{"id":4557,"date":"2021-04-29T10:10:14","date_gmt":"2021-04-29T10:10:14","guid":{"rendered":"https:\/\/longchangchemical.com\/?p=4557"},"modified":"2024-09-28T11:56:32","modified_gmt":"2024-09-28T11:56:32","slug":"immobilized-on-magnetic-silicon-based-materials","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/longchangchemical.com\/it\/immobilized-on-magnetic-silicon-based-materials\/","title":{"rendered":"Parametri sperimentali della naringinasi immobilizzata su materiali magnetici a base di silicio"},"content":{"rendered":"

1. Metodo di rilevamento dell'attivit\u00e0 enzimatica della naringinasi<\/strong><\/h1>\r\n\r\n\r\n\r\n
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1-1 Metodo dello spettrofotometro<\/h3>\r\n\r\n\r\n\r\n
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Il metodo spettrofotometrico del para-nitrofenolo utilizza il p-nitrofenolo- \u03b1-rhamnoside ( pNP- \u03b1- Rha ) e il p-nitrofenolo-\u03b2-D-glucopiranoside ( pNP- \u03b2-Glu) come substrato, per rilevare l'attivit\u00e0 enzimatica dell'\u03b1-rhamnosidasi e della \u03b2-glucosidasi. Li Ping ha utilizzato il metodo dello spettrofotometro del p-nitrofenolo, nell'esperimento di aggiunta di Aspergillus niger \u03b2-glucosidasi nella soluzione di p-nitrofenolo -\u03b2-glucoside ( pNPG ) per l'idrolisi enzimatica, e il valore di assorbanza \u00e8 stato misurato alla lunghezza d'onda ultravioletta di 400 nm. Sulla base del valore di assorbanza, si calcola l'attivit\u00e0 enzimatica della \u03b2-glucosidasi. Questo metodo ha una forte specificit\u00e0 di substrato, ma il substrato standard \u00e8 costoso e l'attivit\u00e0 enzimatica della naringinasi per idrolizzare i glicosidi negli alimenti non pu\u00f2 essere determinata, quindi questo metodo non \u00e8 adatto per la rilevazione dell'attivit\u00e0 enzimatica nella preparazione industriale su larga scala della naringinasi.<\/h4>\r\n\r\n\r\n\r\n
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Il principio del metodo dello spettrofotometro di Davis \u00e8 che la naringina pu\u00f2 reagire cromogenicamente con il glicole dietilenico 90% in condizioni leggermente alcaline e la produzione di calcone giallo di naringina pu\u00f2 essere rilevata alla luce ultravioletta con una lunghezza d'onda di 420 nm. In base al valore di assorbanza misurato, \u00e8 possibile calcolare la quantit\u00e0 rimanente di naringina substrato e quindi ottenere l'attivit\u00e0 della naringinasi mediante calcolo. Wang Weina et al. hanno utilizzato un metodo Davis migliorato, hanno preso la naringina come substrato e hanno aggiunto la naringinasi prodotta dalla fermentazione liquida di Aspergillus niger FFCC 848 per l'idrolisi enzimatica. L'assorbanza \u00e8 stata misurata alla luce ultravioletta di 420 nm, quindi \u00e8 stata calcolata l'attivit\u00e0 enzimatica. Il metodo dello spettrofotometro di Davis per la misurazione dell'attivit\u00e0 enzimatica \u00e8 semplice da utilizzare e ha una velocit\u00e0 elevata, pertanto questo metodo \u00e8 ampiamente utilizzato per la rilevazione in tempo reale della produzione di naringinasi dalla fermentazione e dell'attivit\u00e0 della naringinasi immobilizzata.<\/h4>\r\n\r\n\r\n\r\n
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1-2 Cromatografia liquida ad alte prestazioni<\/h3>\r\n\r\n\r\n\r\n
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Il principio della cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) \u00e8 che l'HPLC pu\u00f2 determinare con precisione e analizzare quantitativamente il substrato naringina, il prodotto intermedio purunina e il prodotto finale naringenina durante l'intero processo di idrolisi, per poi calcolare l'attivit\u00e0 enzimatica. Chen Yuelong e altri hanno utilizzato l'HPLC per determinare il tempo di ritenzione di naringina, arbutina, miricetina e dei loro prodotti, ottenendo una separazione completa con una risoluzione superiore a 1,5 e monitorando efficacemente l'effetto della naringinasi su pi\u00f9 glicosidi nel processo di idrolisi; allo stesso tempo, l'attivit\u00e0 enzimatica \u00e8 stata determinata con precisione. Il metodo HPLC presenta i vantaggi di un'elevata accuratezza e pu\u00f2 evitare l'interferenza delle impurit\u00e0; tuttavia, rispetto al metodo Davis, questo metodo presenta un tempo di rilevazione pi\u00f9 lungo e un'operazione pi\u00f9 complicata.<\/h4>\r\n\r\n\r\n\r\n
