sağlayan ve karbon kaynağı olarak CO2 kullanarak laktik asit ve malonat üreten işlevsel bir CBB döngüsü oluşturmuştur.2.1.2 İndirgeme Glisin yolu
İndirgeyici glisin yolunun, formik asit kullanarak aerobik büyüme için en verimli yol olduğu düşünülmektedir. Pro-glisin yolunun tüm enzimleri S. cerevisiae'de mevcuttur, ancak formik asidi büyüme için bir substrat olarak kullanamaz. Endojen yol enzimlerinin aşırı ekspresyonu, glisin eksikliği olan suşların büyümesini sürdürmek için bir yardımcı substrat olarak formik asit ve CO2'den glisin sentezine izin veren indirgenmiş glisin yolunun fonksiyonel ekspresyonu ile sonuçlanmıştır. Bu yol, yüksek CO2 konsantrasyonlarına bağımlıdır (10%). Yakın zamanda, K. phaffii'de doğal olarak oksijene dirençli bir indirgenmiş glisin yolu tanımlanmıştır, ancak bu yolun doğal aktivitesi hücre büyümesini desteklemek için yeterli değildir.
2.1.3 TCA döngüsünün indirgenmiş dalı (rTCA)
İndirgenmiş TCA döngüsü (rTCA) prokaryotlarda bulunan bir CO2 sabitleme yoludur. rTCA, oksitlenmiş TCA döngüsünün ters işlemidir ve iki CO2 molekülünü sabitleyerek bir asetil koenzim A molekülü oluşturur. Şimdiye kadar, tam ters TCA döngüsü mayada gerçekleştirilmemiştir. Saccharomyces cerevisiae'de süksinik asit ve malik asit üretmek için kısmi rTCA gerçekleştirilmiştir. yan ve arkadaşları [5] Pyc2 ve rTCA döngüsünün ilk üç enzimi olan Mdh3R, EcFumC ve FrdS1'i kodlayan genleri Pdc ve Fum1 eksikliği olan suşlarda aşırı eksprese etmiş, bu da 0 verimle 13 g/L'ye kadar süksinik asit verimiyle sonuçlanmıştır.21 mol/mol. malubhoy ve arkadaşları [ 5] rTCA döngüsü yolu ile 0,63 mol/mol gliserol veriminde 35 g/L bütandioik asit sentezlerken, süreç aynı zamanda net CO2 fiksasyonu da sağlamıştır.
2.2 Gereksiz dekarboksilasyondan kaçınma
Biyolojik dekarboksilasyon öncelikle glikoliz, PPP ve TCA döngüsü gibi katabolik yollarda meydana gelir, burada reaksiyon CO2 açığa çıkarır ve genellikle NADH ve NADPH'yi yeniden oluşturmak için oksidasyonla ilişkilendirilir. dekarboksilasyon ayrıca son ürün öncül metabolit yollarında da meydana gelir, burada yoldaki dekarboksilasyon reaksiyonlarının tümü substrattan ürüne karbon verimini azaltır. Örneğin, piruvatın dekarboksilasyon reaksiyonu ile üretilen bir metabolit olan asetil koenzim A, CO2 şeklinde 33% karbon kaybına neden olur, bu da asetil koenzim A'yı öncül olarak içeren herhangi bir işlemin teorik ürün verimini azaltır. TCA döngüsü, yağ asidi ve amino asit biyosentezi gibi. Bu nedenle, asetil koenzim A sentezindeki karbon kaybının üstesinden gelmek için, araştırmacılar yeni karbon tutma yolları tasarlayarak gereksiz dekarboksilasyon adımından kaçınmışlardır. Hellgren ve arkadaşları [6], bir molekül fruktoz 6-fosfattan (F6P) üç molekül asetil koenzim A üreten oksidatif olmayan glikoliz yoluna (NOG) dayanan döngüsel bir karbon koruma yolu (GATHCYC) inşa etmişlerdir ve bu yol karbon kaybetmemektedir. Bu yolun kullanımı 3-hidroksipropiyonik asit üretiminde 109%'lik bir artışla sonuçlanmıştır. GATHCYC yolunun n-bütanol üreten bir suşa eklenmesi, n-bütanol üretiminde 1,75 g/L'lik bir artış ve CO2 emisyonlarında 35,2%'lik bir azalma ile sonuçlanmıştır.
