1. Detectiemethode van naringinase enzymactiviteit
1-1 Spectrofotometermethode
De p-nitrofenol spectrofotometrische methode gebruikt p-nitrofenol-α-rhamnoside ( pNP- α- Rha ) en p-nitrofenol-β-D-glucopyranoside ( pNP- β-Glu) als substraat voor het detecteren van de enzymactiviteit van α-rhamnosidase en β-glucosidase. Li Ping gebruikte de p-nitrofenolspectrofotometermethode in het experiment waarbij Aspergillus niger β-glucosidase toevoegde aan de oplossing van p-nitrofenol -β-glucoside (pNPG) voor enzymatische hydrolyse en de absorptiewaarde werd gemeten bij 400 nm ultraviolette golflengte. En op basis van de absorptiewaarde berekenden ze de enzymactiviteit van het β-glucosidase. Deze methode heeft een sterke substraatspecificiteit, maar het standaardsubstraat is duur en de enzymactiviteit van naringinase om glycosiden in voedsel te hydrolyseren kan niet worden bepaald, dus deze methode is niet geschikt voor de detectie van enzymactiviteit in industriële grootschalige bereiding van naringinase.
Het principe van de Davis-spectrofotometermethode is dat naringine een chromogene reactiereactie kan aangaan met 90% diethyleenglycol onder licht alkalische omstandigheden, en de gele naringine chalconproductie kan worden gedetecteerd onder ultraviolet licht met een golflengte van 420 nm. Op basis van de gemeten absorptiewaarde kan de resterende hoeveelheid van het substraat naringine worden berekend, en vervolgens kan de naringinaseactiviteit door berekening worden verkregen. Wang Weina et al. gebruikten een verbeterde Davis-methode, namen naringine als substraat en voegden naringinase geproduceerd door vloeibare fermentatie van Aspergillus niger FFCC 848 toe voor enzymatische hydrolyse. De absorptie werd gemeten onder 420 nm ultraviolet licht en vervolgens werd de enzymactiviteit berekend. De Davis-spectrofotometermethode voor het meten van de enzymactiviteit is eenvoudig te bedienen, heeft een hoge snelheid, dus deze methode wordt veel gebruikt voor het in één keer detecteren van naringinaseproductie door fermentatie en de activiteit van geïmmobiliseerde naringinase.
1-2 Vloeibare chromatografie met hoge prestaties
Het principe van hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) is dat HPLC het substraat naringine, het tussenproduct purunine en het eindproduct naringenine tijdens het hele hydrolyseproces nauwkeurig kan bepalen en kwantitatief kan analyseren, en vervolgens de enzymactiviteit kan berekenen. Chen Yuelong en anderen gebruikten HPLC om de retentietijd van naringine, arbutine, myricetine en hun producten te bepalen, en bereikten een volledige scheiding met een resolutie groter dan 1,5, en controleerden effectief het effect van naringinase op meerdere glycosiden in het hydrolyseproces, en tegelijkertijd werd de enzymactiviteit nauwkeurig bepaald. De HPLC-methode heeft de voordelen van hoge nauwkeurigheid en kan de interferentie van onzuiverheden vermijden, maar vergeleken met de Davis-methode heeft deze methode een langere detectietijd en een gecompliceerdere bewerking.
1-3 Verbeterde bepalingsmethode voor naringinase enzymactiviteit
Met de verbeterde Davis-methode: 0,8 ml van 0,8 g-L-1 naringine-oplossing bereid met pH 4,5 buffer werd toegevoegd aan het reactiesysteem dat 40 mg geïmmobiliseerde naringinase (of 0,2 mL vrije naringinase) bevatte. Plaats het gedurende 30 minuten in een waterbad van 50 ℃ constante temperatuur. Neem 0,1 mL van de reactie-enzymatische hydrolyseoplossing en voeg 5 mL diethyleenglycol (90% volumefractie) en 0,1 mL NaOH-oplossing (4 mol-L-1) in buisjes en laat 10 minuten staan nadat ze gelijkmatig zijn gemengd. Meet de extinctie van de gemengde oplossing bij 420 nm.
De definitie van de activiteit van naringinase-enzym (U): bij een pH van 4,5 en 50 ℃ is 1 enzymactiviteitseenheid de hoeveelheid enzym die nodig is om 1 μg naringine per minuut af te breken. Verhouding enzymactiviteit ( U-g-1 of U-mL-1) wordt gedefinieerd als: bij pH 4,5, 50 ℃, enzymactiviteit vertoond door 1 g geïmmobiliseerd naringinase (of 1 ml vrij naringinase). De relatieve enzymactiviteit wordt berekend met de volgende formule :
Bepaling van standaardcurve: de massaconcentratie van standaardglycoside naringine-oplossing zijn geregeld 0, 0,4, 0,8, 1,2, 1,6 g - L-1en vervolgens werd 0,1 mL oplossing genomen voor reactie met 5 mL diethyleenglycol (90% , v / v) en 0,1 mL natriumhydroxideoplossing ( 4 mol-L-1). Nadat het mengsel gelijkmatig was gemengd en 10 minuten had gestaan, werd de lichtabsorptiewaarde van de gemengde oplossing gemeten bij 420 nm en werd de standaardcurve dienovereenkomstig getrokken.