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1-3 Metodo migliorato di determinazione dell'attivit\u00e0 enzimatica della naringinasi<\/h3>\r\n\r\n\r\n\r\n
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Utilizzando il metodo Davis migliorato: 0,8 mL di 0,8 g-L-1<\/sup>\u00a0La soluzione di naringina preparata con tampone a pH 4,5 \u00e8 stata aggiunta al sistema di reazione contenente 40 mg di naringinasi immobilizzata (o 0,2 mL di naringinasi libera). Porre il tutto in un bagno d'acqua a temperatura costante di 50 \u2103 per 30 minuti. Prelevare 0,1 mL della soluzione di idrolisi enzimatica di reazione e aggiungere 5 mL di glicole dietilenico (frazione di volume 90%) e 0,1 mL di soluzione di NaOH (4 mol-L-1<\/sup>) nelle provette e tenere a riposo per 10 minuti dopo averli mescolati uniformemente. Misurare l'assorbanza della soluzione miscelata a 420 nm.<\/h4>\r\n\r\n\r\n\r\n
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Definizione dell'attivit\u00e0 dell'enzima naringinasi (U): a una condizione di pH 4,5, 50 \u2103, 1 unit\u00e0 di attivit\u00e0 enzimatica \u00e8 la quantit\u00e0 di enzima necessaria per degradare 1 \u03bcg di naringina al minuto. Il rapporto di attivit\u00e0 enzimatica ( U-g-1<\/sup>\u00a0o U-mL-1<\/sup>) \u00e8 definita come: alla condizione di pH 4,5, 50 \u2103, l'attivit\u00e0 enzimatica esibita da 1 g di naringinasi immobilizzata (o 1 mL di naringinasi libera). L'attivit\u00e0 enzimatica relativa \u00e8 calcolata secondo la seguente formula :<\/h4>\r\n\r\n\r\n\r\n
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Attivit\u00e0 enzimatica relativa \/% = attivit\u00e0 enzimatica\/attivit\u00e0 enzimatica massima\u00d7100<\/h4>\r\n\r\n\r\n\r\n
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Determinazione della curva standard: le concentrazioni di massa della soluzione standard del glicoside naringina sono disposte a 0, 0,4, 0,8, 1,2, 1,6 g - L-1<\/sup>, quindi 0,1 mL di soluzione sono stati prelevati per la reazione con 5 mL di glicole dietilenico (90% , v \/ v) e 0,1 mL di soluzione di idrossido di sodio ( 4 mol-L-1<\/sup>). Dopo aver mescolato uniformemente la miscela e averla lasciata riposare per 10 minuti, il valore di assorbimento della luce della soluzione miscelata \u00e8 stato misurato a 420 nm e la curva standard \u00e8 stata tracciata di conseguenza.<\/h4>\r\n\r\n\r\n\r\n
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2. Preparazione della soluzione enzimatica di naringinasi<\/strong><\/h2>\r\n\r\n\r\n\r\n
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L'Aspergillus niger FFCC uv-11 conservato a 4 \u2103 \u00e8 stato trasferito nel terreno di coltura e le spore mature sono state ottenute mediante coltura a temperatura costante a 30 \u2103 per 96 ore. Le spore sono state poi lavate con soluzione fisiologica normale sterile con una frazione di massa di 0,9%. Il valore dell'assorbanza della sospensione di spore \u00e8 stato misurato a 600 nm (valore OD600); con la soluzione fisiologica sterile il suo valore OD600 \u00e8 stato regolato a 0,200. La sospensione di spore con una frazione volumetrica di 10% \u00e8 stata inoculata in 100 mL di terreno di fermentazione (matraccio conico da 250 mL).-1<\/sup>\u00a0per 10 minuti in una centrifuga refrigerata. Quindi, attraverso il filtro di aspirazione, ottenere il liquido surnatante necessario per l'enzima naringina. Raffreddare a 4 \u2103 per l'uso successivo.<\/h4>\r\n\r\n\r\n\r\n