3. Örnek olarak süksinik asit üretimi
Redoks dengesi ve karbon tutma özelliğine ek olarak termodinamik fizibilite ve enerji dengesi de optimum metabolik yolların tasarımında kilit faktörlerdir. Termodinamik fizibilite, fizyolojik olarak ilgili standart koşullar altında Gibbs serbest enerji değişimini (ΔrG'm) ifade eder ve bir metabolik yolun uygulanabilir olup olmadığını belirler. Enerji gerektiren ürünler enerji taleplerini karşılamak için substrat karbon kaybına yol açarken, oksitlenmiş ürünler enerji fazlalığına ve muhtemelen ısı dağılımına yol açtığından, hedef bileşikten daha fazla üretmek için hücresel enerji de dengelenmelidir. Süksinik asit (SA) bir TCA döngüsü ara metabolitidir. Bu bölümde SA üretimi için farklı stratejilere odaklanılmakta ve ATP stokiyometrisi, redoks dengesi, CO2 fiksasyonu, termodinamik fizibilite ve karbon tasarrufu farklı doğal ve mühendislik ürünü SA sentez yolları için değerlendirilmektedir. Süksinik asit için üç sentetik yol vardır: oksidatif TCA (oTCA) döngüsü, indirgenmiş TCA (rTCA) döngüsü ve glioksalat yolu (GS). oTCA döngüsü daha düşük bir teorik maksimum verime sahiptir, ancak aerobik koşullar altında süksinik asit üretimi, düşük yan ürünler ve daha uygun termodinamik metabolik özellikler avantajına sahiptir. gS, karbon kaybını önlemek ve ek NADH sağlamak için izositrik asit ve bütiril koenzim A arasındaki iki dekarboksilasyon adımını atlayan süksinik asit üretimi için alternatif bir yöntemdir. rTCA CO2'yi sabitler ve oTCA yolundan iki kat daha verimlidir. Verim oranının (YP) sadece yoldaki net stokiyometriyi dikkate alan ve NAD(P)H rejenerasyonu veya ATP üretimi sırasında karbon kaybını hesaba katmayan yerel bir parametre olduğuna dikkat etmek önemlidir. Ancak, maksimum teorik verim (YE) elektron dengesini göz önünde bulunduran ve dolayısıyla NAD(P)H rejenerasyonunu da dikkate alan global bir parametredir. Bu nedenle, bazı durumlarda YP YE'den daha yüksek olabilir. rTCA döngüsü SA sentezi esas olarak anaerobik koşullar altında rumen bakterileri tarafından gerçekleştirilir. Buna karşın, maya için rTCA döngüsü termodinamik açıdan elverişsizdir ve yetersiz hücresel NADH tedarikiyle sonuçlanır. Aşağıdaki şekil, oTCA döngüsü veya rTCA döngüsü yoluyla SA sentezinin Gibbs serbest enerjisindeki değişimi farklı karbon kaynakları ile karşılaştırmaktadır. Buna glikoz, gliserol, kısmi CBB döngüsü yoluyla ksiloz, indirgenmiş glisin yolu yoluyla formik asit veya metanolün asimilasyonu ve ksiloglukan fosfat yolu yoluyla metanolün asimilasyonu dahildir. Şekil 2. TCA döngüsünün oksidatif veya redüktif kolu kullanılarak süksinik asit üretimi
Mayaların düşük pH'ı tolere edebilme ve böylece sonraki işlemler sırasında SA üretiminin maliyetini azaltma yeteneği, maya tarafından SA üretiminin, özellikle de CO2'yi sabitleyebilen rTCA döngüsünün yaygın ilgi görmesine yol açmıştır. Glikoliz ve rTCA döngüsü yolu ile glikozdan SA sentezi 1 mol CO2/mol SA sabitleyebilmesine rağmen, yol redoks dengeli değildir ve üretilen her 1 mol SA için ek 1 mol NADH gerektirir. rTCA yolu ile 1 mol CO2/mol SA sabitleyebilen ve oksidatif olarak indirgenme dengeli SA üretimine izin veren bir karbon kaynağı olarak gliserol kullanmak cazip bir alternatiftir. Gliserol + CO2 kombinasyonu için toplam indirgeme γ = 3,5 SA ile aynıdır. Malubhoy ve arkadaşları [5] CO2 sabitleyerek 0,6 g/g gliserol verimi elde etmişlerdir ki bu da teorik maksimumun 47,1%'si kadardır.
Redoks dengesine ulaşmanın bir başka yolu da glikoz ve CO2'yi ortak substratlar olarak kullanmaktır. Eğer glikoliz, GATHCYC ve kısmi TCA döngüleri aynı anda kullanılırsa, redoks dengesi teorik olarak 1 mol SA'nın 0,5 mol CO2'yi sabitlemesiyle sağlanabilir. ancak, 1 mol SA, örneğin glikozun bir kısmının solunumu yoluyla yeniden üretilen ATP maliyetiyle 0,33 mol ATP tüketimini gerektirir. bu nedenle, bu senaryonun en azından hafif aerobik koşullar altında gerçekleştirilmesi gerekir, bu da sürece başka bir maliyet faktörü ekler.
Şekil 3 Glikoliz, GATHCYC, kısmi TCA döngüsü ve glioksilat yolunun bir kombinasyonu yoluyla bütandioik asidin redoks-nötr üretimi Tablo 1 SA'nın maya sentezi için doğal ve tasarlanmış yolların karşılaştırılması
nutri̇al nereden satin alabi̇li̇ri̇m maya？
Maya Fiyatına ihtiyacınız varsa, lütfen aşağıdaki forma iletişim bilgilerinizi doldurun, genellikle 24 saat içinde sizinle iletişime geçeceğiz. Bana e-posta da gönderebilirsiniz info@longchangchemical.com Çalışma saatleri içinde (8:30 - 6:00 UTC+8 Pzt.~Sat.) veya hızlı yanıt almak için web sitesi canlı sohbetini kullanın.