Wat is het productieproces van bio-enzymen?

1.Enzym productie

Enzymen worden geproduceerd uit micro-organismen, dieren en planten, maar de belangrijkste bron zijn micro-organismen. Aangezien micro-organismen meer voordelen hebben dan planten en dieren, worden over het algemeen uitstekende enzymproducerende stammen geselecteerd om enzymen te produceren door middel van fermentatie. Om de enzymconcentratie in de fermentatiebouillon te verhogen, worden uitstekende stammen geselecteerd, genetisch gemanipuleerde bacteriën ontwikkeld en fermentatieomstandigheden geoptimaliseerd. Voor industriële productie zijn speciale prestaties van nieuwe enzymen nodig, zoals α-amylase dat bestand is tegen hoge temperaturen, protease en lipase die bestand zijn tegen alkalische stoffen, enz. Daarom moeten we stammen onderzoeken en ontwikkelen die speciale prestaties van nieuwe enzymen kunnen produceren.

2. Enzympreparaat

De technologie voor scheiding en zuivering van enzymen vormt de kern van het huidige biotechnologische "nabehandelingsproces". Met behulp van een verscheidenheid van scheiding en zuivering technieken, van microbiële cellen en hun fermentatie bouillon, of dierlijke en plantaardige cellen en hun cultuur bouillon in de scheiding en zuivering van enzymen, gemaakt van zeer actieve enzympreparaten van verschillende zuiverheid, om enzympreparaten op grotere schaal gebruikt in alle aspecten van de nationale economie, moet de activiteit van enzympreparaten, zuiverheid en opbrengst te verbeteren, de noodzaak om de nieuwe scheiding en zuivering technieken te bestuderen.

3.Enzym en cel immobilisatie

Onderzoek naar immobilisatie van enzymen en cellen is de centrale taak van enzymtechnologie. Om de stabiliteit van enzymen te verbeteren, hergebruiken enzympreparaten, uitbreiding van het toepassingsgebied van enzympreparaten, met behulp van een verscheidenheid van immobilisatie methoden voor de immobilisatie van enzymen, de bereiding van geïmmobiliseerde enzymen, zoals geïmmobiliseerde glucose isomerase, geïmmobiliseerde carbamoylase, enz., de bepaling van geïmmobiliseerde enzymen, en geïmmobiliseerde enzymen voor de toepassing van verschillende aspecten van de ontwikkeling van onderzoek. Geïmmobiliseerd enzym heeft nog steeds een sterke vitaliteit. Het wordt zeer gewaardeerd door verschillende gebieden zoals biochemie, chemische technologie, microbiologie, polymeren en geneeskunde.

Geïmmobiliseerde cellen worden ontwikkeld op basis van geïmmobiliseerde enzymen. Verschillende immobilisatiemethoden worden gebruikt om microbiële cellen, dierlijke cellen en plantencellen te immobiliseren om een verscheidenheid aan geïmmobiliseerde biologische cellen te maken. De studie van de enzymatische eigenschappen van geïmmobiliseerde cellen, met name de kinetische eigenschappen, en het onderzoek naar en de ontwikkeling van geïmmobiliseerde cellen in verschillende toepassingen is tegenwoordig een veelbesproken onderwerp in de enzymtechnologie.

Immobilisatietechnologie is een belangrijke mijlpaal in de modernisering van enzymtechnologie, en het is een doorbraaktechnologie om de tekortkomingen van natuurlijke enzymen in industriële toepassingen te overwinnen en de eigenschappen van enzymreacties volledig tot hun recht te laten komen. Er kan gezegd worden dat er geen moderne enzymtechnologie bestaat zonder de ontwikkeling van immobilisatietechnologie.

4. Moleculaire modificatie van enzymen

Ook bekend als enzym moleculaire modificatie. Om de stabiliteit van het enzym te verbeteren, antigeniciteit te verminderen, de halfwaardetijd van medicinale bacteriën in het lichaam te verlengen, met behulp van verschillende modificatiemethoden om de structuur van de enzymmolecule te wijzigen, om een natuurlijk enzym te maken heeft niet een aantal uitstekende eigenschappen (zoals hogere stabiliteit, geen antigeniciteit, weerstand tegen protease hydrolyse, etc.), en zelfs een nieuwe enzymactiviteit te creëren, om de toepassing van het enzym uit te breiden, om zo de waarde van de enzymtoepassing te verhogen en grotere economische en sociale voordelen te behalen. en sociale voordelen.