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3. Preparazione dell'enzima naringinasi immobilizzato in chitosano<\/strong><\/h2>\r\n\r\n\r\n\r\n
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Si prendono 3,0 g di chitosano, con 100 mL di frazione volumetrica di soluzione di acido acetico 2% \u00e8 stato sciolto per preparare 0,3 g - L-1<\/sup>\u00a0soluzione colloidale di chitosano, sonicata per 20 minuti per eliminare le bolle d'aria e lasciata sciogliere completamente. La soluzione colloidale di chitosano \u00e8 stata iniettata goccia a goccia con un ago in 0,5 g - L-1<\/sup>\u00a0NaOH condensato (1000 mL) per formare un pellet liscio. Lasciato riposare a temperatura ambiente per 3 ore, il pellet \u00e8 stato ripetutamente lavato con acqua distillata per neutralizzarlo e l'acqua \u00e8 stata assorbita da una carta da filtro per ottenere le microsfere di chitosano. Sono stati pesati 0,4 g di microsfere di chitosano, sono stati aggiunti 0,4 ml di glutaraldeide con frazione volumetrica 6% e le microsfere sono state ripetutamente lavate con acqua distillata fino a quando non \u00e8 stata rilevata la presenza di glutaraldeide sulla superficie delle microsfere dopo temperatura costante e vibrazione a 25 \u2103 150 r-min.-1<\/sup>\u00a0per 2 ore. Le microsfere di chitosano reticolato sono state ottenute mediante essiccazione con carta da filtro.<\/h4>\r\n\r\n\r\n\r\n
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\u00a0Ha detto 0,4 g di microsfere di chitosano, aggiungere 0,4 mL numero membro di crediti 6% glutaraldeide, a 150 r - min-1<\/sup>\u00a0a 25 \u2103 oscillazione di temperatura Dopo 2 h, lavate ripetutamente con acqua distillata, le microsfere sono state asciugate per ottenere microsfere di chitosano reticolato. Prelevare 4 mL di soluzione enzimatica di naringinasi, aggiungerla a 0,4 g di microsfere di chitosano reticolato, agitare a una temperatura costante di 25 \u2103, 150 r-min-1<\/sup>\u00a0per 2 ore e metterlo in frigorifero a 4 \u2103 per l'accoppiamento di adsorbimento per 4 ore. Sciacquare la soluzione enzimatica residua sulla superficie del supporto con tampone a pH 4,5, assorbire l'acqua sulla carta da filtro per ottenere la naringinasi immobilizzata e conservarla in frigorifero a 4 \u2103 per un uso successivo.<\/h4>\r\n\r\n\r\n\r\n
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4. Preparazione di microsfere magnetiche di chitosano a base di silicio (MSC)<\/strong><\/h2>\r\n\r\n\r\n\r\n
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Il processo di preparazione delle nanoparticelle magnetiche a base di silicio ( MS) \u00e8 illustrato nella Figura 1.<\/h4>\r\n\r\n\r\n\r\n
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Figura 1 Schema della preparazione di nanoparticelle magnetiche a base di silicio<\/h4>\r\n\r\n\r\n\r\n
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( 1) In primo luogo, il Fe magnetico3<\/sub>O4<\/sub>\u00a0modificate con acido citrico sono state preparate con il metodo della co-precipitazione chimica; la procedura sperimentale prevede: 2,25 g di FeCl3<\/sub>-6H2<\/sub>O e 1,61 g di FeSO4<\/sub>-7H2<\/sub>O sono aggiunti in un pallone a tre colli riempito con 100 mL di acqua deionizzata, la temperatura del sistema \u00e8 stata riscaldata a 85 \u2103 in condizioni di azoto gassoso. Agitare a 1000 r-min-1<\/sup>\u00a0e versare rapidamente 10 mL di acqua ammoniacale concentrata. Quando la soluzione diventa nera, aggiungere 153 mg di citrato di sodio. Dopo 30 minuti di reazione, separare la produzione con un magnete e lavare la fase solida con acqua deionizzata ed etanolo pi\u00f9 volte. Il Fe3<\/sub>O4<\/sub>\u00a0Le nanoparticelle ottenute vengono essiccate per un successivo utilizzo.<\/h4>\r\n\r\n\r\n\r\n
