A eficiência do carbono é um dos principais fatores que definem a viabilidade de um processo de via e é o principal determinante da taxa de produto por unidade de substrato. Dois fatores determinam a eficiência do carbono: o equilíbrio de elétrons do substrato para o produto, que pode ser calculado a partir do grau de redução do substrato e do produto, e o fato de que as vias metabólicas existentes são projetadas principalmente para taxas de reação mais altas em vez de altos rendimentos de carbono. O primeiro fator está intimamente relacionado à composição química do substrato e do produto. O segundo fator pode ser superado com o redesenho da via metabólica, que permite que o carbono do substrato seja retido ou, em alguns casos, assimilado durante a formação do produto.

1. Equilíbrio redox em levedura metabolismo A eficiência das vias metabólicas necessárias para a produção biológica eficiente de produtos químicos depende de vários fatores, como equilíbrio redox, equilíbrio de energia, viabilidade termodinâmica, equilíbrio estequiométrico, acoplamento de fluxo, inibição de feedback, toxicidade do produto, cinética e assim por diante. O metabolismo celular mantém o crescimento celular e o equilíbrio redox transferindo elétrons de substratos para diferentes metabólitos. Portanto, a via biossintética ideal para a produção de um metabólito desejado deve ser neutra em termos de redox e o rendimento da via (YP) deve ser igual ou muito próximo do rendimento teórico máximo (YE) da combinação substrato-produto alvo.O YP depende da via envolvida e é determinado com base em sua estequiometria, enquanto o YE é a quantidade máxima de produto que pode ser formada a partir do substrato e pode ser calculado a partir da relação substrato-produto γS/γP calculada, em que γS e γP são o grau de redução do substrato e do produto, respectivamente. O grau de redução pode ser definido como o número de equivalentes de elétrons disponíveis por átomo de carbono do composto. Portanto, a YE precisa levar em conta o equilíbrio de elétrons para a conversão de um substrato em um produto, o que pode exigir descarboxilação, levando à perda de carbono, ou carboxilação, para fornecer absorção adicional de carbono. A figura a seguir mostra a via metabólica central da levedura. Figura 1. Via metabólica do carbono central da levedura, destacando a relação entre as etapas de carboxilação/descarboxilação e as alterações no grau de redução do substrato e do produto. O grau de redução dos substratos, metabólitos intermediários e produtos correspondentes é indicado pela mudança de cor de vermelho (γ=0) para amarelo (γ=4) e azul (γ=6)
De acordo com o grau de redução do substrato e do produto-alvo, ele pode ser dividido em três casos: quando o substrato e o produto-alvo têm o mesmo grau de redução, há uma situação ideal em que o substrato é completamente convertido em produto. Ou seja, o rendimento real do produto pode estar próximo do rendimento teórico máximo (YE), mas o processo metabólico produzirá subprodutos para a formação de biomassa e manutenção do crescimento celular, o que reduzirá o rendimento do produto. Um exemplo é o ácido lático (γ = 4,0), que tem o mesmo grau de redução que a glicose (γ = 4,0). Portanto, o processo de produção de lactato é uma via neutra em termos de redox com uma estequiometria equilibrada, permitindo a geração de ATP, o que resulta em uma taxa próxima ao rendimento teórico máximo. Em geral, para outros substratos-produtos, é raro encontrar tais vias que não gerem poder redutor excessivo.
Quando o produto é mais reduzido do que o substrato, as reações de oxidação necessárias para formar o produto geram equivalentes oxidativos adicionais (NAD+, NADP+, FADH+). Para reduzir esses equivalentes oxidativos, a célula precisa oxidar o carbono em CO2 e/ou outros subprodutos (por exemplo, na via das pentoses fosfato (PPP), no ciclo do TCA ou no ciclo do fosfato de xilulose (XuMP)) para manter a homeostase redox. Esse processo pode afetar a eficiência geral da conversão de substratos em produtos-alvo. Os exemplos incluem ácidos graxos, etanol e glicerol.
O uso de glicose como substrato para gerar ácidos graxos, como o ácido palmítico (γ = 5,75), reduz o rendimento de ácidos graxos devido aos altos requisitos de NADPH e à liberação de CO2 durante a extensão da cadeia de carbono, o que leva à perda de substrato. Yu et al [1] conseguiram aumentar o rendimento de ácidos graxos em Saccharomyces cerevisiae até 40% construindo uma via metabólica redutora anabólica caracterizada por um ciclo de descarboxilação repetitivo para fornecer à célula NADH, NADPH e ATP adicionais.
