Efisiensi karbon adalah salah satu faktor utama yang menentukan kelangsungan hidup suatu proses jalur dan merupakan penentu utama laju produk per unit substrat. Dua faktor yang menentukan efisiensi karbon: keseimbangan elektron dari substrat ke produk, yang dapat dihitung dari tingkat reduksi substrat dan produk, dan fakta bahwa jalur metabolisme yang ada terutama dirancang untuk laju reaksi yang lebih tinggi daripada hasil karbon yang tinggi. Faktor pertama terkait erat dengan komposisi kimia substrat dan produk. Faktor kedua dapat diatasi dengan mendesain ulang jalur metabolisme, yang memungkinkan karbon substrat dipertahankan atau, dalam beberapa kasus, diasimilasi selama pembentukan produk.
1. Keseimbangan redoks dalam ragi Efisiensi jalur metabolisme yang diperlukan untuk produksi biologis bahan kimia yang efisien bergantung pada berbagai faktor seperti keseimbangan redoks, keseimbangan energi, kelayakan termodinamika, keseimbangan stoikiometri, kopling fluks, penghambatan umpan balik, toksisitas produk, kinetika, dan sebagainya. Metabolisme sel mempertahankan pertumbuhan sel dan keseimbangan redoks dengan mentransfer elektron dari substrat ke metabolit yang berbeda. Oleh karena itu, jalur biosintesis yang optimal untuk produksi metabolit yang diinginkan haruslah netral redoks dan hasil jalur (YP) haruslah pada, atau sangat dekat dengan, hasil teoritis maksimum (YE) dari kombinasi produk target-substrat.YP tergantung pada jalur yang terlibat dan ditentukan berdasarkan stoikiometrinya, sedangkan YE adalah jumlah maksimum produk yang dapat dibentuk dari substrat dan dapat dihitung dari rasio substrat-ke-produk γS/γP yang dihitung di mana γS dan γP masing-masing adalah derajat reduksi substrat dan produk. Derajat reduksi dapat didefinisikan sebagai jumlah elektron yang tersedia yang setara dengan atom karbon senyawa. Oleh karena itu, YE perlu memperhitungkan keseimbangan elektron untuk konversi substrat menjadi produk, yang mungkin memerlukan dekarboksilasi yang menyebabkan hilangnya karbon, atau karboksilasi untuk memberikan penyerapan karbon tambahan. Gambar berikut ini menggambarkan jalur metabolisme pusat ragi. Gambar 1. Jalur metabolisme karbon pusat ragi, menyoroti hubungan antara langkah karboksilasi/dekarboksilasi dan perubahan tingkat pengurangan substrat dan produk. Tingkat reduksi substrat, metabolit perantara, dan produk yang sesuai ditunjukkan oleh perubahan warna dari merah (γ = 0) menjadi kuning (γ = 4) menjadi biru (γ = 6)
Menurut tingkat reduksi substrat dan produk target, dapat dibagi menjadi tiga kasus: ketika substrat dan produk target memiliki tingkat reduksi yang sama, ada situasi ideal di mana substrat sepenuhnya diubah menjadi produk. Artinya, hasil produk aktual dapat mendekati hasil teoritis maksimum (YE), tetapi proses metabolisme akan menghasilkan produk sampingan untuk pembentukan biomassa dan pemeliharaan pertumbuhan sel, yang akan mengurangi hasil produk. Contohnya adalah asam laktat (γ = 4,0), yang memiliki tingkat reduksi yang sama dengan glukosa (γ = 4,0). Oleh karena itu, proses produksi laktat merupakan jalur redoks-netral dengan stoikiometri yang seimbang, sekaligus memungkinkan untuk menghasilkan ATP, yang menghasilkan tingkat yang mendekati hasil teoritis maksimum. Secara keseluruhan, untuk produk substrat lainnya, jarang ditemukan jalur seperti itu yang tidak menghasilkan daya reduksi yang berlebihan.
Ketika produk lebih banyak tereduksi daripada substrat, reaksi oksidasi yang diperlukan untuk membentuk produk menghasilkan ekuivalen oksidatif tambahan (NAD +, NADP +, FADH +). Untuk mengurangi ekuivalen oksidatif ini, sel perlu mengoksidasi karbon menjadi CO2 dan/atau produk sampingan lainnya (misalnya, dalam jalur pentosa fosfat (PPP), siklus TCA, atau siklus xilulosa fosfat (XuMP)) untuk mempertahankan homeostasis redoks. Proses ini dapat mempengaruhi efisiensi keseluruhan konversi substrat menjadi produk target. Contohnya termasuk asam lemak, etanol, dan gliserol.