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( 2) Poi, sono state preparate nanoparticelle magnetiche a base di silicio (MS) con il metodo sol-gel, come mostrato nella Figura 1. Le fasi sperimentali comprendono: 0,1 g di Fe3<\/sub>O4<\/sub>\u00a0sono state disperse uniformemente in una soluzione mista contenente 40 mL di etanolo anidro, 10 mL di acqua dedistillata e 1,2 mL di acqua ammoniacale concentrata. In condizioni di agitazione di 300 r-min-1<\/sup>, gocce di soluzione contenente Fe3<\/sub>O4<\/sub>\u00a0sono state aggiunte a TEOS (0,4 mL) disperso in 30 mL di etanolo anidro e la reazione delle nanoparticelle a base di silicio \u00e8 stata condotta per 12 ore a temperatura ambiente. I prodotti sono stati lavati con etanolo anidro e acqua distillata per diverse volte per ottenere nanoparticelle magnetiche a base di silice (MS), che sono state essiccate per il successivo utilizzo.<\/h4>\r\n\r\n\r\n\r\n
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Le microsfere di MSC sono state preparate con il metodo della reticolazione in emulsione, come mostrato in Figura 2. Le fasi sperimentali comprendevano: 0,125 g di nanoparticelle di silice magnetica (MS) disperse uniformemente in 10 mL di soluzione di chitosano con frazione di massa pari a 2,5% preparata da chitosano disciolto in soluzione di acido acetico con frazione di volume pari a 5,0%, quindi aggiungere la soluzione di chitosano in un'emulsione contenente 60 mL di paraffina liquida e 1,8 mL di twain 80 goccia a goccia. Dopo un'agitazione di 30 minuti in condizioni di bagnomaria a 40 \u2103 e 800 giri\/min.-1<\/sup>Aggiungere 2,0 mL di glutaraldeide e far reagire per 1 h. Quindi il pH del sistema \u00e8 stato regolato a 9,0 con 1 mol-L-1<\/sup>\u00a0NaOH, e la reazione \u00e8 proseguita per 1 h. I prodotti sono stati lavati pi\u00f9 volte con etere di petrolio, etanolo e acqua distillata per ottenere microsfere MSC, che sono state essiccate sotto vuoto per il successivo utilizzo.<\/h4>\r\n\r\n\r\n\r\n
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Figura 2 Schema della preparazione di microsfere di chitosano magnetico a base di silicio<\/h4>\r\n\r\n\r\n\r\n
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5. Preparazione di microsfere di chitosano magnetico a base di silicio epossidico ( MSCE)<\/strong><\/h2>\r\n\r\n\r\n\r\n
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0,5 g di microsfere essiccate di MSC preparate con il metodo 4 sono stati pesati e aggiunti in un matraccio conico da 50 mL. Quindi sono stati aggiunti 2,0 mL di soluzione di NaOH, soluzione di epicroloidrina e NaBH4<\/sub>\u00a0sono stati aggiunti nel pallone con una certa concentrazione. La reazione \u00e8 stata condotta con oscillazione costante della temperatura per un certo tempo. Il meccanismo di reazione della preparazione dell'MSCE \u00e8 illustrato nella Figura 3.<\/h4>\r\n\r\n\r\n\r\n
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Figura 3 Il principio di preparazione delle microsfere di chitosano magnetico a base di epossidico e silicio<\/h4>\r\n\r\n\r\n\r\n
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Dopo l'attivazione, le microsfere attivate vengono lavate ripetutamente con acqua distillata fino all'assenza di gruppi OH- ed epossidici liberi sulla superficie per ottenere microsfere di chitosano magnetico a base di silicio epossidico (MSCE). Il metodo di rilevamento \u00e8 il seguente: prelevare 3,0 mL del surnatante di lavaggio e aggiungere 1~2 gocce di fenolftaleina. Dopo aver agitato, se non diventa rosso, significa che non c'\u00e8 OH- libero con MSCE; prendere 3,0 mL del surnatante di lavaggio e aggiungere 3,0 mL di 1,3 mol-L-1<\/sup>\u00a0sodio tiosolfato e 1 ~2 gocce di fenolftaleina; se la soluzione non diventa rossa dopo l'agitazione, significa che non ci sono gruppi epossidici liberi nell'MSCE. L'equazione di reazione per la rilevazione del gruppo epossidico \u00e8 la seguente:<\/h4>\r\n\r\n\r\n\r\n
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6 Preparazione dell'enzima naringinasi immobilizzato in MSCE<\/strong><\/h4>\r\n\r\n\r\n\r\n
