{"id":7247,"date":"2024-08-14T09:18:36","date_gmt":"2024-08-14T09:18:36","guid":{"rendered":"https:\/\/longchangchemical.com\/?p=7247"},"modified":"2026-04-28T10:42:33","modified_gmt":"2026-04-28T10:42:33","slug":"protease-and-enzyme-engineering","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/longchangchemical.com\/it\/protease-and-enzyme-engineering\/","title":{"rendered":"Ingegneria delle proteasi e degli enzimi"},"content":{"rendered":"

Ingegneria delle proteasi e degli enzimi<\/strong><\/h1>\n

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Quick answer:<\/strong> Enzyme and food-processing ingredients are usually selected by substrate fit, pH and temperature window, dosage, and whether the end-use specification is acceptable for the target process. The strongest commercial choice is the one that performs consistently under real processing conditions.<\/p>\n

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1. Ingegneria delle proteine: si basa sullo studio della relazione tra struttura e funzione delle proteine, sull'uso della tecnologia di ingegneria genetica o di modifica chimica per trasformare le proteine esistenti in nuove proteine della moderna biotecnologia.
\n2. ingegneria enzimatica: l'uso di enzimi, organelli o funzioni catalitiche specifiche di una cellula, attraverso un reattore appropriato per la produzione industrializzata di prodotti umani o per raggiungere uno scopo particolare di una scienza tecnica.
\n3. I principali contenuti della ricerca sull'ingegneria degli enzimi: 1) ingegneria chimica degli enzimi 2) ingegneria biologica degli enzimi 3) enzimi e cellule immobilizzate 4) reattori e sensori enzimatici 5) catalisi degli enzimi in fase non acquosa
\n4. Fusione di proteine: ricombinazione di parte del gene che codifica per una proteina con un altro gene proteico, o combinazione di frammenti di geni proteici diversi per produrre nuove proteine di fusione mediante clonazione ed espressione genica.
\n5. Il ruolo della fusione proteica: 1) per l'isolamento e la purificazione del prodotto di espressione; 2) per migliorare la solubilit\u00e0 del prodotto di espressione; 3) per migliorare la stabilit\u00e0 della proteina.
\n6. Cristallografia delle proteine: l'ingegneria dello studio strutturale delle macromolecole biologiche mediante la tecnologia della diffrazione dei raggi X, una parte importante della biologia strutturale.
\n8. mutazione mirata: la sequenza nucleotidica locale di un gene specifico viene alterata in modo mirato mediante clonazione molecolare, solitamente utilizzata per studiare la struttura funzionale delle proteine e per modificare le proteine bersaglio.
\n10. Ambito di ricerca dell'ingegneria enzimatica:
\n1) Sviluppo e produzione di vari tipi di enzimi naturali;
\n2) Isolamento e purificazione degli enzimi e tecniche di identificazione;
\n3) Tecniche di immobilizzazione;
\n4) Impollinazione incrociata con altri settori della biotecnologia;
\n5) sviluppo e applicazione di reattori multienzimatici.
\n11. Stabilit\u00e0 e stabilizzazione degli enzimi:
\n(i) Cause di inattivazione degli enzimi:
\n(1) Alcuni specifici residui aminoacidici nel centro attivo dell'enzima vengono modificati chimicamente, in modo da perdere l'attivit\u00e0 enzimatica (microscopica);
\n(2) Influenza dell'ambiente esterno, barriere spaziali nel centro attivo dell'enzima, in modo che non possa legarsi al substrato;
\n3) cambiamenti nella struttura superiore dell'enzima (cambiamenti nell'elica e nel ripiegamento);
\n4) rottura della catena polipeptidica (molto forte);
\n(ii) Stabilizzazione dell'enzima:
\n(1) conservazione a bassa temperatura (l'enzima stesso non \u00e8 denaturato, non \u00e8 facile per altri enzimi degradare la proteina target);
\n2) Aggiunta di sali (alta concentrazione di (NH4)2SO4);
\n3) Aggiunta di ligandi come i coenzimi del substrato;
\n4) aggiunta di forti denaturanti (per proteggere la struttura primaria e ravvivarla quando viene utilizzata);
\n5) cristallizzazione.