A produção de etanol a partir da glicose também oxida alguns substratos em CO2 e glicerol devido à necessidade de fornecer NADH. No entanto, a via natural da levedura para fermentar o etanol retém o grau de redução da glicose (γ = 4,0), com uma redução média geral de γ = 4,0 quando o CO2 e o etanol são os produtos finais. Assim, a via metabólica é muito eficiente do ponto de vista do rendimento, convertendo apenas 4-5% da fonte de carbono em glicerol. Da mesma forma, quando o 1,2-propanodiol (1,2-PDO) (γ=5,33) foi produzido pela levedura de cerveja usando glicerol (γ=4,66) como única fonte de carbono, a modificação de engenharia metabólica forneceu NADH adicional para facilitar a síntese de 1,2-PDO, alcançando os maiores rendimentos até o momento na levedura de >4 g/L de 1,2-PDO.
Quando o produto é reduzido abaixo do substrato, tanto os equivalentes redutores quanto o produto são gerados durante a produção do produto. Um mecanismo comum para re-oxidar o excesso de equivalentes redutores é por meio da oxidação pela cadeia respiratória, gerando excesso de ATP e/ou liberando calor. Como resultado, o rendimento do produto fica abaixo do máximo teórico que pode ser obtido com os elétrons disponíveis. Como alternativa, o excesso de equivalentes redutores pode ser consumido pela redução de parte da fonte de carbono a subprodutos redutores. Essa combinação de substrato-produto tem o potencial de fixar carbono para aumentar o rendimento do metabólito alvo. Assim como na produção de ácido cítrico (γ = 3,0) a partir da glicose, o transbordamento de energia devido à formação de NADH significa que a célula pode simplesmente ganhar energia produzindo o composto-alvo ao custo da perda de rendimento. A baixa eficiência do caminho bioquímico natural para a síntese de ácido cítrico representa, portanto, uma oportunidade de alcançar uma taxa de ganho teórica próxima à máxima que pode ser obtida com a fixação de carbono.
Portanto, os substratos para uso no produto desejado podem ser selecionados com base em γS e γP, maximizando o rendimento. O substrato preferido da levedura, a glicose, pode ser usado para sintetizar produtos com o mesmo γ da glicose, como o etanol (mais CO2) ou o ácido lático. Embora a glicose seja o substrato preferido, ela compete diretamente com a produção de alimentos ou rações. Portanto, várias fontes de carbono mais baratas, como glicerol, metanol e CO2, são consideradas substratos promissores.
O metanol (γ = 6,0) é uma matéria-prima C1 com alto grau de redução. Uma das principais vantagens do uso do metanol como fonte de carbono é seu poder redutor, que, em microrganismos como a levedura metilotrófica, forma NADH e gera ATP. No entanto, como a primeira reação da via é a oxidação do metanol a formaldeído usando oxigênio como aceptor de elétrons, a levedura perde um NADH para cada porção de metanol absorvida.Estudos recentes demonstraram que a Komagataella phaffii conseguiu utilizar o metanol de forma mais eficiente por meio da superexpressão da metanol desidrogenase endógena (Adh2) em uma cepa com deficiência de álcool oxidase (Mut-), o que resultou na produção de NADH e ATP adicionais por porção de metanol, o que permitiu que a cepa Mut-Adh2 aumentasse a intensidade da produção de proteínas heterólogas em condições de baixo consumo de oxigênio e emissão de calor.
Outra fonte de carbono promissora é o CO2, que é um composto altamente oxidado (γ=0) que pode ser reduzido por autótrofos para produzir compostos orgânicos para biossíntese. Portanto, uma maneira de introduzir o CO2 no metabolismo da levedura é a conversão de co-substrato, que converte o CO2 junto com outra fonte de carbono em um produto com um grau de redução menor do que o co-substrato. Na biossíntese de ácidos orgânicos, que têm um γ menor do que a glicose, como os ácidos cítrico, maleico e succínico, essa estratégia permite a incorporação de CO2 em processos de fermentação industrial para aumentar o rendimento de carbono.