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5,0 g di MSCE preparato con il metodo 5 sono stati aggiunti a 50 mL di soluzione enzimatica di naringinasi con un determinato pH e la reazione \u00e8 stata fatta oscillare sotto un bagno d'acqua a temperatura costante, come illustrato nella Figura 4. Dopo la reazione, le microsfere sono state lavate con soluzione tampone per diverse volte fino a quando non \u00e8 stata trovata naringinasi libera sulla superficie delle microsfere. Le microsfere sono state drenate con un imbuto di Brinella per ottenere l'enzima naringinasi immobilizzato in MSCE, che \u00e8 stato refrigerato a 4 \u2103 per un uso successivo.\u00a0<\/h4>\r\n\r\n\r\n\r\n
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Figura 4 Il principio di preparazione dell'enzima naringinasi immobilizzato in MSCE<\/h4>\r\n\r\n\r\n\r\n

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Composto Glucoamilasi<\/span><\/a><\/td>\r\n9032-08-0<\/td>\r\n<\/tr>\r\n
Pullulanase<\/span><\/a><\/td>\r\n9075-68-7<\/td>\r\n<\/tr>\r\n
Xilanasi<\/span><\/a><\/td>\r\n37278-89-0<\/td>\r\n<\/tr>\r\n
Cellulasi<\/span><\/a><\/td>\r\n9012-54-8<\/td>\r\n<\/tr>\r\n
Naringinasi<\/span><\/a><\/td>\r\n9068-31-9<\/td>\r\n<\/tr>\r\n
\u03b2-amilasi<\/span><\/a><\/td>\r\n9000-91-3<\/td>\r\n<\/tr>\r\n
Glucosio ossidasi<\/span><\/a><\/td>\r\n9001-37-0<\/td>\r\n<\/tr>\r\n
alfa-amilasi<\/td>\r\n9000-90-2<\/td>\r\n<\/tr>\r\n
Pectinasi<\/span><\/a><\/td>\r\n9032-75-1<\/td>\r\n<\/tr>\r\n
Perossidasi<\/td>\r\n9003-99-0<\/td>\r\n<\/tr>\r\n
Lipasi<\/span><\/a><\/td>\r\n9001-62-1<\/td>\r\n<\/tr>\r\n
Catalasi<\/span><\/a><\/td>\r\n9001-05-2<\/td>\r\n<\/tr>\r\n
TANNASIO<\/span><\/a><\/td>\r\n9025-71-2<\/td>\r\n<\/tr>\r\n
Elastasi<\/span><\/a><\/td>\r\n39445-21-1<\/td>\r\n<\/tr>\r\n
Ureasi<\/span><\/a><\/td>\r\n9002-13-5<\/td>\r\n<\/tr>\r\n
DEXTRANASE<\/span><\/a><\/td>\r\n9025-70-1<\/td>\r\n<\/tr>\r\n
L-lattico deidrogenasi<\/span><\/a><\/td>\r\n9001-60-9<\/td>\r\n<\/tr>\r\n
Deidrogenasi malato<\/span><\/a><\/td>\r\n9001-64-3<\/td>\r\n<\/tr>\r\n
Colesterolo ossidasi<\/span><\/a><\/td>\r\n9028-76-6<\/td>\r\n<\/tr>\r\n<\/tbody>\r\n<\/table>","protected":false},"excerpt":{"rendered":"

1. Metodo di rilevamento dell'attivit\u00e0 enzimatica della naringinasi 1-1 Metodo spettrofotometrico Il metodo spettrofotometrico del para nitrofenolo utilizza il p-nitrofenolo- \u03b1-rhamnoside ( pNP- \u03b1- Rha ) e il p-nitrofenolo-\u03b2-D-glucopiranoside ( pNP- \u03b2-Glu) come substrato, per rilevare l'attivit\u00e0 enzimatica dell'\u03b1-rhamnosidasi e della \u03b2-glucosidasi. Li Ping ha utilizzato il metodo dello spettrofotometro a p-nitrofenolo, nell'esperimento di aggiunta di Aspergillus niger \u03b2-glucosidasi nella soluzione di p-nitrofenolo -\u03b2-glucoside ( pNPG ) per l'idrolisi enzimatica, e il valore di assorbanza \u00e8 stato misurato a [...]<\/p>","protected":false},"author":1,"featured_media":0,"comment_status":"open","ping_status":"open","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":{"footnotes":""},"categories":[108],"tags":[],"class_list":["post-4557","post","type-post","status-publish","format-standard","hentry","category-enzyme-news"],"yoast_head":"\nExperimental parameters of\u00a0naringinase immobilized on magnetic silicon based materials - Longchang Chemical<\/title>\n<meta name=\"robots\" content=\"index, follow, max-snippet:-1, max-image-preview:large, max-video-preview:-1\" \/>\n<link rel=\"canonical\" href=\"https:\/\/longchangchemical.com\/it\/immobilized-on-magnetic-silicon-based-materials\/\" \/>\n<meta property=\"og:locale\" content=\"it_IT\" \/>\n<meta property=\"og:type\" content=\"article\" \/>\n<meta property=\"og:title\" content=\"Experimental parameters of\u00a0naringinase immobilized on magnetic silicon based materials - 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