\n12. Superiorit\u00e0 dei microrganismi come fonti di enzimi:
\n1) Facile accesso agli enzimi necessari per gli enzimi;
\n2) facile accesso a ceppi ad alto rendimento;
\n3) ciclo di produzione breve;
\n4) bassi costi di produzione;
\n5) facilit\u00e0 di gestione della produzione;
\n6) Pi\u00f9 modi per migliorare la produzione di enzimi microbici.<\/p>\n

13. Enzima immobilizzato: si riferisce all'enzima che esiste in un certo spazio in uno stato bloccato, in grado di svolgere continuamente la reazione; l'enzima pu\u00f2 essere recuperato e riutilizzato dopo la reazione.
\n14. Vantaggi dell'enzima immobilizzato:
\n1) \u00c8 estremamente facile separare l'enzima immobilizzato dal prodotto e dal substrato;
\n2) Pu\u00f2 eseguire reazioni batch ripetute e colonne caricate in una reazione continua per un lungo periodo di tempo;
\n3) la capacit\u00e0 di aumentare la stabilit\u00e0 dell'enzima nella maggior parte dei casi;
\n4) il processo di reazione dell'enzima pu\u00f2 essere strettamente controllato;
\n(5) Nessun residuo di enzima nella soluzione del prodotto, semplificando il processo di purificazione;
\n6) \u00c8 pi\u00f9 adatto alla reazione multienzimatica rispetto all'enzima libero;
\n7) la resa del prodotto pu\u00f2 essere aumentata e la qualit\u00e0 del prodotto pu\u00f2 essere migliorata; 8) l'efficienza dell'uso dell'enzima \u00e8 migliorata e il costo \u00e8 ridotto.
\n15. Svantaggi dell'enzima immobilizzato:
\n1) L'immobilizzazione comporta una perdita di attivit\u00e0 enzimatica;
\n2) Aumento dei costi di produzione e ingenti investimenti iniziali nell'impianto;
\n3) pu\u00f2 essere utilizzato solo per substrati solubili ed \u00e8 pi\u00f9 adatto per substrati di piccole molecole;
\n4) Non \u00e8 adatto per le reazioni multienzimatiche rispetto ai batteriofagi intatti, soprattutto quelle che richiedono cofattori;
\n5) le procedure di separazione a cui devono essere sottoposti gli enzimi intracellulari.
\n16. Principi di preparazione degli enzimi immobilizzati:
\n1) Bisogna fare attenzione a mantenere l'attivit\u00e0 catalitica e la specificit\u00e0 dell'enzima;
\n2) L'immobilizzazione deve favorire l'automazione e la continuit\u00e0 della produzione;
\n(3) L'enzima immobilizzato deve avere la minima resistenza spaziale del sito, per non ostacolare la vicinanza tra carbone e substrato, al fine di migliorare la resa del prodotto;
\n4) L'enzima e il carrier devono avere una forte forza di legame in modo che l'enzima immobilizzato possa essere recuperato e la conservazione faciliti l'uso ripetuto;
\n(5) L'enzima immobilizzato deve avere la massima stabilit\u00e0 e il vettore selezionato non deve reagire chimicamente con il prodotto di scarto o la soluzione di reazione;
\n(6) Il costo dell'enzima immobilizzato deve essere basso e favorire l'uso industriale.
