Koolstofefficiëntie is een van de belangrijkste factoren die de levensvatbaarheid van een pathwayproces bepalen en is de belangrijkste determinant van de snelheid van het product per eenheid substraat. Twee factoren bepalen de koolstofefficiëntie: de elektronenbalans van het substraat naar het product, die kan worden berekend uit de mate van reductie van het substraat en het product, en het feit dat bestaande metabolische routes voornamelijk zijn ontworpen voor hogere reactiesnelheden in plaats van hoge koolstofopbrengsten. De eerste factor hangt nauw samen met de chemische samenstelling van het substraat en het product. De tweede factor kan worden overwonnen door de metabolische route te herontwerpen, waardoor de koolstof van het substraat kan worden behouden of, in sommige gevallen, kan worden geassimileerd tijdens de vorming van het product.

1. Redoxbalans in gist metabolisme De efficiëntie van metabolische routes die nodig zijn voor een efficiënte biologische productie van chemische stoffen hangt af van verschillende factoren zoals redoxbalans, energiebalans, thermodynamische haalbaarheid, stoichiometrisch evenwicht, fluxkoppeling, feedbackinhibitie, producttoxiciteit, kinetiek, enzovoort. Het celmetabolisme handhaaft de celgroei en het redoxevenwicht door elektronen van substraten naar verschillende metabolieten over te dragen. Daarom moet de optimale biosynthetische route voor de productie van een gewenst metaboliet redoxneutraal zijn en moet de opbrengst van de route (YP) gelijk zijn aan of zeer dicht liggen bij de maximale theoretische opbrengst (YE) van de combinatie substraat-doelproduct.De YP is afhankelijk van de betrokken pathway en wordt bepaald op basis van de stoichiometrie, terwijl de YE de maximale hoeveelheid product is die uit het substraat kan worden gevormd en kan worden berekend op basis van de substraat-productverhouding γS/γP, waarbij γS en γP respectievelijk de reductiegraad van het substraat en het product zijn. De reductiegraad kan worden gedefinieerd als het aantal beschikbare elektronequivalenten per koolstofatoom van de verbinding. Daarom moet YE rekening houden met de elektronenbalans voor de omzetting van een substraat in een product, waarvoor decarboxylering nodig kan zijn, wat leidt tot koolstofverlies, of carboxylering om extra koolstofopname te verkrijgen. De volgende figuur toont de centrale stofwisselingsroute van de gist. Figuur 1. De gist centrale koolstofmetabolische route, met de nadruk op de relatie tussen carboxylatie/decarboxylatie stappen en veranderingen in de mate van substraat- en productreductie. De mate van reductie van de corresponderende substraten, tussenliggende metabolieten en producten wordt aangegeven door de kleurverandering van rood (γ=0) naar geel (γ=4) naar blauw (γ=6).
Volgens de reductiegraad van het substraat en het doelproduct, kan het worden onderverdeeld in drie gevallen: wanneer het substraat en het doelproduct dezelfde reductiegraad hebben, is er een ideale situatie waarbij het substraat volledig wordt omgezet in product. Dat wil zeggen, de werkelijke productopbrengst kan dicht bij de maximale theoretische opbrengst (YE) liggen, maar het metabolische proces zal bijproducten produceren voor de vorming van biomassa en het behoud van celgroei, wat de productopbrengst zal verminderen. Een voorbeeld is melkzuur (γ = 4,0), dat dezelfde reductiegraad heeft als glucose (γ = 4,0). Daarom is het productieproces van lactaat een redoxneutrale route met een evenwichtige stoichiometrie, waarbij ATP wordt gegenereerd, wat resulteert in een snelheid die dicht bij de maximale theoretische opbrengst ligt. Over het algemeen is het zeldzaam om voor andere substraatproducten zulke routes te vinden die geen overmatig reducerend vermogen genereren.
Wanneer het product meer gereduceerd is dan het substraat, genereren de oxidatiereacties die nodig zijn om het product te vormen extra oxidatieve equivalenten (NAD+, NADP+, FADH+). Om deze oxidatieve equivalenten te reduceren, moet de cel koolstof oxideren tot CO2 en/of andere bijproducten (bijv. in de pentosefosfaatroute (PPP), de TCA-cyclus of de xylulosefosfaatcyclus (XuMP)) om de redoxhomeostase te handhaven. Dit proces kan de algehele efficiëntie van substraatomzetting naar doelproducten beïnvloeden. Voorbeelden zijn vetzuren, ethanol en glycerol.