Penggunaan glukosa sebagai substrat untuk menghasilkan asam lemak, seperti asam palmitat (γ = 5,75), mengurangi hasil asam lemak karena kebutuhan NADPH yang tinggi dan pelepasan CO2 selama perpanjangan rantai karbon yang menyebabkan hilangnya substrat. Yu dkk [1] berhasil meningkatkan hasil asam lemak pada Saccharomyces cerevisiae hingga 40% dengan membangun jalur metabolisme reduktif anabolik yang dicirikan oleh siklus dekarboksilasi berulang untuk memasok sel dengan NADH, NADPH, dan ATP tambahan.
Produksi etanol dari glukosa juga mengoksidasi beberapa substrat menjadi CO2 dan gliserol karena kebutuhan untuk memasok NADH. Namun, jalur ragi alami untuk memfermentasi etanol mempertahankan tingkat reduksi glukosa (γ = 4,0), dengan reduksi rata-rata keseluruhan γ = 4,0 ketika CO2 dan etanol adalah produk akhir, sehingga jalur metabolisme ini sangat efisien dari sudut pandang hasil, hanya mengubah 4-5% sumber karbon menjadi gliserol. Demikian pula, ketika 1,2-propanediol (1,2-PDO) (γ = 5.33) diproduksi oleh ragi pembuat bir menggunakan gliserol (γ = 4.66) sebagai satu-satunya sumber karbon, modifikasi rekayasa metabolisme memberikan tambahan NADH untuk memfasilitasi sintesis 1,2-PDO, mencapai hasil tertinggi hingga saat ini pada ragi> 4 g / L 1,2-PDO.
Ketika produk direduksi di bawah substrat, ekuivalen pereduksi dan produk dihasilkan selama produksi produk. Mekanisme umum untuk mengoksidasi ulang ekuivalen pereduksi berlebih adalah melalui oksidasi oleh rantai pernapasan, menghasilkan ATP berlebih dan/atau melepaskan panas. Akibatnya, hasil produk berada di bawah maksimum teoretis yang dapat dicapai dengan elektron yang tersedia. Sebagai alternatif, ekuivalen pereduksi berlebih dapat dikonsumsi dengan mengurangi sebagian sumber karbon untuk mengurangi produk sampingan. Kombinasi substrat-produk ini memiliki potensi untuk memfiksasi karbon untuk meningkatkan hasil metabolit target. Seperti dalam produksi asam sitrat (γ = 3,0) dari glukosa, limpahan energi karena pembentukan NADH berarti bahwa sel dapat dengan mudah mendapatkan energi dengan membuat senyawa target dengan mengorbankan kehilangan hasil. Oleh karena itu, efisiensi yang buruk dari jalur biokimia alami untuk sintesis asam sitrat merupakan peluang untuk mencapai tingkat keuntungan teoritis maksimum yang dapat dicapai dengan memfiksasi karbon.
Oleh karena itu, substrat untuk digunakan dalam produk yang diinginkan dapat dipilih berdasarkan γS dan γP yang memaksimalkan hasil. Substrat ragi yang disukai, glukosa, dapat digunakan untuk mensintesis produk dengan γ yang sama dengan glukosa seperti etanol (ditambah CO2) atau asam laktat. Meskipun glukosa adalah substrat yang lebih disukai, glukosa bersaing secara langsung dengan produksi makanan atau pakan. Oleh karena itu, beberapa sumber karbon yang lebih murah seperti gliserol, metanol, dan CO2 dianggap sebagai substrat yang menjanjikan.
Metanol (γ = 6,0) adalah bahan baku C1 dengan tingkat reduksi yang tinggi. Salah satu keuntungan utama menggunakan metanol sebagai sumber karbon adalah daya reduksinya, yang pada mikroorganisme seperti ragi metilotrofik membentuk NADH dan menghasilkan ATP. Namun, karena reaksi pertama dari jalur ini adalah oksidasi metanol menjadi formaldehida menggunakan oksigen sebagai akseptor elektron, ragi kehilangan satu NADH untuk setiap porsi metanol yang diambil.Studi terbaru menunjukkan bahwa Komagataella phaffii mampu memanfaatkan metanol secara lebih efisien dengan mengekspresikan metanol dehidrogenase (Adh2) endogen secara berlebihan pada strain yang kekurangan alkohol oksidase (Mut-), yang menghasilkan produksi NADH dan ATP tambahan per porsi metanol, yang memungkinkan strain Mut-Adh2 untuk meningkatkan intensitas produksi protein heterolog dalam kondisi konsumsi oksigen dan emisi panas yang rendah.