2. Bereiding van naringinase-enzymoplossing
De Aspergillus niger FFCC uv-11 opgeslagen bij 4 ℃ werd overgebracht naar de slant medium, en de volwassen sporen werden verkregen door constante temperatuur cultuur bij 30 ℃ gedurende 96 uur. Daarna werden de sporen gewassen met steriele normale zoutoplossing met een massafractie van 0,9%. De absorptiewaarde van de sporensuspensie wordt gemeten bij 600 nm (OD600-waarde), met steriele zoutoplossing werd de OD600-waarde aangepast tot 0,200. En dan de sporensuspensie met de volumefractie van 10% inoculatie bedrag aan 100 ml fermentatiemedium (250 ml erlenmeyer), De verkregen fermentatie bouillon werd gecentrifugeerd bij 4 ℃ en 6000 r-min-1 gedurende 10 minuten in een gekoelde centrifuge. Dan door de zuigfilter om supernatant vloeistof nodig naringine enzym enzym vloeistof te krijgen. Koel het bij 4 ℃ voor later gebruik.
3. Bereiding van Chitosan geïmmobiliseerd Naringinase enzym
Neem 3,0 g chitosan, met 100 mL volume fractie van 2% azijnzuur oplossing werd opgelost tot 0,3 g te bereiden - L-1 chitosan colloïdale oplossing, 20 minuten gesonitiseerd om luchtbellen te verwijderen en volledig laten oplossen. De colloïdale oplossing van chitosan werd druppelsgewijs met een naald geïnjecteerd in 0,5 g - L-1 NaOH-condensaat (1000 ml) om een gladde pellet te vormen. Laat het 3 uur staan bij kamertemperatuur en de pellets werden herhaaldelijk gewassen met gedestilleerd water tot ze neutraal waren en het water werd geabsorbeerd door een filtreerpapier om de chitosan microsferen te verkrijgen. 0,4 g chitosan microsferen werden afgewogen, 0,4 ml glutaraldehyde met 6% volume fractie werd toegevoegd, en de microsferen werden herhaaldelijk gewassen met gedestilleerd water totdat er geen glutaraldehyde op het oppervlak van de microsferen na constante temperatuur en trillingen bij 25 ℃ 150 r-min-1 gedurende 2 uur. De vernette chitosan microsferen werden verkregen door drogen met filtreerpapier.
Hij zei 0,4 g chitosan microsferen, voeg 0,4 ml lid aantal kredieten 6% glutaaraldehyde, op 150 r - min-1 bij 25 ℃ temperatuurschommeling Na 2 uur, herhaaldelijk gewassen met gedestilleerd water microsfeer aan het oppervlak daarvan is niet pentyldialdehyde en filtreerpapier worden gedroogd om cross-linked chitosan microsferen te verkrijgen. Neem 4 ml naringinase enzymoplossing, voeg het toe aan 0,4 g van vernet chitosan microsferen, schudden bij een constante temperatuur van 25 ℃, 150 r-min-1 gedurende 2 uur en plaats het in een koelkast bij 4 ℃ voor adsorptiekoppeling gedurende 4 uur. Spoel de achtergebleven enzymoplossing op het oppervlak van de drager met pH 4,5-buffer, absorbeer het water op het filtreerpapier om geïmmobiliseerd naringinase te verkrijgen en bewaar het in een koelkast bij 4 ℃ voor later gebruik.
4. Bereiding van magnetische, op silicium gebaseerde chitosan ( MSC) microsferen
Het bereidingsproces van magnetische nanodeeltjes op basis van silicium (MS) is weergegeven in figuur 1.
Figuur 1 Schematische weergave van de bereiding van magnetische nanodeeltjes op basis van silicium
( 1) Ten eerste, magnetische Fe3O4 nanodeeltjes gemodificeerd met citroenzuur werden bereid door chemische coprecipitatie methode, en de experimentele procedure die bestaat uit: 2,25 g FeCl3-6H2O en 1,61 g FeSO4-7H2O worden toegevoegd in een kolf met drie hals gevuld met 100 ml gedeïoniseerd water, werd de temperatuur van het systeem verwarmd tot 85 ℃ onder de voorwaarde van stikstofgas . Roer onder 1000 r-min-1 en giet er snel 10 mL geconcentreerd ammoniakwater bij. Voeg 153 mg natriumcitraat toe nadat de oplossing zwart wordt. Scheid na 30 minuten reactie de productie met een magneet en was de vaste fase meerdere malen met gedeïoniseerd water en ethanol. De Fe3O4 De verkregen nanodeeltjes worden gedroogd voor later gebruik.