Enzym moleculaire modificatie kan vanuit twee aspecten worden uitgevoerd:

(1) Gebruik eiwitengineeringtechnologie om de structuurgen van het enzymmolecuul te wijzigen en verwacht zo het nieuwe enzym (mutant enzym) met uitstekende eigenschappen en hoge activiteit te verkrijgen, dat een redelijke primaire structuur en ruimtestructuur heeft.

(2) Chemische of enzymatische modificatie van de primaire structuur van enzymeiwitten, of chemische modificatie van het enzymmolecuul met chemische modificatie van de zijketengroep. Om de enzymatische eigenschappen te veranderen. Deze enzymen zijn bijzonder nuttig voor fundamenteel onderzoek in de enzymologie en in de geneeskunde.

De micro-organismen die worden gebruikt bij de productie van enzymen zijn filamenteuze schimmels, gisten en bacteriën in drie grote groepen, voornamelijk aerobe bacteriën. De stammen en toepassingen van verschillende belangrijke industriële enzymen staan hieronder vermeld:

Amylase

Amylasen hydrolyseren zetmeel om deegachtige oligosachariden en maltose van mout te produceren. De productie wordt gedomineerd door diepe fermentatie met Bacillus subtilis en Bacillus licheniformis van het genus Bacillus, waarvan de laatste hittebestendige enzymen produceert. Diepe en halfvaste fermentaties met stammen van Aspergillus en Rhizopus worden ook gebruikt voor voedselverwerking [6]. Amylases worden voornamelijk gebruikt bij de productie van suiker, het desizeren van textiel, de behandeling van fermentatiegrondstoffen en voedselverwerking. Glucoamylase kan zetmeel hydrolyseren in glucose, dat nu bijna volledig wordt geproduceerd door diepe fermentatie van Aspergillus niger, en wordt gebruikt bij de productie van suiker, de productie van alcohol en de verwerking van fermentatiegrondstoffen.

Protease

Het gebruik van stammen en de productie van de meeste variëteiten. Met korstmos-vormige bacillus, korte kleine bacillus en bacillus subtilis tot diepe fermentatie productie van bacteriële protease; met streptomyces, Aspergillus diepe fermentatie productie van neutrale protease en Aspergillus zure protease, gebruikt voor leer ontharen, bont verzachten, farmaceutische producten, de voedingsindustrie; met Trichoderma spp. sommige van de bacteriën in semi-vaste fermentatie productie van stremsel bij de vervaardiging van kaas in plaats van stremsel gewonnen uit de maag van het oorspronkelijke kalf.

Glucose-isomerase

Een soort die zich snel ontwikkelde in de jaren 70. Streptomyces-cellen worden eerst verkregen door diepe fermentatie, en na immobilisatie wordt de glucoseoplossing omgezet in een stroop die ongeveer 50% fructose bevat, die in de voedingsindustrie kan worden gebruikt in plaats van sucrose. Met amylase, glucoamylase en glucose-isomerase, enz. wordt maïszetmeel omgezet in stroop, wat een van de opkomende suikerindustrieën is geworden.

Selectie van expressiesystemen
1 E. coli expressiesysteem
①pET-expressiesysteem heeft de voorkeur
② Eiwit recombinant expressie en zuivering kan worden uitgevoerd met behulp van opgeloste tags, MBP heeft de voorkeur als eerste keuze.
③ Bij voorkeur pET24 of pET28 (als opzuivering nodig is) met BL21(DE3), TB-medium 37° groei tot 1-1,5 OD, 18 ℃ groei gedurende 1 uur tot 3 OD , 0,5 mM IPTG-inductie gedurende 19 uur tot OD tot 10.
④ Reddingsmaatregelen voor hoge expressie en lage oplosbaarheid: afkoelen tot wel 15 ℃; veranderen van het medium naar 2xYT of ZYP5052 (zelf geïnduceerd), veranderen van de expressiegastheer; trunceren van de N-terminale en/of C-terminale 2-10 aminozuurresiduen; expressie door fusie met zeer goed oplosbare eiwitten, zoals MBP; chemisch induceren van moleculaire chaperones, co-expressie van moleculaire chaperones/interacterende eiwitten, of het leveren van liganden.
⑤ Voor- en nadelen van het E. coli-expressiesysteem
Voordelen: meest handig, meest effectief
Nadelen: zwak secretie-expressievermogen; moeilijkheid bij de vorming van disulfidebindingen; geen posttranslationele modificatie