Sumber karbon lain yang menjanjikan adalah CO2, yang merupakan senyawa yang sangat teroksidasi (γ = 0) yang dapat direduksi oleh autotrof untuk menghasilkan senyawa organik untuk biosintesis. Oleh karena itu, salah satu cara untuk memasukkan CO2 ke dalam metabolisme ragi adalah konversi co-substrat, yang mengubah CO2 bersama dengan sumber karbon lain menjadi produk dengan tingkat reduksi yang lebih rendah daripada co-substrat. Dalam biosintesis asam organik, yang memiliki γ lebih rendah dari glukosa, seperti asam sitrat, asam maleat, dan asam suksinat, strategi ini memungkinkan penggabungan CO2 ke dalam proses fermentasi industri untuk meningkatkan hasil karbon.
2. Bagaimana cara menyeimbangkan tingkat pengurangan produk? Evolusi proses metabolisme dalam mikroorganisme biasanya didasarkan pada pertumbuhan sel yang cepat daripada produksi produk tertentu. Oleh karena itu, sel lebih menyukai metabolisme yang cepat daripada hasil karbon yang tinggi. Oleh karena itu, kemampuan sel untuk meningkatkan retensi karbon selama metabolisme merupakan salah satu tantangan terbesar dalam rekayasa metabolik, yang mencegah pabrik mikroba untuk mencapai produksi bahan kimia dengan hasil tinggi. Makalah ini membahas tentang rekayasa metabolisme ragi yang bertujuan untuk memaksimalkan retensi karbon, termasuk fiksasi CO2 serta menghindari langkah-langkah dekarboksilasi yang tidak penting dalam sel. 2.1 Integrasi karbon anorganik ke dalam metabolisme sel menggunakan CO2 sebagai substrat Ada beberapa jalur yang berbeda: molekul CO2 membentuk senyawa organik melalui karboksilasi; CO2 dikonversi melalui reduksi menjadi asam format atau CO, yang dapat diasimilasi ke dalam biomassa. Reaksi karboksilasi dikatalisis oleh karboksilase. seperti RuBisCO dalam siklus CBB dari jalur fiksasi CO2 autotrofik atau enzim jalur Pck dan Pyc, yang terlibat dalam penyediaan prekursor metabolik pusat Prinsip reduksi karbon adalah CO2 direduksi menjadi asam format atau CO oleh format dehidrogenase atau CO dehidrogenase, seperti pada jalur asetil koenzim A yang direduksi.2.1.1 Ekspresi Enzim CBBase Heterologus untuk Fiksasi CO2 dalam Produksi Etanol Ragi pada S. cerevisiae Dalam produksi etanol S. cerevisiae, Guadalupe-Medina dkk [2] memanfaatkan CO2 sebagai akseptor elektron untuk memanfaatkan daya reduksi yang berlebih, yaitu, konversi CO2 menjadi metabolit perantara jalur PPP Ru5P oleh enzim jalur siklus CBB RuBisCO dan Prk, menghasilkan peningkatan 10% dalam produksi etanol dan penurunan 90% dalam produksi gliserol sebagai produk sampingan. Xia dkk [3] menemukan ketidakseimbangan redoks selama fermentasi anaerobik saat xilosa digunakan sebagai substrat untuk produksi etanol. Ekspresi RrRuBisCO dan SoPRK memungkinkan penggunaan kembali CO2 dari dekarboksilasi piruvat dan mengurangi hasil produk sampingan xylitol dan gliserol. Gassler dkk [4] membangun siklus CBB fungsional pada ragi metilotrofik K. phaffii, yang menyediakan energi dan daya reduksi melalui metanol dan menghasilkan asam laktat dan malonat dengan menggunakan CO2 sebagai sumber karbon. 2.1.2 Jalur Glisin Reduksi
Jalur glisin reduktif dianggap sebagai jalur yang paling efisien untuk pertumbuhan aerobik dengan menggunakan asam format, semua enzim dari jalur pro-glisin ada di S. cerevisiae, tetapi tidak dapat menggunakan asam format sebagai substrat untuk pertumbuhan. Ekspresi berlebih dari enzim jalur endogen menghasilkan ekspresi fungsional dari jalur glisin yang tereduksi, yang memungkinkan sintesis glisin dari asam format dan CO2 sebagai substrat pendamping untuk menopang pertumbuhan strain yang kekurangan glisin. Jalur ini bergantung pada konsentrasi CO2 yang tinggi (10%). Baru-baru ini, jalur glisin tereduksi yang tahan oksigen secara alami telah diidentifikasi pada K. phaffii, namun aktivitas alami jalur ini tidak cukup untuk mendukung pertumbuhan sel.
