탄소 효율은 경로 프로세스의 실행 가능성을 정의하는 주요 요인 중 하나이며, 단위 기질당 생성물의 비율을 결정하는 주요 요인입니다. 탄소 효율을 결정하는 두 가지 요인은 기질과 생성물의 환원 정도에서 계산할 수 있는 기질에서 생성물까지의 전자 균형과 기존 대사 경로가 주로 높은 탄소 수율보다는 높은 반응 속도를 위해 설계되었다는 사실입니다. 첫 번째 요인은 기질 및 생성물의 화학적 구성과 밀접한 관련이 있습니다. 두 번째 요인은 대사 경로를 재설계하여 제품 형성 과정에서 기질의 탄소가 유지되거나 경우에 따라 동화될 수 있도록 함으로써 극복할 수 있습니다.

1. 산화 환원 균형 효모 대사 화학 물질의 효율적인 생물학적 생산에 필요한 대사 경로의 효율성은 산화 환원 균형, 에너지 균형, 열역학적 타당성, 화학량 론적 평형, 플럭스 결합, 피드백 억제, 생성물 독성, 동역학 등과 같은 다양한 요인에 따라 달라집니다. 세포 대사는 전자를 기질에서 다른 대사산물로 전달하여 세포 성장과 산화 환원 균형이 유지되도록 합니다. 따라서 원하는 대사산물을 생산하기 위한 최적의 생합성 경로는 산화 환원 중립적이어야 하며, 경로 수율(YP)은 기질-표적 제품 조합의 최대 이론적 수율(YE)에 근접하거나 이에 매우 근접해야 합니다.YP는 관련된 경로에 따라 달라지며 화학량론에 따라 결정되는 반면, YE는 기판에서 형성될 수 있는 최대 생성물의 양이며 기판 대 생성물 비율 γS/γP에서 계산할 수 있으며 여기서 γS와 γP는 각각 기판과 생성물의 환원 정도입니다. 환원 정도는 화합물의 탄소 원자당 사용 가능한 전자 등가물의 수로 정의할 수 있습니다. 따라서 YE는 기질을 생성물로 전환하기 위해 전자 균형을 고려해야 하며, 이는 탄소 손실로 이어지는 탈카르복실화 또는 추가적인 탄소 흡수를 제공하는 카르복실화가 필요할 수 있습니다. 다음 그림은 효모 중심 대사 경로를 보여줍니다. 그림 1. 효모 중심 탄소 대사 경로, 카르복실화/탈카복실화 단계와 기질 및 생성물 환원 정도 변화 사이의 관계를 강조 표시합니다. 해당 기질, 중간 대사산물 및 생성물의 환원 정도는 빨간색(γ=0)에서 노란색(γ=4), 파란색(γ=6)으로의 색상 변화로 표시됩니다.
기질과 목표 제품의 환원 정도에 따라 세 가지 경우로 나눌 수 있습니다. 기질과 목표 제품이 동일한 환원 정도를 갖는 경우 기질이 완전히 제품으로 전환되는 이상적인 상황이 있습니다. 즉, 실제 제품 수율은 최대 이론적 수율(YE)에 근접할 수 있지만 대사 과정에서 바이오매스 형성 및 세포 성장 유지를 위한 부산물이 생성되어 제품 수율이 감소합니다. 예를 들어 젖산(γ = 4.0)은 포도당(γ = 4.0)과 같은 정도의 감소를 보입니다. 따라서 젖산염의 생산 과정은 균형 잡힌 화학량 론식을 가진 산화 환원 중립 경로인 동시에 ATP 생성을 허용하여 이론적 최대 수율에 가까운 속도를 제공합니다. 전반적으로 다른 기질 생산물의 경우 과도한 환원 전력을 생성하지 않는 이러한 경로를 찾는 것은 드뭅니다.
생성물이 기질보다 더 많이 환원되면 생성물을 형성하는 데 필요한 산화 반응으로 인해 추가적인 산화 등가물(NAD+, NADP+, FADH+)이 생성됩니다. 이러한 산화 등가물을 줄이기 위해 세포는 산화 환원 항상성을 유지하기 위해 탄소를 CO2 및/또는 기타 부산물(예: 펜토오스 인산염 경로(PPP), TCA 주기 또는 자일룰로스 인산염(XuMP) 주기)로 산화시켜야 합니다. 이 과정은 기질을 표적 제품으로 전환하는 전반적인 효율성에 영향을 미칠 수 있습니다. 예를 들면 지방산, 에탄올, 글리세롤 등이 있습니다.