( 2) Vervolgens werden magnetische nanodeeltjes op basis van silicium (MS) bereid met de solgelmethode, getoond in figuur 1. De experimentele stappen omvatten: 0,1 g Fe3O4 nanodeeltjes gelijkmatig gedispergeerd in een gemengde oplossing met 40 mL watervrije ethanol, 10 mL gedestilleerd water en 1,2 mL geconcentreerd ammoniakwater. Onder de roeromstandigheden van 300 r-min-1druppeltjes oplossing met Fe3O4 nanodeeltjes werden toegevoegd aan TEOS (0,4 mL) gedispergeerd in 30 mL watervrije ethanol, en de reactie van silicium gebaseerde nanodeeltjes werd uitgevoerd gedurende 12 uur bij kamertemperatuur. De producten werden meerdere malen gewassen met watervrije ethanol en gedestilleerd water om magnetische nanodeeltjes op basis van silica (MS) te verkrijgen, die gedroogd werden voor later gebruik.
MSC microsferen werden bereid door emulsie crosslinking methode, zoals weergegeven in figuur 2. De experimentele stappen omvatten: 0,125 g magnetische silica nanodeeltjes (MS) gelijkmatig gedispergeerd tot 10 mL chitosan oplossing met massafractie van 2,5% bereid door chitosan opgelost in azijnzuur oplossing met volumefractie van 5,0%, en voeg vervolgens de chitosan oplossing in een emulsie met 60 mL vloeibare paraffine was en 1,8 mL twain 80 druppel voor druppel. Na 30 minuten roeren in de toestand van 40 ℃ waterbad en 800 r-min-1， voeg 2,0 mL glutaaraldehyde toe en reageer 1 uur. Vervolgens werd de pH van het systeem op 9,0 gebracht met 1 mol-L-1 NaOH en de reactie werd gedurende 1 uur voortgezet. De producten werden verschillende keren gewassen met petroleumether, ethanol en gedestilleerd water om MSC-microsferen te verkrijgen, die in vacuüm werden gedroogd voor later gebruik.
Figuur 2 Schematische weergave van de bereiding van magnetische chitosan-microsferen op basis van silicium
5. Bereiding van epoxygebaseerde magnetische chitosan-microsferen op basis van silicium ( MSCE)
0,5 g gedroogde MSC microsferen bereid volgens de methode van 4 werden afgewogen en toegevoegd aan een erlenmeyer van 50 ml. Vervolgens werd 2,0 mL NaOH-oplossing, epichrolohydrine-oplossing en NaBH4 oplossing werden respectievelijk met een bepaalde concentratie aan de erlenmeyer toegevoegd. En de reactie werd uitgevoerd door constante temperatuurschommeling gedurende een bepaalde tijd. Het reactiemechanisme van de bereiding van MSCE wordt getoond in figuur 3.
Figuur 3 Het principe van de bereiding van epoxygebaseerde magnetische chitosan-microsferen op basis van silicium
Na activering worden de geactiveerde microsferen herhaaldelijk gewassen met gedestilleerd water totdat er geen vrije OH- en epoxygroepen meer op het oppervlak zitten om epoxygebaseerde magnetische chitosanmicrosferen op basis van silicium ( MSCE) te verkrijgen. De detectiemethode is als volgt: neem 3,0 ml van het wassupernatant en voeg 1~2 druppels fenolftaleïne toe. Na schudden, als het niet rood, betekent dit dat er geen vrije OH- met MSCE; neem 3,0 mL van het wassen supernatant en voeg 3,0 mL van 1,3 mol-L-1 natriumthiosulfaat en 1 ~ 2 druppels fenolftaleïne, als de oplossing niet rood wordt na schudden, betekent dit dat er geen vrije epoxygroepen met MSCE zijn. De reactievergelijking van de detectie van epoxygroep is als volgt:
6 Bereiding van MSCE geïmmobiliseerd naringinase enzym
5,0 g MSCE bereid volgens methode 5 werd toegevoegd aan 50 mL naringinase enzymoplossing met een bepaalde pH, en de reactie werd geschud onder een waterbad met constante temperatuur, zoals getoond in figuur 4. Na de reactie werden de microsferen enkele malen gewassen met bufferoplossing totdat er geen vrije naringinase meer op het oppervlak van de microsferen werd aangetroffen. De microsferen werden afgetapt door een Brinella trechter om MSCE geïmmobiliseerd naringinase enzym te verkrijgen, dat werd gekoeld bij 4 ℃ voor later gebruik.
Figuur 4 Het principe van de bereiding van MSCE geïmmobiliseerd naringinase enzym
Neem nu contact met ons op!
Als je Price nodig hebt, vul dan je contactgegevens in op het formulier hieronder. We nemen dan meestal binnen 24 uur contact met je op. Je kunt me ook een e-mail sturen info@longchangchemical.com tijdens kantooruren (8:30 tot 18:00 UTC+8 ma. ~ za.) of gebruik de live chat op de website voor een snel antwoord.