Het gebruik van glucose als substraat voor het genereren van vetzuren, zoals palmitinezuur (γ = 5,75), vermindert de opbrengst van vetzuren vanwege de hoge NADPH-vereisten en het vrijkomen van CO2 tijdens de koolstofketenverlenging, wat leidt tot substraatverlies. Yu et al [1] slaagden erin de opbrengst van vetzuren in Saccharomyces cerevisiae te verhogen tot 40% door een anabole reductieve metabolische route te bouwen die wordt gekenmerkt door een repetitieve decarboxylatiecyclus om de cel te voorzien van extra NADH, NADPH en ATP.
Bij de productie van ethanol uit glucose oxideren ook sommige substraten tot CO2 en glycerol vanwege de noodzaak om NADH toe te voeren. De natuurlijke gistroute voor de fermentatie van ethanol behoudt echter de reductiegraad van glucose (γ = 4,0), met een totale gemiddelde reductie van γ = 4,0 als CO2 en ethanol de eindproducten zijn. De metabolische route is dus zeer efficiënt vanuit het oogpunt van opbrengst, waarbij slechts 4-5% van de koolstofbron wordt omgezet in glycerol. Ook toen 1,2-propaandiol (1,2-PDO) (γ=5,33) werd geproduceerd door biergist met glycerol (γ=4,66) als enige koolstofbron, leverde de metabole modificatie extra NADH om de synthese van 1,2-PDO te vergemakkelijken, waardoor de hoogste opbrengst tot nu toe in gist werd bereikt van >4 g/L 1,2-PDO.
Wanneer het product wordt gereduceerd tot onder het substraat, worden tijdens de productie van het product zowel reductie-equivalenten als product gegenereerd. Een veel voorkomend mechanisme voor het heroxideren van overtollige reductie-equivalenten is door oxidatie door de ademhalingsketen, waarbij overtollig ATP wordt gegenereerd en/of warmte vrijkomt. Als gevolg daarvan is de productopbrengst lager dan het theoretische maximum dat haalbaar is met de beschikbare elektronen. Als alternatief kunnen de overtollige reductie-equivalenten worden verbruikt door een deel van de koolstofbron te reduceren tot reducerende bijproducten. Deze substraat-productcombinatie heeft het potentieel om koolstof te fixeren om de opbrengst van de doelmetaboliet te verhogen. Net als bij de productie van citroenzuur (γ = 3,0) uit glucose betekent de energiespillover door de vorming van NADH dat de cel eenvoudig energie kan winnen door de doelverbinding te maken ten koste van opbrengstverlies. De lage efficiëntie van de natuurlijke biochemische route voor de synthese van citroenzuur biedt daarom een kans om dicht bij de maximale theoretische winst te komen die kan worden bereikt door koolstof te fixeren.
Daarom kunnen substraten voor gebruik in het gewenste product worden geselecteerd op basis van γS en γP die de opbrengst maximaliseren. Het voorkeurssubstraat van gist, glucose, kan worden gebruikt om producten te synthetiseren met dezelfde γ als glucose, zoals ethanol (plus CO2) of melkzuur. Hoewel glucose het voorkeurssubstraat is, concurreert glucose rechtstreeks met de productie van voedsel of diervoeder. Daarom worden verschillende goedkopere koolstofbronnen zoals glycerol, methanol en CO2 als veelbelovende substraten beschouwd.
Methanol (γ = 6,0) is een C1 grondstof met een hoge reductiegraad. Een van de belangrijkste voordelen van het gebruik van methanol als koolstofbron is het reducerend vermogen, dat in micro-organismen zoals de methylotrofe gist NADH vormt en ATP genereert. Omdat de eerste reactie van de route echter de oxidatie van methanol tot formaldehyde is, waarbij zuurstof als elektronenacceptor wordt gebruikt, verliest de gist één NADH voor elke opgenomen portie methanol.Recente studies hebben aangetoond dat Komagataella phaffii in staat was om methanol efficiënter te gebruiken door overexpressie van endogeen methanoldehydrogenase (Adh2) in een alcoholoxidase-deficiënte stam (Mut-), wat resulteerde in de productie van extra NADH en ATP per portie methanol. Hierdoor kon de Mut-Adh2 stam de intensiteit van de productie van heterologe eiwitten verhogen onder omstandigheden van laag zuurstofverbruik en warmteafgifte.