팔미트산(γ = 5.75)과 같은 지방산을 생성하기 위해 포도당을 기질로 사용하면 높은 NADPH 요구량과 탄소 사슬 연장 중 CO2 방출로 인해 기질 손실로 이어져 지방산 수율이 감소합니다. Yu 등[1]은 반복적인 탈탄산화 주기를 특징으로 하는 동화 환원 대사 경로를 구축하여 세포에 추가 NADH, NADPH 및 ATP를 공급함으로써 사카로미세스 세레비지에에서 최대 40%로 지방산 수율을 높이는 데 성공했습니다.
포도당에서 에탄올을 생산할 때도 NADH를 공급해야 하기 때문에 일부 기질을 CO2와 글리세롤로 산화시킵니다. 그러나 에탄올을 발효하는 천연 효모 경로는 포도당의 환원 정도(γ = 4.0)를 유지하며, CO2와 에탄올이 최종 생성물일 때 전체 평균 환원율은 γ = 4.0이므로 수율 측면에서 매우 효율적인 대사 경로로, 탄소원의 4-5%만 글리세롤로 전환합니다. 마찬가지로 글리세롤(γ=4.66)을 유일한 탄소원으로 사용하여 맥주 효모에서 1,2-프로판디올(1,2-PDO)(γ=5.33)을 생산할 때 대사 공학적 변형은 1,2-PDO 합성을 촉진하기 위해 추가적인 NADH를 제공하여 효모에서 현재까지 4g/L 이상의 1,2-PDO의 최고 수율을 달성했습니다.
제품이 기질 아래로 환원되면 제품 생산 과정에서 환원 등가물과 제품이 모두 생성됩니다. 과잉 환원 등가물을 재산화하는 일반적인 메커니즘은 호흡 사슬에 의한 산화, 과잉 ATP 생성 및/또는 열 방출을 통해 이루어집니다. 결과적으로 제품 수율은 사용 가능한 전자로 달성할 수 있는 이론적 최대치보다 낮습니다. 또는 초과 환원 등가물은 탄소원의 일부를 환원 부산물로 환원하여 소비할 수 있습니다. 이 기질-생성물 조합은 탄소를 고정하여 목표 대사 산물의 수율을 높일 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 포도당에서 구연산(γ = 3.0)을 생산할 때와 마찬가지로, NADH의 형성으로 인한 에너지 파급은 세포가 수율 손실을 감수하고 목표 화합물을 만들어 에너지를 얻을 수 있음을 의미합니다. 따라서 구연산 합성을 위한 자연 생화학적 경로의 효율성이 낮다는 것은 탄소를 고정하여 얻을 수 있는 최대 이론적 이득률에 근접할 수 있는 기회를 의미합니다.
따라서 원하는 제품에 사용할 기질은 수율을 극대화하는 γS 및 γP를 기준으로 선택할 수 있습니다. 효모가 선호하는 기질인 포도당은 에탄올(CO2 포함) 또는 젖산과 같이 포도당과 동일한 γ를 가진 제품을 합성하는 데 사용할 수 있습니다. 포도당이 선호되는 기질이지만 포도당은 식품 또는 사료 생산과 직접적으로 경쟁합니다. 따라서 글리세롤, 메탄올 및 CO2와 같은 몇 가지 저렴한 탄소 공급원이 유망한 기질로 간주됩니다.
메탄올(γ = 6.0)은 환원도가 높은 C1 공급 원료입니다. 메탄올을 탄소 공급원으로 사용하는 주요 장점 중 하나는 메틸영양 효모와 같은 미생물에서 NADH를 형성하고 ATP를 생성하는 환원력인데, 경로의 첫 번째 반응은 산소를 전자 수용체로 사용하여 메탄올을 포름알데히드로 산화시키기 때문에 효모는 메탄올을 섭취할 때마다 하나의 NADH를 잃게 됩니다.최근 연구에 따르면 코마가타텔라 파피는 알코올 산화효소 결핍 균주(Mut-)에서 내인성 메탄올 탈수소효소(Adh2)를 과발현하여 메탄올을 더 효율적으로 활용할 수 있었고, 그 결과 메탄올의 일부당 추가 NADH와 ATP를 생산할 수 있었으며 이를 통해 Mut-Adh2 균주는 낮은 산소 소비 및 열 방출 조건에서 이종 단백질의 생산 강도를 높일 수 있게 되었습니다.