\n17. Metodi di immobilizzazione degli enzimi:
\n(i) Metodo di legame non covalente:
\n(1) metodo di cristallizzazione: applicabile agli enzimi con bassa attivit\u00e0 enzimatica, la concentrazione cambia dopo la cristallizzazione e non vi \u00e8 perdita nell'uso costante e continuo;
\n(2) metodo di decomposizione: l'enzima viene trasformato in polvere secca, che si disperde nella fase insolubile in acqua, anche se la polvere secca \u00e8 sospesa nel solvente; vantaggio: il recupero \u00e8 pi\u00f9 conveniente, svantaggio: la polvere secca \u00e8 facile da assorbire acqua, le particelle diventano pi\u00f9 grandi, l'attivit\u00e0 si riduce e la vitalit\u00e0 dell'enzima nei solventi organici ne risente;
\n(3) Adsorbimento fisico: metodo in cui l'enzima viene fisicamente adsorbito su un vettore insolubile; vantaggio: il centro attivo dell'enzima non viene facilmente distrutto, minori cambiamenti nella struttura senior, minore perdita di attivit\u00e0 enzimatica, adatto anche per le cellule immobilizzate; svantaggio: debole interazione tra l'enzima e il vettore, l'enzima \u00e8 facile da staccare;
\n(4) Legarsi al vettore idrosolubile attraverso il legame ionico; vantaggi: funzionamento semplice, condizioni miti, la struttura senior e il centro attivo non possono essere distrutti, applicabile anche alle cellule immobilizzate; svantaggi: la forza di legame tra il vettore e l'enzima \u00e8 pi\u00f9 debole, il tampone anionico o cationico, la concentrazione ionica dell'influenza del maggiore, l'enzima \u00e8 pi\u00f9 incline a staccarsi dal vettore;
\n(ii) Metodo di legame chimico:
\n(1) metodo di legame covalente: l'enzima e il vettore si legano in modo covalente; metodo: l'attivazione del gene legato al vettore, e poi la reazione di accoppiamento con i geni legati all'enzima, nel legame del vettore \u00e8 relativamente forte, in genere non sar\u00e0 fissa la concentrazione di substrato cambia e cambia; svantaggi: le condizioni di reazione sono pi\u00f9 intense, spesso portano a cambiamenti nella struttura di alto livello, la distruzione del centro attivo, \u00e8 applicabile solo per l'immobilizzazione dell'enzima, non \u00e8 adatto per l'immobilizzazione della cellula;
\n(2) Metodo di reticolazione: si utilizza un reagente multifunzionale o un reagente bifunzionale, in modo che l'enzima e l'enzima o i microrganismi e le cellule microbiche siano immobilizzati mediante reticolazione, generalmente riducendo la concentrazione dell'agente reticolante e il tempo di reazione per mantenere l'attivit\u00e0 enzimatica;
\n(iii) Metodo di incorporazione:
\n(1) tipo a griglia: l'enzima o i microrganismi sono incorporati in una griglia fine di gel polimerico, questo metodo \u00e8 l'immobilizzazione delle cellule microbiche con pi\u00f9 metodi; vantaggi: non \u00e8 necessario combinare con la reazione enzimatica la proteina, il tasso di recupero dell'attivit\u00e0 enzimatica \u00e8 elevato;
\n(2) tipo microcapsula: la molecola dell'enzima \u00e8 incapsulata in una capsula, la membrana polimerica \u00e8 semipermeabile, questa capsula \u00e8 impermeabile e pu\u00f2 esistere in una fase organica anidra.
\n18. Propriet\u00e0 degli enzimi immobilizzati:
\n(i) Variazione dell'attivit\u00e0 enzimatica dopo l'immobilizzazione:
\nCause: 1) La conformazione spaziale della molecola dell'enzima cambia durante l'immobilizzazione, influenzando anche gli amminoacidi del centro attivo;
\nLa libert\u00e0 spaziale della molecola dell'enzima \u00e8 limitata dopo l'immobilizzazione, il che influisce direttamente sull'effetto vacuolare del centro attivo sul substrato;
\nLa resistenza alla diffusione interna rende difficile l'avvicinamento delle molecole di substrato al centro attivo;
\nQuando \u00e8 incorporato, l'enzima \u00e8 circondato da una membrana polimerica semipermeabile e il substrato macromolecolare non pu\u00f2 avvicinarsi all'enzima attraverso la membrana;
\nEffetto dell'immobilizzazione sulla stabilit\u00e0 dell'enzima:
\nLa stabilit\u00e0 termica aumenta;
\n2) Maggiore stabilit\u00e0 ai vari reagenti organici e ai reagenti enzimatici;
\n(3) La stabilit\u00e0 a diversi valori di pH, la stabilit\u00e0 della proteasi, la stabilit\u00e0 allo stoccaggio e la stabilit\u00e0 operativa hanno un impatto;
\n(4) Le ragioni della maggiore stabilit\u00e0 dell'enzima immobilizzato: l'enzima immobilizzato e il vettore possono essere collegati in pi\u00f9 punti, impedendo alla molecola di proteasi di allungarsi e deformarsi; la vitalit\u00e0 dell'enzima pu\u00f2 essere alleggerita dopo l'immobilizzazione e rilasciata; l'autodegradazione dell'enzima pu\u00f2 essere inibita;
\n(iii) La temperatura ottimale cambia -- aumenta;
\n(iv) Variazione ottimale del pH: ampliamento dell'intervallo;
\n(v) Variazione di Km (variazione della costante di Mie -- diventa pi\u00f9 piccola, l'affinit\u00e0 aumenta).