Een andere veelbelovende koolstofbron is CO2, een sterk geoxideerde verbinding (γ=0) die door autotrofen kan worden gereduceerd tot organische verbindingen voor biosynthese. Daarom is één manier om CO2 in het gistmetabolisme te introduceren co-substraatomzetting, waarbij CO2 samen met een andere koolstofbron wordt omgezet in een product met een lagere reductiegraad dan het co-substraat. Bij de biosynthese van organische zuren, die een lagere γ hebben dan glucose, zoals citroenzuur, maleïnezuur en barnsteenzuur, maakt deze strategie de integratie van CO2 in industriële fermentatieprocessen mogelijk om de koolstofopbrengst te verhogen.

2. Hoe kan de mate van productreductie in balans worden gebracht? De evolutie van metabole processen in micro-organismen is meestal meer gebaseerd op de snelle groei van cellen dan op de productie van specifieke producten. Daarom geeft de cel de voorkeur aan een snelle stofwisseling boven een hoge koolstofopbrengst. Daarom is het vermogen van cellen om koolstof beter vast te houden tijdens het metabolisme een van de grootste uitdagingen in metabolic engineering, wat microbiële fabrieken ervan weerhoudt om chemische productie met een hoog rendement te realiseren. Dit artikel bespreekt de metabolic engineering van gist gericht op het maximaliseren van koolstofretentie, inclusief CO2-fixatie en het vermijden van niet-essentiële decarboxyleringsstappen in de cel.2.1 Integratie van anorganische koolstof in het celmetabolisme met CO2 als substraat Er zijn verschillende routes: een CO2-molecuul vormt organische verbindingen door carboxylering; CO2 wordt door reductie omgezet in mierenzuur of CO, dat kan worden geassimileerd in biomassa. Carboxyleringsreacties worden gekatalyseerd door carboxylases, zoals RuBisCO in de CBB-cyclus van de autotrofe CO2-fixeringsroute of de route-enzymen Pck en Pyc, die betrokken zijn bij de levering van centrale metabolische precursors.Het koolstofreductieprincipe is dat CO2 wordt gereduceerd tot mierenzuur of CO door formiaatdehydrogenase of CO-dehydrogenase, zoals in de gereduceerde acetylco-enzym A-route.2.1.1 Expressie van heterologe CBBase enzymen voor CO2-fixatie in gistEthanolproductie in S. cerevisiae Bij de ethanolproductie in S. cerevisiae maakten Guadalupe-Medina et al [2] gebruik van CO2 als elektronenacceptor om overtollig reducerend vermogen te benutten, d.w.z. om CO2 om te zetten in de PPP van S. cerevisiae, de omzetting van CO2 in de tussenstof Ru5P van de PPP-route door de enzymen RuBisCO en Prk van de CBB-cyclus, wat resulteerde in een toename van de ethanolproductie met 10% en een afname van de productie van glycerol als bijproduct met 90%. Xia et al [3] vonden een redoxonevenwichtigheid tijdens anaerobe fermentatie wanneer xylose werd gebruikt als substraat voor ethanolproductie. Expressie van RrRuBisCO en SoPRK maakte hergebruik van CO2 uit pyruvaatdecarboxylering mogelijk en verminderde de opbrengst van de bijproducten xylitol en glycerol.Gassler et al [4] construeerden een functionele CBB-cyclus in de methylotrofe gist K. phaffii, die energie en reducerend vermogen levert via methanol en melkzuur en malonaat produceert met gebruik van CO2 als koolstofbron.2.1.2 Reductie-Glycineweg
Alle enzymen van de pro-glycine route zijn aanwezig in S. cerevisiae, maar het kan mierenzuur niet gebruiken als substraat voor groei. Overexpressie van de endogene pathway-enzymen resulteerde in functionele expressie van de gereduceerde glycinepathway, die de synthese van glycine uit mierenzuur en CO2 als co-substraat mogelijk maakt om de groei van glycinedeficiënte stammen te ondersteunen. De route is afhankelijk van hoge concentraties CO2 (10%). Onlangs werd een van nature zuurstofresistente gereduceerde glycinepathway geïdentificeerd in K. phaffii, maar de natuurlijke activiteit van deze pathway is niet voldoende om de celgroei te ondersteunen.