2 Gist Expressiesysteem (Picrosporum)
Voordelen: stabiele integratie van exogene genen; de promoter van het alcoholoxidase gen is sterk en de expressie kan strikt gereguleerd worden door methanol; recombinante eiwitten kunnen tot expressie gebracht worden in intracellulaire of extracellulaire vorm; bevat post-translationele modificatiefuncties die gebruikelijk zijn bij eukaryotische expressiesystemen; er zijn commerciële hosts/vectors, die eenvoudig te bedienen zijn; eenvoudig te versterken en de fermentatiedichtheid is extreem hoog.
Nadelen: unieke vorm van posttranslationele verwerking; probleem van overmatige glycosylering.

3 De eerste keuze is het expressiesysteem gerapporteerd in de literatuur, de tweede keuze is het E. coli systeem, en het gist systeem wordt gebruikt als de expressie in E. coli inactief is. Volgens de bron van het gen om het expressiesysteem te bepalen, het gen plus affiniteit tags om zuivering te vergemakkelijken.

Enzym modificatie
①Rationeel ontwerp: gebaseerd op de informatie over de eiwitstructuur en functie van het coderende gen en de recombinatie-expressietest.
Procedure: eerst wordt de enzymstructuur uit de BRENDA-database gehaald, vervolgens wordt de enzymstructuur aangepast en voorspeld met Alphafold2, vervolgens wordt een dockinganalyse uitgevoerd tussen het enzym en de ligandmolecule met PyMOL-software en ten slotte worden op basis van de nieuwe enzymstructuur de gensequenties gericht gemuteerd en vervolgens gerecombineerd tot expressie gebracht om een nieuw enzym te verkrijgen (om de thermische stabiliteit, katalytische efficiëntie en substraatspecificiteit van het enzym te verbeteren).
② Irrationeel ontwerp: hoogfrequente mutatie of recombinatie van coderende sequenties en recombinante expressie en high-throughput testen

Ab initio ontwerpproces: 1. ontwikkeling krachtveld en bemonsteringsalgoritme 2. testen met hoge doorvoer 3. structuuridentificatie

Gerichte evolutie van eiwitten
①Selecteer originele genen
②Een diversiteitsgenmutatiebibliotheek samenstellen
③ Koppel meerdere gemuteerde genen in vectoren en breng ze respectievelijk tot expressie in overeenkomstige stammen
Selecteer een mutantgen van hoge kwaliteit door te screenen en breng het mutantgen vervolgens tot expressie in grote hoeveelheden.

Methoden voor het genereren van mutantgenbibliotheken
①In vivo hoogfrequente willekeurige mutatie: gebruik E. coli XL1-Red als gastheer voor genreplicatie (defect DNA-schadeherstelsysteem)
Gecultiveerd tot het plateaustadium treedt er gemiddeld 1 basismutatie op in 2Kb.
②Random Mutagenesis-kit: mutatiesnelheid 0,1 -1,6% /PCR, gelijk aan 1-16 basemutaties/gen
③ Punt-voor-punt verzadigingsmutagenese

Natuurlijke evolutie: Spontane mutatie, recombinatie, natuurlijke selectie
Agrarische evolutie: spontane mutatie, fokken, screening
Laboratoriumevolutie: versnelde mutatiesnelheid, moleculair kweken, screening

DNA schudden
Experimentele strategie voor eiwitengineering
①Selecteer het startgen om een inactivatiesysteem en/of een screeningsmethode te maken.
Als de structuur-functie relatie bekend is, gebruik dan eerst de rationele ontwerpmethode.
③Random mutatie fine-tuning en high-throughput screening
Ontwerp alleen vanaf nul als er geen geschikt startgen is.