\n19.Metodi di immobilizzazione:
\n1) La co-immobilizzazione di coenzima ed enzima nello stesso vettore d\u00e0 luogo a un sistema permanentemente privo di coenzima aggiuntivo;
\n2) immobilizzare il coenzima direttamente sulla molecola dell'enzima.
\n20. immobilizzazione cellulare: cellule che non possono muoversi liberamente, cio\u00e8 che sono vincolate o limitate a determinati confini spaziali da fattori fisici, chimici o di altro tipo, ma che mantengono comunque l'attivit\u00e0 catalitica e la vitalit\u00e0 per essere utilizzate ripetutamente e continuamente.
\n1. Vantaggi e svantaggi dell'immobilizzazione cellulare:
\nVantaggi: 1) Le cellule immobilizzate mantengono lo stato originale e l'ambiente naturale del sistema enzimatico intracellulare e sono quindi pi\u00f9 stabili;
\nMantenere il sistema multienzimatico originale nella cellula, per il vantaggio catalitico multi-step \u00e8 pi\u00f9 evidente, non \u00e8 necessario rigenerare il coenzima;
\nVantaggi pi\u00f9 evidenti per la fermentazione a cellule proliferanti immobilizzate; l'alta densit\u00e0 di cellule immobilizzate, in grado di proliferare, abbrevia il ciclo di produzione della fermentazione; la buona stabilit\u00e0 della fermentazione, che pu\u00f2 essere ripetuta per un periodo di tempo pi\u00f9 lungo per un uso continuo; il brodo di fermentazione contiene un minor numero di organismi \u00e8 favorevole all'isolamento e alla purificazione del prodotto per migliorare la qualit\u00e0 del prodotto;
\nSvantaggi: 1) La presenza di una variet\u00e0 di enzimi nella cellula forma sottoprodotti indesiderati;
\nLa presenza di membrane cellulari, pareti cellulari e anche di vettori pu\u00f2 costituire una limitazione alla diffusione;
\n3) la dimensione dei pori formati dal supporto influisce sulla permeabilit\u00e0 del substrato polimerico.
\n2. modificazione chimica: quando la struttura covalente di una proteina viene alterata dall'inclusione o dalla rimozione di un gene chimico, ci si riferisce a questo fenomeno come modificazione chimica.
\n3. Fattori che influenzano la reattivit\u00e0 dei gruppi funzionali delle proteine: 1) polarit\u00e0 delle microregioni: 2) effetto del legame idrogeno; 3) effetto elettrostatico; 4) effetto di blocco del sito.
\n4. Iper-reattivit\u00e0 a livello funzionale della proteina enzimatica: si riferisce a un gene della catena laterale della proteina e a singoli reagenti che possono provocare una reazione rapida.
\n5. Fattori che influenzano l'iperreattivit\u00e0: 1) alterazione del valore pK della funzione proteica; 2) maggiore reattivit\u00e0 del gruppo funzionale della proteina; 3) attrazione del reagente da parte di interazioni elettrostatiche e corretto orientamento; 4) adattamenti stereochimici tra il reagente e le regioni proteiche vicine al sito di modificazione.
\n6. Determinanti della reattivit\u00e0 del modificatore: 1) adsorbimento selettivo; 2) interazioni elettrostatiche; 3) fattori di blocco del sito; 4) fattori catalitici: 5) polarit\u00e0 della microregione (polarit\u00e0 dell'ambiente locale).