2. Como equilibrar o grau de redução do produto? A evolução dos processos metabólicos em microrganismos geralmente se baseia no crescimento rápido das células e não na produção de produtos específicos. Portanto, a célula favorece o metabolismo rápido em detrimento da alta produção de carbono. Portanto, a capacidade das células de melhorar a retenção de carbono durante o metabolismo é um dos maiores desafios da engenharia metabólica, o que impede que as fábricas microbianas alcancem uma produção química de alto rendimento. Este artigo discute a engenharia metabólica da levedura com o objetivo de maximizar a retenção de carbono, incluindo a fixação de CO2, bem como evitar etapas de descarboxilação não essenciais na célula.2.1 Integração do carbono inorgânico no metabolismo celular usando CO2 como substrato Existem diferentes caminhos: uma molécula de CO2 forma compostos orgânicos por carboxilação; o CO2 é convertido por redução em ácido fórmico ou CO, que pode ser assimilado na biomassa. As reações de carboxilação são catalisadas por carboxilases, como a RuBisCO no ciclo CBB da via autotrófica de fixação de CO2 ou as enzimas da via Pck e Pyc, que estão envolvidas no fornecimento de precursores metabólicos centrais. O princípio da redução de carbono é que o CO2 é reduzido a ácido fórmico ou CO pela formiato desidrogenase ou CO desidrogenase, como na via reduzida da acetil coenzima A.2.1.1 Expressão de enzimas CBBase heterólogas para fixação de CO2 em leveduraProdução de etanol em S. cerevisiae Na produção de etanol em S. cerevisiae, Guadalupe-Medina et al [2] utilizaram o CO2 como aceptor de elétrons para aproveitar o excesso de poder redutor, ou seja, a conversão de CO2 para o PPP, a conversão de CO2 no metabólito intermediário Ru5P da via PPP pelas enzimas RuBisCO e Prk da via do ciclo CBB, resultando em um aumento de 10% na produção de etanol e uma redução de 90% na produção de glicerol como subproduto.Xia et al [3] encontraram um desequilíbrio redox durante a fermentação anaeróbica quando a xilose foi usada como substrato para a produção de etanol. A expressão de RrRuBisCO e SoPRK permitiu a reutilização do CO2 da descarboxilação do piruvato e reduziu o rendimento dos subprodutos xilitol e glicerol. Gassler et al. [4] construíram um ciclo CBB funcional na levedura metilotrófica K. phaffii, que fornece energia e poder redutor via metanol e produz ácido lático e malonato usando CO2 como fonte de carbono.
A via redutora da glicina é considerada a via mais eficiente para o crescimento aeróbico usando ácido fórmico. Todas as enzimas da via pró-glicina estão presentes na S. cerevisiae, mas ela não pode usar o ácido fórmico como substrato para o crescimento. A superexpressão das enzimas da via endógena resultou na expressão funcional da via reduzida da glicina, que permite a síntese de glicina a partir do ácido fórmico e do CO2 como um co-substrato para sustentar o crescimento de cepas deficientes em glicina. A via depende de altas concentrações de CO2 (10%). Recentemente, uma via de glicina reduzida naturalmente resistente ao oxigênio foi identificada na K. phaffii, mas a atividade natural dessa via não é suficiente para sustentar o crescimento celular.
2.1.3 Ramo reduzido do ciclo TCA (rTCA)
O ciclo de TCA reduzido (rTCA) é uma via de fixação de CO2 encontrada em procariotos. O rTCA é o processo inverso do ciclo de TCA oxidado e forma uma molécula de acetil coenzima A ao fixar duas moléculas de CO2. Até o momento, o ciclo reverso completo do TCA não foi realizado em leveduras. A rTCA parcial foi realizada em Saccharomyces cerevisiae para produzir ácido succínico e ácido málico. yan et al [5] superexpressaram os genes que codificam as três primeiras enzimas do ciclo Pyc2 e rTCA, Mdh3R, EcFumC e FrdS1, em cepas deficientes em Pdc e Fum1, o que resultou em um rendimento de ácido succínico de até 13 g/L com um rendimento de 0.21 mol/mol. malubhoy et al [ 5] sintetizaram 35 g/L de ácido butanodióico em um rendimento de 0,63 mol/mol de glicerol por meio da via do ciclo rTCA, enquanto o processo também alcançou a fixação líquida de CO2.
2.2 Evitar a descarboxilação desnecessária
A descarboxilação biológica ocorre principalmente nas vias catabólicas, como a glicólise, a PPP e o ciclo do TCA, em que a reação libera CO2 e é frequentemente associada à oxidação para regenerar NADH e NADPH. A descarboxilação também ocorre nas vias do metabólito precursor do produto final, em que todas as reações de descarboxilação na via reduzem o rendimento de carbono do substrato para o produto. Por exemplo, a acetil coenzima A, um metabólito produzido pela reação de descarboxilação do piruvato, resulta em uma perda de carbono na forma de CO2, o que reduz o rendimento teórico do produto de qualquer processo que envolva a acetil coenzima A como precursor. Como o ciclo TCA, a biossíntese de ácidos graxos e aminoácidos. Portanto, para superar a perda de carbono na síntese da acetil coenzima A, os pesquisadores evitaram a etapa desnecessária de descarboxilação projetando novas vias de retenção de carbono. Hellgren et al [6] construíram uma via cíclica de conservação de carbono (GATHCYC) com base na via de glicólise não oxidativa (NOG), que gera três moléculas de acetil coenzima A a partir de uma molécula de frutose 6-fosfato (F6P), e a via não perde carbono. O uso dessa via resultou em um aumento de 109% na produção de ácido 3-hidroxipropiônico. A introdução da via GATHCYC em uma cepa produtora de n-butanol resultou em um aumento na produção de n-butanol para 1,75 g/L e uma redução de 35,2% nas emissões de CO2.