Eiwitonderzoekstechnieken
1 Fysische en chemische eigenschappen met betrekking tot eiwitscheiding en -zuivering
Moleculaire grootte (dialyse, ultrafiltratie, gelfiltratie, centrifugatie)
Moleculaire vorm (gradiëntcentrifugatie, elektroforese)
(iii) Geladen eigenschappen (elektroforese, ionenwisselingschromatografie)
(iv) Oplosbaarheidskenmerken (verzilting, neerslaan van organische oplosmiddelen)
Verschillen in specifieke binding aan liganden (immunoaffiniteitschromatografie, bioaffiniteitschromatografie, metaalchelaataffiniteitschromatografie)
(vi) Adsorptie-eigenschappen (hydrofobe chromatografie)
(vii) denaturatie en denaturatie (denaturatie en denaturatie van ureum)

2 Eiwitexpressiesysteem
Bacterieel expressiesysteem: korte cyclus, hoge efficiëntie, lage kosten, maar geen post-translationele modificatie. Voornamelijk gebruikt voor de productie van prokaryote eiwitten, eenvoudige eukaryote eiwitten.
Selectie van expressievector: pet-serie, pGEX-serie, PQE30......
Selectie van expressiestammen: BL21(DE3), Rosetta, M15......
Inductieomstandigheden: IPTG-concentratie, temperatuur en tijdsduur
Zuivering: Ni-NTA (His-tag), Strep-korrels, GST.....

Gist expressiesysteem: korte cyclus, hoge efficiëntie, lage kosten, post-translationele modificatie bestaat. Er zal sprake zijn van ongeschikte glycosylering, hoge mannosemodificatie. Voornamelijk gebruikt voor de productie van intracellulaire/secretorische eiwitten, disulfidebindende eiwitten, geglycosyleerde eiwitten.

(iii) Bacteriofage-expressiesysteem: hoge gencapaciteit, oplosbaar eiwit, geschikt voor de productie van toxische eiwitten, posttranslationele modificaties vergelijkbaar met die van zoogdieren. De cultiveringsomstandigheden zijn zwaar en sommige glycosyleringsmodificaties ontbreken. Voornamelijk gebruikt voor de productie van membraaneiwitten, grote eiwitten, virale vaccins, signaaleiwitten, cytokinen, kinases.
Het baculovirusgenoom heeft een enorme capaciteit voor exogene geninserties tot 38 kb.
Baculovirussen worden geproduceerd in insectencellen en vermenigvuldigen zich niet in zoogdiercellen.
Voordelen: baculovirussen kunnen efficiënt worden getransduceerd in zoogdiercellijnen, waaronder primaire cellen en stamcellen.
Veiligheid (repliceert niet in zoogdiercellen) en geen waarneembare cytopathische effecten
Ingevroren opgeslagen pre-transduceercellen kunnen ook worden gebruikt als testpreparaatcellen
Draagbaarheid (voor analyse van farmacologisch relevante celtypen)
Snelheid van testontwikkeling (geen tijd nodig om stabiele cellijnen te genereren)

Zoogdierexpressiesystemen: lange cyclustijd, lage efficiëntie, aanwezigheid van posttranslationele modificaties, hoge bioactiviteit van eiwitten. Voornamelijk gebruikt voor de productie van complexe eukaryote eiwitten, eiwitten die precieze PTM vereisen.
Transiënte expressie van eiwitten: PEI- of liposoomtransfectiereagentia
Stabiele ontwikkeling van cellijnen: Flp-In™ Jump-In™ celtechnologieplatforms
Induceerbare expressie: Tetracycline-gereguleerde expressie
Virusgemedieerde expressie: lentiviraal expressiesysteem voor functionele analyse; adenoviraal expressiesysteem voor eiwitproductie

3 Eiwitzuivering
Waarom moeten we eiwitten zuiveren?
De structuur en functie van interessante eiwitten karakteriseren.
(ii) Eiwitregulatie en eiwitinteracties bestuderen
Antilichamen genereren
Zuiveringsmethoden
Gebaseerd op fysische/chemische eigenschappen
Eiwitgrootte: dialyse, ultrafiltratie, gelfiltratiechromatografie
Eiwitlading: ionenwisselingschromatografie
Hydrofobiciteit van eiwitten: hydrofobe interactiechromatografie

Gebaseerd op biologische eigenschappen: affiniteitschromatografie

Dialyse
Beïnvloedende factoren: MWCO van de dialyseslang; buffervolume; dialysetijd; frequentie waarmee de dialysebuffer wordt vervangen

Ultrafiltratie
Centrifugale filtratie, eiwitgrootte is kleiner dan de poriegrootte van de filterbuis, het wordt naar de bodem van de buis gecentrifugeerd.