\n7. Controllo della specificit\u00e0 della reazione di modifica:
\n(i) Selezione dei reagenti:
\n(1) Esistono diversi casi di modifica degli amminoacidi:
\na. Modifica di tutti i gruppi amminici senza modificare altri geni;
\nb.Modifica del gruppo alfa-amminico mediante contro-modifica;
\nc. modifica del gruppo amminico con attivit\u00e0 catalitica; d. modifica dello stato di carica e della solubilit\u00e0 delle proteine; per modificare lo stato di carica delle proteine scegliere reagenti in grado di trasportare la carica massima in condizioni neutre; per modificare la solubilit\u00e0 delle proteine la reazione avviene in acqua, la scelta dei reagenti chimici per la solubilit\u00e0 in acqua; 3) determinazione quantitativa del prodotto di reazione; 4) considerazione della dimensione del reagente: la scelta della dimensione del reagente \u00e8 pi\u00f9 piccola per facilitare la modifica, senza causare grandi cambiamenti nella conformazione della proteina;
\nSelezione delle condizioni di reazione:
\nLe condizioni di reazione non devono causare la denaturazione irreversibile della proteina;
\nLa scelta delle condizioni di reazione favorisce la modifica specifica delle proteine;
\n(iii) specificit\u00e0 della reazione: 1) pu\u00f2 utilizzare la specificit\u00e0 di alcuni geni della proteina; 2) scegliere diversi pH di reazione; 3) utilizzare l'instabilit\u00e0 di alcuni prodotti; 4) etichettatura per affinit\u00e0; 5) etichettatura differenziale: nel sistema quando ci sono molecole di enzimi, substrati, inibitori; 6) utilizzare la differenza di stato delle proteine.
\n8. Reagente di affinit\u00e0: noto anche come inibitore sito-specifico, il reagente agisce su un gene nel sito su cui si agisce e non interagisce con altri geni al di fuori del sito su cui si agisce; questo tipo di modificatore \u00e8 chiamato reagente di affinit\u00e0.
\nEtichettatura di affinit\u00e0: i reagenti di affinit\u00e0 hanno generalmente una struttura simile a quella del substrato, il sito attivo dell'enzima ha un alto grado di affinit\u00e0 per il sito attivo dei residui aminoacidici che possono essere etichettati covalentemente; questo tipo di modifica chimica della specificit\u00e0 dell'etichettatura di affinit\u00e0, nota anche come specificit\u00e0 dell'inibizione irreversibile.
\n10. enzima immobilizzato: su un determinato spazio, in uno stato chiuso, pu\u00f2 avvenire un'azione continua e infine riciclata.
\n11. Come l'immobilizzazione influisce sulla stabilit\u00e0 dell'enzima attraverso i seguenti tre effetti: 1) crea una barriera spaziale; 2) crea una restrizione alla diffusione; 3) crea un legame covalente multipunto.
\n12. metodi di stabilizzazione:
\n(i) immobilizzazione (legame chimico, metodo di incorporazione, ecc.): 1) generare barriere spaziali: inibire l'inattivazione chimica; 2) generare una limitazione della diffusione: incorporare l'enzima all'interno delle particelle porose, dove il substrato entra in contatto con la superficie delle particelle porose prima di diffondersi all'interno per interagire con l'enzima, senza essere controllato dalla concentrazione del substrato; 3) legame covalente multipunto: legare l'enzima in modo multiplo e covalente alla superficie del vettore, oppure reticolare l'enzima con un reagente bifunzionale o abbassare l'enzima per incapsularlo nel vettore Il poro stretto pu\u00f2 rendere la conformazione dell'enzima pi\u00f9 solida, impedendo cos\u00ec che la conformazione dell'enzima passi dallo stato di ripiegamento allo stato di allungamento in modo eccessivo.
\n13. Ribonucleasi: \u00c8 una descrizione di RNA con attivit\u00e0 catalitica, la cui natura chimica \u00e8 che l'acido ribonucleico ha la funzione catalitica di un enzima, e il substrato pu\u00f2 essere una molecola diversa o alcune parti della stessa molecola di RNA.
\n14. nucleasi naturali: (a) nucleasi di tipo shear (catalizzano il taglio di RNA auto ed eterogeneo, endonucleasi dell'acido nucleico): 1) nucleasi di tipo hammerhead; 2) nucleasi di tipo hairpin; 3) enzima complesso proteina-RNA; b) nucleasi di tipo splicing: include introni del gruppo \u2160 e introni del gruppo \u2161; per ottenere l'autoscissione dell'RNA; con attivit\u00e0 di endonucleasi e ligasi dell'acido nucleico.
\n15. Selezione in vitro: a partire da una libreria molecolare casuale di grande capacit\u00e0 costruita con molecole di RNA o DNA ordinate in modo casuale, in cui viene vagliato un numero molto piccolo di molecole con funzioni specifiche.
\n16. Aptamero: I frammenti di RNA o DNA che possono legarsi in modo specifico ed efficiente a ligandi come sostanze organiche o proteine sono chiamati rispettivamente aptameri di RNA o aptameri di DNA.