2.1.3 Verminderde tak van de TCA-cyclus (rTCA)
De gereduceerde TCA-cyclus (rTCA) is een CO2-fixatieroute die voorkomt in prokaryoten. rTCA is het omgekeerde proces van de geoxideerde TCA-cyclus en vormt één acetylco-enzym A-molecuul door twee CO2-moleculen te fixeren. Tot nu toe is de volledige omgekeerde TCA-cyclus nog niet gerealiseerd in gist. Gedeeltelijke rTCA werd gerealiseerd in Saccharomyces cerevisiae om barnsteenzuur en appelzuur te produceren. yan et al [5] overexpresseerden de genen die coderen voor de eerste drie enzymen van de Pyc2- en rTCA-cyclus, Mdh3R, EcFumC en FrdS1, in Pdc- en Fum1deficiënte stammen, wat resulteerde in een opbrengst van barnsteenzuur tot 13 g/L met een rendement van 0.21 mol/mol. malubhoy et al [ 5] synthetiseerden 35 g/L butaandizuur met een opbrengst van 0,63 mol/mol glycerol via de route van de rTCA-cyclus, terwijl het proces ook netto CO2-fixatie bereikte.
2.2 Onnodige decarboxylering vermijden
Biologische decarboxylering komt voornamelijk voor in katabole routes zoals glycolyse, de PPP en de TCA-cyclus, waar de reactie CO2 vrijmaakt en vaak gepaard gaat met oxidatie om NADH en NADPH te regenereren. Decarboxylering komt ook voor in eindproduct precursor metabolietroutes, waar decarboxyleringsreacties in de route allemaal de koolstofopbrengst van substraat naar product verminderen. Bijvoorbeeld, acetyl co-enzym A, een metaboliet geproduceerd door de decarboxyleringsreactie van pyruvaat, resulteert in een 33% verlies van koolstof in de vorm van CO2, wat de theoretische productopbrengst vermindert van elk proces dat acetyl co-enzym A als precursor heeft. Zoals de TCA-cyclus en de biosynthese van vetzuren en aminozuren. Om het koolstofverlies in acetyl co-enzym A synthese te overwinnen, hebben onderzoekers daarom de onnodige decarboxylatiestap vermeden door nieuwe koolstofretentie routes te ontwerpen.Hellgren et al [6] construeerden een cyclische koolstofconserveringsroute (GATHCYC) gebaseerd op de niet-oxidatieve glycolyse route (NOG), die drie moleculen acetyl co-enzym A genereert uit één molecuul fructose-6-fosfaat (F6P), en de route verliest geen koolstof. Het gebruik van deze route resulteerde in een toename van 109% in de productie van 3-hydroxypropionzuur. De introductie van de GATHCYC pathway in een n-butanol producerende stam resulteerde in een toename van de n-butanol productie tot 1,75 g/L en een 35,2% reductie in CO2 uitstoot.