③ Gelfiltratiechromatografie
Eiwitten van verschillende grootte scheiden

ionenwisselingschromatografie
Kationenwisselingskolom: gel is negatief geladen, eiwit is positief geladen
Anionuitwisselingskolom: gel is positief geladen, eiwit is negatief geladen
Medium
Inerte drager: agarose, dextraan
Geladen groepen: carboxymethyl: negatief geladen, diethylamino: positief geladen
ionen in evenwicht brengen: negatief geladen groepen: H+ of Na+ positief geladen groepen: OH- of Cl-
Stapsgewijze of gradiëntelutie van eiwitten door de zoutconcentratie te verhogen of de pH te veranderen.

Affiniteitschromatografie
Affiniteitschromatografie is een methode om biomoleculen van een mengsel te scheiden op basis van zeer specifieke macromoleculaire bindingsinteracties tussen een biomolecuul en een andere stof.
Voorbeelden zijn: antigeen binding aan antilichamen, enzym binding aan liganden, glutathion en GST fusie-eiwitten binding, anti-biotine eiwitten binding aan biotine-bindende moleculen, en metaalionen binding aan polyhistidine fusie-eiwitten.

Geïmmobiliseerde metaalchelaatchromatografie (IMAC) met metaalionen (Ni 2+; Co 2+; Cu 2+) gebonden aan poly-(His) ₆ Gemerkte eiwitten.

Zuivering van Strep-gemerkte eiwitten
Kralen kunnen eiwitten met de strep-tag specifiek adsorberen, waarna het eiwit met biotine van de kralen kan worden geëlueerd. (Het principe is vergelijkbaar met het GST pull-down experiment)

eiwitA/eiwitG affiniteitschromatografie
Genetisch gemanipuleerde proteïne A en proteïne G kunnen zich specifiek binden aan de Fc-regio van IgG van zoogdieren. Door eiwit A en eiwit G aan het kolommateriaal te binden, kunnen IgG en zijn subklassen en fragmenten worden gezuiverd met affiniteitschromatografie.
proteïne A: molecuulgewicht is 42kDa, gecodeerd door het spa-gen, met 5 isotypische immunoglobuline-bindende structurele domeinen, elk bestaande uit 3 alfa-helixen.
eiwit G: met een molecuulgewicht van 65 kDa, gecodeerd door het spg-gen, bindt de Fc- en Fab-segmenten van het antilichaam en het albumine in het serum. Het genetisch gemanipuleerde eiwit G verwijdert de bindingsplaats voor albumine en behoudt alleen het Fc-bindingsdomein, dat krachtiger is dan eiwit A.
proteïneA/proteïneG: is een genetisch gemanipuleerd bindend eiwit. Het bestaat uit 4 eiwit A en 2 eiwit G immunoglobuline bindende domeinen, die een breder bindingsbereik heeft dan eiwit A of eiwit G alleen, en combineert hun voordelen in één, die kan worden toegepast op de zuivering van IgG van bijna alle soorten.

Hoe identificeer je het gezuiverde eiwit?
SDS-PAGE; HPLC; massaspectrometrie; Western blot; Bindingsassays; Functionele assays; Structurele opheldering.

4 Elektronenmicroscopie
Cryo-elektronenmicroscopie van afzonderlijke deeltjes (Single-ParticleAnalysis, SPA)
Cryo-elektronentomografie microscopie (cryo-ET)

Neem nu contact met ons op!

Als je Price nodig hebt, vul dan je contactgegevens in op het formulier hieronder. We nemen dan meestal binnen 24 uur contact met je op. Je kunt me ook een e-mail sturen info@longchangchemical.com tijdens kantooruren (8:30 tot 18:00 UTC+8 ma. ~ za.) of gebruik de live chat op de website voor een snel antwoord.

Samenstelling Glucoamylase	9032-08-0
Pullulanase	9075-68-7
Xylanase	37278-89-0
Cellulase	9012-54-8
Naringinase	9068-31-9
β-amylase	9000-91-3
Glucose-oxidase	9001-37-0
alfa-amylase	9000-90-2
Pectinase	9032-75-1
Peroxidase	9003-99-0
Lipase	9001-62-1
Katalase	9001-05-2
TANNASE	9025-71-2
Elastase	39445-21-1
Urease	9002-13-5
DEXTRANASE	9025-70-1
L-Lactische dehydrogenase	9001-60-9
Dehydrogenase malaat	9001-64-3
Cholesteroloxidase	9028-76-6