\n17. Programma di screening degli aptameri: 1) sintetizzare chimicamente una libreria di molecole di DNA, in una posizione sulla catena molecolare per introdurre un ordine completamente casuale o parzialmente mutato, le estremit\u00e0 della molecola \u00e8 un ordine fisso, al fine di amplificazione PCR; 2) dopo alcuni cicli di amplificazione PCR, trascrizione in vitro per formare una libreria di RNA ordinato casualmente; 3) queste molecole di RNA attraverso la combinazione di colonne cromatografiche di affinit\u00e0 per molecole bersaglio, in base alle dimensioni dell'RNA e alla capacit\u00e0 di legame della molecola bersaglio saranno distinte, le molecole di RNA con forte legame sono state infine eluite; 4) le molecole di RNA eluite dopo la trascrizione inversa, l'amplificazione PCR, la trascrizione, nel successivo ciclo di screening, dopo 5-10 cicli, per ottenere la libreria arricchita con molecole bersaglio ad alta affinit\u00e0 di molecole di RNA.
\n18. Processo di screening della nucleasi: 1) trascrivendo una sequenza casuale di RNA per costruire una libreria casuale di DNA; 2) la libreria casuale con molecole ad attivit\u00e0 catalitica pu\u00f2 catalizzare il substrato ed effettuare la legatura covalente; 3) il prodotto di reazione attraverso l'RNA immobilizzato nel substrato 5' fine dell'accoppiamento complementare sequenziale di colonne di affinit\u00e0 oligonucleotidica, adsorbimento selettivo della libreria casuale di coloro che possono catalizzare le molecole di RNA nella reazione di legatura; 4) dopo l'eluizione ad alto sale: trascrizione inversa, amplificazione PCR, trascrizione e ingresso nel successivo ciclo di screening; 5) nel successivo ciclo di screening, le mutazioni vengono introdotte nelle molecole attive con una certa frequenza mediante PCR a rischio di errore, il che aumenta la poliselettivit\u00e0 molecolare della libreria casuale ottenuta dallo screening; 6) dopo diversi cicli di screening, le molecole di RNA con attivit\u00e0 catalitica vengono arricchite e le molecole relativamente meno attive vengono eliminate.
\n19. desossiribonucleasi: frammento di DNA a singolo filamento con funzione catalitica sintetizzato con tecniche di evoluzione molecolare in vitro, dotato di un'efficiente attivit\u00e0 catalitica e di riconoscimento della struttura.
\n1. Metodo di selezione in vitro: 1) sintetizzare artificialmente le molecole di DNA senza trascrizione e trascrizione inversa ed effettuare direttamente l'amplificazione PCR; 2) ottenere molecole di DNA a singolo filamento: L'amplificazione PCR collega una biotina al primer e il prodotto PCR viene fatto passare attraverso la colonna di affinit\u00e0 della proteina biotina per realizzare la separazione dei filamenti positivi e negativi; 3) introdurre ioni metallici divalenti come cofattori; 4) introdurre alcuni gruppi funzionali aggiuntivi nel DNA per indirizzare queste desossiribonucleasi. gruppi funzionali aggiuntivi nel DNA per aumentare l'affinit\u00e0 strutturale e funzionale.
\n2. Classificazione delle deossiribonucleasi: (deossiribonucleasi che scindono l'RNA) (deossiribonucleasi che scindono il DNA) (deossiribonucleasi con attivit\u00e0 chinasica) (deossiribonucleasi con funzione di ligasi) (catalizzano la reazione di chelazione metallica della porfirina cicloesile)
\n3. acido nucleico antisenso: molecola di DNA o RNA che si lega a una molecola di mRNA, formando una barriera spaziale che impedisce il legame con il ribosoma e quindi la traduzione in una proteina, oltre a degradare l'mRNA.
\n4. progettazione razionale di molecole enzimatiche: studio di enzimi naturali o effettivamente mutabili utilizzando vari metodi di biochimica, cristallografia, spettroscopia, ecc. per ottenere le caratteristiche molecolari degli enzimi. Struttura spaziale. La relazione tra struttura e funzione, cos\u00ec come i residui aminoacidici e altre informazioni, per poi utilizzarle come base per la modifica degli enzimi.
\n5. Progettazione non razionale della molecola enzimatica: senza la necessit\u00e0 di informazioni precise sulla struttura della molecola enzimatica, la molecola enzimatica viene trasformata mediante mutazione casuale, ricombinazione genetica, screening in bianco e altri metodi, e l'enzima mutante della natura richiesta viene selezionato in modo direzionale.