3. Succinezuurproductie als voorbeeld
Naast redoxbalans en koolstofretentie zijn thermodynamische haalbaarheid en energiebalans sleutelfactoren bij het ontwerp van optimale metabolische routes. Thermodynamische haalbaarheid verwijst naar de Gibbs vrije energieverandering (ΔrG'm) onder fysiologisch relevante standaardomstandigheden en bepaalt of een metabolische route haalbaar is of niet. De celenergie moet ook in evenwicht zijn om meer van de doelverbinding te produceren, aangezien energievragende producten leiden tot verlies van substraatkoolstof om aan de energievraag te voldoen, terwijl geoxideerde producten leiden tot een energieoverschot en mogelijk tot warmteafvoer. Barnsteenzuur (SA) is een tussenstof in de TCA-cyclus. In dit hoofdstuk ligt de nadruk op verschillende strategieën voor de productie van SA en worden de ATP-stoichiometrie, redoxbalans, CO2-fixatie, thermodynamische haalbaarheid en koolstofbehoud beoordeeld voor verschillende natuurlijke en gemanipuleerde SA-syntheseroutes. Er zijn drie syntheseroutes voor barnsteenzuur: de oxidatieve TCA-cyclus (oTCA), de gereduceerde TCA-cyclus (rTCA) en de glyoxalaatroute (gS). oTCA-cyclus heeft een lagere theoretische maximale opbrengst, maar productie van barnsteenzuur onder aerobe omstandigheden heeft het voordeel van lage bijproducten en gunstigere thermodynamische metabolische eigenschappen. gS is een alternatieve methode voor de productie van barnsteenzuur die de twee decarboxyleringsstappen tussen isocitroenzuur en butaandiyl co-enzym A omzeilt om koolstofverlies te voorkomen en extra NADH te leveren. rTCA legt CO2 vast en is twee keer zo efficiënt als de oTCA-route. Het is belangrijk op te merken dat de opbrengst (YP) een lokale parameter is die alleen rekening houdt met de netto stoichiometrie in de route en geen rekening houdt met koolstofverlies tijdens de regeneratie van NAD(P)H of het genereren van ATP. De maximale theoretische opbrengst (YE) is echter een globale parameter die rekening houdt met de elektronenbalans en dus ook met de regeneratie van NAD(P)H. Daarom kan YP in sommige gevallen hoger zijn dan YE. De synthese van SA in de rTCA-cyclus wordt voornamelijk uitgevoerd door pensbacteriën onder anaerobe omstandigheden. Voor gist daarentegen is de rTCA-cyclus thermodynamisch ongunstig en resulteert in een onvoldoende toevoer van cellulair NADH. De volgende figuur vergelijkt de verandering in Gibbs vrije energie van SA-synthese via de oTCA-cyclus of de rTCA-cyclus met verschillende koolstofbronnen. Dit omvat glucose, glycerol, xylose via gedeeltelijke CBB-cyclus, assimilatie van mierenzuur of methanol via de gereduceerde glycinepadweg en assimilatie van methanol via de xyloglucaanfosfaatroute. Figuur 2. Productie van barnsteenzuur via de oxidatieve of reductieve tak van de TCA-cyclus
Het vermogen van gist om een lagere pH te verdragen en zo de kosten van SA-productie tijdens downstreamverwerking te verlagen, heeft ertoe geleid dat de productie van SA door gist veel aandacht heeft gekregen, vooral de rTCA-cyclus die CO2 kan fixeren. Hoewel de synthese van SA uit glucose via glycolyse en de rTCA-cyclus 1 mol CO2/mol SA kan fixeren, is de route niet redoxgebalanceerd en is er 1 mol NADH extra nodig voor elke 1 mol geproduceerde SA. Een aantrekkelijk alternatief is het gebruik van glycerol als koolstofbron, dat 1 mol CO2/mol SA kan fixeren via de rTCA-route, waardoor een oxidatief reductiegebalanceerde SA-productie mogelijk is. De totale reductie γ = 3,5 voor de combinatie van glycerol + CO2 is gelijk aan die van SA. Malubhoy et al [5] bereikten een opbrengst van 0,6 g/g glycerol door CO2 te fixeren, wat 47,1% van het theoretische maximum was.
Een andere manier om redoxevenwicht te bereiken is door glucose en CO2 als co-substraten te gebruiken. Als glycolyse, GATHCYC en gedeeltelijke TCA-cycli tegelijkertijd worden gebruikt, kan in theorie redoxevenwicht worden bereikt, waarbij 1 mol SA 0,5 mol CO2 vastlegt. 1 mol SA vereist echter het verbruik van 0,33 mol ATP ten koste van geregenereerd ATP, bijvoorbeeld door respiratie van een deel van de glucose. dit scenario moet daarom worden uitgevoerd onder ten minste licht aerobe omstandigheden, wat nog een kostenfactor aan het proces toevoegt.
Fig. 3 Redox-neutrale productie van butaandizuur door een combinatie van glycolyse, GATHCYC, gedeeltelijke TCA-cyclus en de glyoxylaatroute Tabel 1 Vergelijking van natuurlijke en gemanipuleerde routes voor de synthese van SA door gist

Waar kan ik voedingswaarde kopen? gist？

Als je gistprijs nodig hebt, vul dan je contactgegevens in op het formulier hieronder, we nemen meestal binnen 24 uur contact met je op. Je kunt me ook een e-mail sturen info@longchangchemical.com tijdens kantooruren (8:30 tot 18:00 UTC+8 ma. ~ za.) of gebruik de live chat op de website voor een snel antwoord.