또 다른 유망한 탄소 공급원은 CO2로, 자생균이 생합성을 위한 유기 화합물을 생산하기 위해 환원할 수 있는 고도로 산화된 화합물(γ=0)입니다. 따라서 효모 대사에 CO2를 도입하는 한 가지 방법은 공동 기질 전환으로, 다른 탄소원과 함께 CO2를 공동 기질보다 환원도가 낮은 생성물로 전환하는 것입니다. 구연산, 말레산 및 숙신산과 같이 포도당보다 γ가 낮은 유기산의 생합성에서 이 전략을 사용하면 산업 발효 공정에 CO2를 통합하여 탄소 수율을 높일 수 있습니다.

2. 제품 감소의 균형을 맞추는 방법은 무엇인가요? 미생물의 대사 과정의 진화는 일반적으로 특정 생성물의 생산보다는 세포의 빠른 성장에 기반합니다. 따라서 세포는 높은 탄소 생산량보다 빠른 신진대사를 선호합니다. 따라서 대사 과정에서 세포의 탄소 보유 능력을 개선하는 것은 대사 공학에서 가장 큰 과제 중 하나이며, 이는 미생물 공장에서 고수율 화학 생산을 달성하는 데 방해가 됩니다. 이 백서에서는 세포에서 필수적이지 않은 탈탄산화 단계를 피하고 CO2 고정을 포함하여 탄소 보유를 극대화하는 것을 목표로 하는 효모의 대사 공학에 대해 설명합니다.2.1 CO2를 기질로 사용하여 세포 대사에 무기 탄소 통합 CO2 분자는 카르복실화에 의해 유기 화합물을 형성하고 CO2는 환원에 의해 포름산 또는 CO로 전환되어 바이오매스로 동화될 수 있는 다양한 경로가 있습니다. 카르복실화 반응은 카르복실화 효소에 의해 촉매됩니다. 예를 들어, 자가 영양성 CO2 고정 경로의 CBB 사이클에서 RuBisCO 또는 중앙 대사 전구체 제공에 관여하는 경로 효소인 Pck 및 Pyc.2 탄소 환원 원리는 감소된 아세틸 코엔자임 A 경로에서와 같이 포메이트 탈수소효소 또는 CO 탈수소효소에 의해 CO2가 포름산 또는 CO로 환원된다는 것입니다..1.1 효모 에탄올 생산에서 CO2 고정을 위한 이종 CBBase 효소의 발현 S. 세레비지애 에탄올 생산에서 과달루페-메디나 등[2]은 CO2를 전자 수용체로 사용하여 과도한 환원력을 활용했습니다, CBB 순환 경로 효소인 RuBisCO와 Prk에 의해 CO2가 PPP 경로 중간 대사 산물인 Ru5P로 전환되어 에탄올 생산이 10% 증가하고 부산물인 글리세롤 생산이 90% 감소하는 결과를 얻었습니다.Xia 등 [3]은 자일로오스가 에탄올 생산의 기질로 사용될 때 혐기 발효 중에 산화 환원 불균형이 발생한다는 것을 발견했습니다. RrRuBisCO 및 SoPRK의 발현은 피루 베이트 탈 카르 복실 화로부터 CO2의 재사용을 가능하게하고 부산물 자일리톨과 글리세롤의 수율을 감소 시켰습니다 .Gassler 등[4]은 메탄올을 통해 에너지와 환원력을 제공하고 CO2를 탄소원으로 사용하여 젖산과 말로 네이트를 생산하는 메틸 영양 효모 K. phaffii에서 기능성 CBB 사이클을 구성했습니다 .2.1.2 환원 글리신 경로
환원 글리신 경로는 포름산을 사용하는 호기성 성장에 가장 효율적인 경로로 간주되며, 프로 글리신 경로의 모든 효소는 S. 세레비지에 존재하지만 포름산을 성장의 기질로 사용할 수 없습니다. 내인성 경로 효소의 과발현은 글리신 결핍 균주의 성장을 유지하기 위해 포름산과 CO2를 공동 기질로 사용하여 글리신을 합성할 수 있는 환원 글리신 경로의 기능적 발현을 초래했습니다. 이 경로는 고농도의 CO2(10%)에 의존합니다. 최근 K. 파피에서 자연적으로 산소에 저항하는 환원 글리신 경로가 확인되었지만, 이 경로의 자연 활성은 세포 성장을 지원하기에 충분하지 않습니다.