\n6. Evoluzione diretta della molecola enzimatica: cio\u00e8 la direzione di sviluppo della molecola enzimatica; si parte da uno o pi\u00f9 enzimi parentali esistenti (naturali o ottenuti artificialmente), si costruisce una libreria di enzimi mutanti artificiali attraverso la mutazione o la ricombinazione dei geni e si ottiene infine l'enzima evoluto con determinate caratteristiche delle aspettative principali attraverso lo screening. Evoluzione diretta = mutazione casuale + ricombinazione in avanti + selezione (o screening).
\n7. PCR a rischio di errore: Quando si utilizza l'enzima Taq per l'amplificazione PCR del gene bersaglio, la frequenza di mutazione dell'enzima Taq viene modificata regolando le condizioni di reazione, come l'aumento della concentrazione di Mg2+, l'aggiunta di ioni Mn, la variazione della concentrazione di dNTP nel sistema, ecc. in modo da introdurre casualmente mutazioni nel gene bersaglio con una certa frequenza per costruire una libreria di mutazioni e quindi selezionare o fare uno screening per i mutanti richiesti.
\n8. PCR continua a rischio di errore: Utilizzare i geni mutati ottenuti da un'amplificazione PCR come modelli per l'amplificazione PCR successiva ed eseguire la mutagenesi casuale in modo continuo e ripetuto, in modo che le piccole mutazioni dopo ogni volta si accumulino e producano importanti mutazioni intenzionali.
\n9. Riorganizzazione del DNA: Combinare le mutazioni positive ottenute in diversi geni per formare un nuovo pool di geni mutati, noto anche come PCR sessuale.
\n10. Operazione di riorganizzazione del DNA: I frammenti di DNA isolati dal pool di geni con mutazione positiva vengono tagliati casualmente dalla deossiribonucleasi \u2160 per ottenere frammenti casuali; dopo diversi cicli di PCR senza primer, nel processo di PCR i frammenti casuali vengono utilizzati come modelli e primer reciproci per l'amplificazione, fino a ottenere i geni a lunghezza completa, il che porta alla ricombinazione tra frammenti di geni diversi e alla ricombinazione di mutazioni intenzionali nei genitori. Intraprendere la ricombinazione.<\/p>\n

11. Metodo dell'estensione scaglionata: Nella reazione di PCR, l'annealing e l'estensione convenzionali sono combinate in un'unica fase e il tempo di reazione \u00e8 notevolmente ridotto in modo da poter sintetizzare solo una catena nascente molto corta. La catena nascente denaturata viene quindi utilizzata come primer per annealizzarla con diversi modelli presenti contemporaneamente nel sistema, mentre l'estensione continua. Questo processo viene ripetuto fino alla produzione di un frammento genico completo, che risulta in molecole di DNA nascente distanziate tra loro e contenenti diverse sequenze di templato. Tali molecole di DNA nascente contengono un gran numero di combinazioni di mutazioni che facilitano la generazione di nuove propriet\u00e0 enzimatiche.
\n12. Libreria genica: il DNA genomico di un organismo viene parzialmente digerito con endonucleasi di restrizione, la sezione dell'enzima viene inserita nelle molecole di DNA portante, tutte le molecole portanti inserite nei frammenti di DNA genomico della collezione di molecole portanti conterranno l'intero genoma di questo organismo, che costituisce anche la libreria genica dell'organismo.
\n13. Rappresentativit\u00e0 della libreria: se le molecole di DNA contenute nella libreria sono in grado di riflettere completamente tutti i possibili cambiamenti e alterazioni dei geni esogeni, che \u00e8 l'indicatore pi\u00f9 importante della qualit\u00e0 della libreria. \u00c8 l'indicatore pi\u00f9 importante della qualit\u00e0 della libreria. L'indicatore della rappresentativit\u00e0 della libreria \u00e8 la capacit\u00e0 della libreria stessa.
\n14. Capacit\u00e0 della libreria: si riferisce al numero di cloni ricombinanti indipendenti contenuti nella libreria di mutazioni originale costruita.
\n15. Vettori per la costruzione di librerie di mutazioni: (sistema di vettori fagici \u03bb) (sistema di vettori plasmidici) (sistema di vettori di espressione di cellule di mammifero).