3. Produção de ácido succínico como exemplo
Além do equilíbrio redox e da retenção de carbono, a viabilidade termodinâmica e o equilíbrio de energia são fatores essenciais para o projeto de vias metabólicas ideais. A viabilidade termodinâmica refere-se à mudança de energia livre de Gibbs (ΔrG'm) sob condições padrão fisiologicamente relevantes e determina se uma via metabólica é viável ou não. A energia celular também deve ser equilibrada para produzir mais do composto-alvo, pois os produtos que demandam energia levam à perda de carbono do substrato para atender às demandas de energia, enquanto os produtos oxidados levam ao excesso de energia e, possivelmente, à dissipação de calor. O ácido succínico (SA) é um metabólito intermediário do ciclo TCA. Nesta seção, o foco está em diferentes estratégias para a produção de SA e a estequiometria de ATP, o equilíbrio redox, a fixação de CO2, a viabilidade termodinâmica e a conservação de carbono são avaliados para diferentes vias de síntese de SA naturais e projetadas. Existem três vias sintéticas para o ácido succínico: o ciclo oxidativo do TCA (oTCA), o ciclo reduzido do TCA (rTCA) e a via do glioxalato (GS). O ciclo oTCA tem um rendimento máximo teórico mais baixo, mas a produção de ácido succínico em condições aeróbicas tem a vantagem de ter poucos subprodutos e atributos metabólicos termodinâmicos mais favoráveis. O gS é um método alternativo para a produção de ácido succínico que contorna o ácido isocítrico e a coenzima A butirilada para contornar as duas etapas de descarboxilação entre o ácido isocítrico e a coenzima A butirilada para evitar a perda de carbono e fornecer NADH adicional. É importante observar que a taxa de rendimento (YP) é um parâmetro local que considera apenas a estequiometria líquida na via e não leva em conta a perda de carbono durante a regeneração de NAD(P)H ou a geração de ATP. No entanto, o rendimento teórico máximo (YE) é um parâmetro global que considera o equilíbrio de elétrons e, portanto, também considera a regeneração de NAD(P)H. Portanto, em alguns casos, o YP pode ser maior que o YE. A síntese do ciclo rTCA de SA é realizada principalmente por bactérias ruminais em condições anaeróbicas. Em contraste, para a levedura, o ciclo rTCA é termodinamicamente desfavorável e resulta em um suprimento inadequado de NADH celular. A figura a seguir compara a alteração na energia livre de Gibbs da síntese de SA por meio do ciclo oTCA ou do ciclo rTCA com diferentes fontes de carbono. Isso inclui glicose, glicerol, xilose por meio do ciclo parcial de CBB, assimilação de ácido fórmico ou metanol por meio da via da glicina reduzida e assimilação de metanol por meio da via do fosfato de xiloglucano. Figura 2. Produção de ácido succínico usando a ramificação oxidativa ou redutiva do ciclo TCA
A capacidade da levedura de tolerar pH mais baixo e, assim, reduzir o custo da produção de SA durante o processamento downstream fez com que a produção de SA pela levedura atraísse muita atenção, especialmente o ciclo rTCA, que é capaz de fixar CO2. Embora a síntese de SA a partir da glicose por meio da glicólise e da via do ciclo rTCA possa fixar 1 mol de CO2/mol de SA, a via não é redox-equilibrada e requer 1 mol adicional de NADH para cada 1 mol de SA produzido. Uma alternativa atraente é utilizar o glicerol como fonte de carbono, que pode fixar 1 mol de CO2/mol de SA por meio da via rTCA, permitindo a produção de SA oxidativamente equilibrada por redução. A redução total γ = 3,5 para a combinação de glicerol + CO2 é a mesma que a de SA. Malubhoy et al [5] obtiveram um rendimento de 0,6 g/g de glicerol fixando CO2, que foi 47,1% do máximo teórico.
Outra maneira de atingir o equilíbrio redox é utilizar a glicose e o CO2 como co-substratos. Se a glicólise, o GATHCYC e os ciclos parciais de TCA forem utilizados simultaneamente, o equilíbrio redox pode ser alcançado teoricamente, com 1 mol de SA fixando 0,5 mol de CO2. No entanto, 1 mol de SA requer o consumo de 0,33 mol de ATP à custa de ATP regenerado, por exemplo, pela respiração de parte da glicose. Portanto, esse cenário precisa ser realizado em condições pelo menos ligeiramente aeróbicas, o que acrescenta outro fator de custo do processo.
Fig. 3 Produção redox-neutra de ácido butanodióico por meio de uma combinação de glicólise, GATHCYC, ciclo parcial de TCA e a via do glioxilato Tabela 1 Comparação das vias naturais e projetadas para a síntese de SA em leveduras

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