2.1.3 TCA 사이클의 감소된 분기(rTCA)
환원된 TCA 순환(rTCA)은 원핵생물에서 발견되는 CO2 고정 경로로, 산화 TCA 순환의 역방향 과정이며 두 개의 CO2 분자를 고정하여 하나의 아세틸 코엔자임 A 분자를 형성합니다. 지금까지 효모에서 완전한 역 TCA 사이클은 실현되지 않았습니다. 사카로미세스 세레비지애에서 숙신산과 말산을 생산하기 위해 부분적인 rTCA가 실현되었습니다. yan 등[5]은 Pyc2 및 rTCA 사이클의 처음 세 가지 효소인 Mdh3R, EcFumC, FrdS1을 암호화하는 유전자를 Pdc 및 Fum1 결핍 균주에서 과발현하여 수율 13g/L의 숙신산을 최대 0 몰로 생산했습니다.말루보이 등[5]은 rTCA 순환 경로를 통해 0.63 mol/mol 글리세롤의 수율로 35 g/L의 부탄디옥산을 합성했으며, 이 과정에서 순 CO2 고정도 달성했습니다.
2.2 불필요한 탈카르복실화 방지
생물학적 탈카르박실화는 주로 해당 과정, PPP 및 TCA 순환과 같은 이화 작용 경로에서 발생하며, 이 반응은 CO2를 방출하고 종종 NADH 및 NADPH를 재생하는 산화와 관련이 있습니다. 또한 탈카르박실화는 최종 생성물 전구체 대사체 경로에서 발생하는데, 이 경로에서 탈카르박실화 반응은 모두 기질에서 생성물로의 탄소 수율을 감소시킵니다. 예를 들어 피루브산의 탈카르복실화 반응에 의해 생성되는 대사산물인 아세틸 코엔자임 A는 CO2 형태로 33%의 탄소 손실을 초래하여 아세틸 코엔자임 A를 전구체로 사용하는 모든 공정의 이론적 제품 수율을 감소시킵니다. TCA 사이클, 지방산 및 아미노산 생합성 등이 이에 해당합니다. 따라서 아세틸 코엔자임 A 합성의 탄소 손실을 극복하기 위해 연구자들은 새로운 탄소 보존 경로를 설계하여 불필요한 탈카르박실화 단계를 피했으며, 헬그렌 등[6]은 과당 6-인산(F6P) 한 분자에서 아세틸 코엔자임 A 세 분자를 생성하는 비산화 해당 경로(NOG)를 기반으로 순환 탄소 보존 경로(GATHCYC)를 구축했으며 이 경로에서 탄소가 손실되지 않습니다. 이 경로를 사용한 결과 3-하이드록시프로피온산 생산이 109% 증가했습니다. n-부탄올 생산 균주에 GATHCYC 경로를 도입한 결과 n-부탄올 생산량이 1.75g/L로 증가했고 CO2 배출량은 35.2% 감소했습니다.