\n16. Mimetismo enzimatico: noto anche come enzima artificiale o modello enzimatico, \u00e8 una scienza applicata che imita la forma e le dimensioni del sito attivo dell'enzima, il suo microambiente e altre caratteristiche strutturali, nonch\u00e9 il meccanismo d'azione e la stereochimica dell'enzima a livello molecolare.
\n17. Il (gruppo catalitico) e il (substrato) del modello enzimatico devono avere caratteristiche stereochimiche che coincidono, il che \u00e8 molto importante per la formazione di una buona specificit\u00e0 di reazione e potenza catalitica.
\n18. Chimica \"soggetto-ospite\": Il campo della chimica in cui il soggetto (enzima) e l'ospite (substrato) formano complessi stabili attraverso leganti e altri legami secondari \u00e8 chiamato chimica \"soggetto-ospite\".
\n19. Classificazione degli enzimi simulati: (a) in base al tipo: 1) modelli di enzimi semplici; 2) modelli di enzimi meccanici; 3) composti semplici sintetici simili agli enzimi; (b) in base alle propriet\u00e0: 1) modelli di enzimi soggetto-ospite; 2) modelli di enzimi micellari; 3) peptidasi; 4) enzimi semisintetici; 5) enzimi a impronta molecolare; 6) enzimi anticorpali.
\n20. Anticorpo-enzima: \u00e8 il prodotto dell'alta selettivit\u00e0 dell'anticorpo e dell'elevata capacit\u00e0 catalitica dell'enzima; l'essenza \u00e8 una classe di immunoglobuline con capacit\u00e0 catalitica, nota anche come anticorpo catalitico, la cui specificit\u00e0 supera la velocit\u00e0 catalitica della reazione dell'enzima, e alcune di esse possono raggiungere anche la velocit\u00e0 catalitica dell'enzima.
\n21. Imprinting molecolare: processo di preparazione di un polimero selettivo per un composto, il composto \u00e8 chiamato molecola impressa, detta anche molecola modello.
\n22. Principio dell'imprinting molecolare (metodo di preparazione dell'imprinting molecolare): 1) selezionare il monomero funzionale della molecola impressa, in modo che i due abbiano una reazione complementare; 2) nella molecola impressa -- complessi monomerici intorno alla reazione di polimerizzazione; 3) rimuovere la molecola impressa dal polimero mediante estrazione; 4) la formazione di un polimero trattenuto all'interno della molecola impressa con la stessa forma esatta, la dimensione della cavit\u00e0, il polimero pu\u00f2 essere altamente selettivo rilegare le molecole impresse con alta selettivit\u00e0.
\n23. Tipi di imprinting molecolare di superficie: 1) imprinting molecolare sulla superficie di materiali inorganici come vettori; 2) modifica superficiale di materiali solidi; 3) imprinting superficiale di proteine.
\n24. Bio-imprinting: un tipo di imprinting molecolare, si riferisce ai materiali biologici naturali (come proteine e saccaridi) come scheletro, sui quali viene effettuato l'imprinting molecolare e il processo di generazione delle molecole impresse con il riconoscimento specifico della cavit\u00e0.
\nPrincipio del bioimprinting: la flessibilit\u00e0 della conformazione delle biomolecole \u00e8 annullata nella fase organica anidra e le loro conformazioni sono fisse, quindi i cambiamenti conformazionali prodotti dall'interazione tra la molecola modello e la biomolecola nella soluzione acquosa possono essere conservati solo quando vengono spostati nella fase organica anidra.
\n26. Conversione di proteine in enzimi semisintetici mediante bio-imprinting: 1) Denaturazione parziale della proteina per disturbare la conformazione della proteina di partenza; 2) Aggiunta della molecola impressa in modo che la molecola impressa sia completamente legata alla proteina parzialmente deformata; 3) Dopo l'interazione della molecola impressa con la proteina, reticolazione della proteina impressa con un agente reticolante; 4) Rimozione della molecola impressa mediante dialisi.<\/p>\n

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A practical sourcing checklist for enzyme, biotech, and food-ingredient topics<\/h2>\n

In enzyme and food-processing projects, the most useful decision frame is usually application fit plus process stability: which ingredient performs under the intended pH, temperature, time, and substrate conditions without creating a downstream quality or compliance problem.<\/p>\n