3. 숙신산 생산의 예
산화 환원 균형과 탄소 보유량 외에도 열역학적 타당성과 에너지 균형은 최적의 대사 경로를 설계하는 데 있어 핵심적인 요소입니다. 열역학적 타당성은 생리적으로 관련된 표준 조건에서 깁스 자유 에너지 변화(ΔrG'm)를 의미하며 대사 경로의 실현 가능 여부를 결정합니다. 에너지가 많이 필요한 제품은 에너지 수요를 충족하기 위해 기질 탄소 손실을 초래하고, 산화 제품은 에너지 과잉 및 열 방출로 이어지기 때문에 목표 화합물을 더 많이 생산하려면 세포 에너지의 균형도 맞춰야 합니다. 숙신산(SA)은 TCA 사이클의 중간 대사 산물입니다. 이 섹션에서는 SA의 생산을 위한 다양한 전략에 초점을 맞추고, 다양한 자연 및 공학적인 SA 합성 경로에 대해 ATP 화학량론, 산화 환원 균형, CO2 고정, 열역학적 타당성 및 탄소 보존을 평가합니다. 숙신산의 합성 경로는 산화 TCA(oTCA) 사이클, 환원 TCA(rTCA) 사이클, 글리옥살레이트 경로(GS)의 세 가지가 있습니다. oTCA 사이클은 이론적 최대 수율이 낮지만 호기성 조건에서 숙신산을 생산하면 부산물이 적고 열역학적 대사 특성이 더 유리한 이점이 있습니다. gS는 이소시트산과 부티릴 코엔자임 A 사이의 두 탈카르복실화 단계를 우회하여 탄소 손실을 방지하고 추가적인 NADH를 제공하는 숙신산 생산의 대체 방법입니다. rTCA는 CO2를 고정하고 oTCA 경로보다 두 배 더 효율적입니다. 수율(YP)은 경로의 순 화학량론만을 고려하는 국부적인 파라미터이며, NAD(P)H 재생 또는 ATP 생성 중 탄소 손실을 고려하지 않는다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 그러나 최대 이론적 수율(YE)은 전자 균형을 고려하는 글로벌 파라미터이므로 NAD(P)H의 재생도 고려합니다. 따라서 경우에 따라 YP가 YE보다 높을 수 있습니다. SA의 rTCA 사이클 합성은 주로 혐기성 조건에서 반추위 박테리아에 의해 수행됩니다. 이와 대조적으로 효모의 경우 rTCA 주기는 열역학적으로 불리하며 세포 NADH의 공급이 불충분합니다. 다음 그림은 다양한 탄소 공급원에 따른 oTCA 사이클 또는 rTCA 사이클을 통한 SA 합성의 깁스 자유 에너지 변화를 비교한 것입니다. 여기에는 포도당, 글리세롤, 부분 CBB 순환을 통한 자일로스, 환원 글리신 경로를 통한 포름산 또는 메탄올의 동화, 자일로글루칸 인산염 경로를 통한 메탄올의 동화가 포함됩니다. 그림 2. TCA 순환의 산화 또는 환원 경로를 이용한 숙신산 생산
효모가 낮은 pH를 견디는 능력으로 인해 다운스트림 처리 과정에서 SA 생산 비용을 절감할 수 있기 때문에 효모에 의한 SA 생산, 특히 CO2를 고정할 수 있는 rTCA 사이클이 널리 주목을 받고 있습니다. 해당 과정과 rTCA 순환 경로를 통해 포도당으로부터 SA를 합성하면 1몰 CO2/mol SA를 고정할 수 있지만, 이 경로는 산화 환원 균형이 맞지 않으며 생산된 SA 1몰당 추가로 1몰 NADH가 필요합니다. 매력적인 대안은 글리세롤을 탄소원으로 활용하는 것으로, 이는 rTCA 경로를 통해 1몰 CO2/mol SA를 고정하여 산화 환원 균형이 맞는 SA 생산을 가능케 합니다. 글리세롤 + CO2 조합의 총 환원율 γ = 3.5는 SA의 환원율과 동일합니다. Malubhoy 등[5]은 CO2를 고정하여 글리세롤 0.6g/g의 수율을 달성했는데, 이는 이론적 최대치인 47.1%에 해당합니다.
산화 환원 평형을 달성하는 또 다른 방법은 포도당과 CO2를 공동 기질로 활용하는 것입니다. 해당 과정, GATHCYC 및 부분 TCA 사이클을 동시에 활용하면 이론적으로 1몰의 SA가 0.5몰의 CO2를 고정하여 산화 환원 평형을 달성할 수 있지만 1몰의 SA는 포도당의 일부 호흡을 통해 재생된 ATP의 비용으로 0.33몰의 ATP를 소비해야 합니다. 따라서 이 시나리오는 적어도 약간 호기성 조건에서 수행되어야 하며, 이는 공정의 또 다른 비용 요소를 추가하는 요소입니다.
그림 3 해당 과정, GATHCYC, 부분 TCA 사이클, 글리옥실레이트 경로의 조합을 통한 부탄디옥산의 산화 환원 중성 생산 표 1 효모의 SA 합성을 위한 자연적 경로와 공학적 경로 비교

영양제는 어디서 구입할 수 있나요? 효모？

효모 가격이 필요한 경우 아래 양식에 연락처 정보를 입력해 주시면 보통 24시간 이내에 연락드리겠습니다. 이메일을 보내셔도 됩니다. info@longchangchemical.com 근무 시간(오전 8시 30분~오후 6시, 월~토요일)에 문의하거나 웹사이트 라이브 채팅을 이용하면 신속하게 답변을 받을 수 있습니다.