2.1.3 Cabang siklus TCA yang dikurangi (rTCA)
Siklus TCA tereduksi (rTCA) adalah jalur fiksasi CO2 yang ditemukan pada prokariota. rTCA adalah proses kebalikan dari siklus TCA teroksidasi dan membentuk satu molekul asetil koenzim A dengan cara memfiksasi dua molekul CO2. Sejauh ini, siklus TCA terbalik yang lengkap belum direalisasikan dalam ragi. Sebagian rTCA direalisasikan dalam Saccharomyces cerevisiae untuk menghasilkan asam suksinat dan asam malat. yan et al [5] mengekspresikan secara berlebihan gen yang mengkode tiga enzim pertama dari siklus Pyc2 dan rTCA, Mdh3R, EcFumC, dan FrdS1, pada galur yang kekurangan Pdc dan Fum1, yang menghasilkan hasil asam suksinat hingga 13 g / L dengan hasil 0.Malubhoy et al [5] mensintesis 35 g / L asam butanedioat dengan hasil 0,63 mol / mol gliserol melalui jalur siklus rTCA, sementara proses tersebut juga mencapai fiksasi CO2 bersih.
2.2 Menghindari dekarboksilasi yang tidak perlu
Dekarboksilasi biologis terjadi terutama di jalur katabolik seperti glikolisis, PPP, dan siklus TCA, di mana reaksi melepaskan CO2 dan sering dikaitkan dengan oksidasi untuk meregenerasi NADH dan NADPH. Dekarboksilasi juga terjadi pada jalur metabolit prekursor produk akhir, di mana reaksi dekarboksilasi di jalur tersebut semuanya mengurangi hasil karbon dari substrat ke produk. Sebagai contoh, asetil koenzim A, metabolit yang dihasilkan oleh reaksi dekarboksilasi piruvat, menghasilkan hilangnya 33% karbon dalam bentuk CO2, yang mengurangi hasil produk teoritis dari setiap proses yang melibatkan asetil koenzim A sebagai prekursor. Seperti siklus TCA, biosintesis asam lemak dan asam amino. Oleh karena itu, untuk mengatasi hilangnya karbon dalam sintesis asetil koenzim A, para peneliti telah menghindari langkah dekarboksilasi yang tidak perlu dengan merancang jalur retensi karbon baru, Hellgren et al [6] membangun jalur konservasi karbon siklik (GATHCYC) berdasarkan jalur glikolisis non-oksidatif (NOG), yang menghasilkan tiga molekul asetil koenzim A dari satu molekul fruktosa 6-fosfat (F6P), dan jalur tersebut tidak kehilangan karbon. Penggunaan jalur ini menghasilkan peningkatan 109% dalam produksi asam 3-hidroksipropionat. Pengenalan jalur GATHCYC ke dalam strain penghasil n-butanol menghasilkan peningkatan produksi n-butanol menjadi 1,75 g/L dan pengurangan emisi CO2 sebesar 35,2%.
3. Produksi asam suksinat sebagai contoh
Selain keseimbangan redoks dan retensi karbon, kelayakan termodinamika dan keseimbangan energi adalah faktor kunci dalam desain jalur metabolisme yang optimal. Kelayakan termodinamika mengacu pada perubahan energi bebas Gibbs (ΔrG'm) di bawah kondisi standar yang relevan secara fisiologis dan menentukan apakah jalur metabolisme layak atau tidak. Energi seluler juga harus seimbang untuk menghasilkan lebih banyak senyawa target, karena produk yang membutuhkan energi menyebabkan hilangnya karbon substrat untuk memenuhi kebutuhan energi, sementara produk yang teroksidasi menyebabkan kelebihan energi dan kemungkinan pembuangan panas. Asam suksinat (SA) adalah metabolit perantara siklus TCA. Pada bagian ini, fokusnya adalah pada strategi yang berbeda untuk produksi SA dan stoikiometri ATP, keseimbangan redoks, fiksasi CO2, kelayakan termodinamika, dan konservasi karbon dinilai untuk berbagai jalur sintesis SA alami dan rekayasa. Ada tiga jalur sintetis untuk asam suksinat: siklus TCA oksidatif (oTCA), siklus TCA tereduksi (rTCA), dan jalur glioksalat (GS). Siklus oTCA memiliki hasil maksimum teoritis yang lebih rendah, tetapi produksi asam suksinat dalam kondisi aerobik memiliki keuntungan dari produk sampingan yang rendah dan atribut metabolisme termodinamika yang lebih menguntungkan. gS adalah metode alternatif untuk produksi asam suksinat yang mem-bypass asam isosinat dan butyryl Coenzyme A untuk mem-bypass dua langkah dekarboksilasi antara asam isosinat dan butanediil koenzim A untuk mencegah kehilangan karbon dan menyediakan NADH tambahan. rTCA memperbaiki CO2 dan dua kali lebih efisien daripada jalur oTCA. Penting untuk dicatat bahwa tingkat hasil (YP) adalah parameter lokal yang hanya mempertimbangkan stoikiometri bersih dalam jalur dan tidak memperhitungkan kehilangan karbon selama regenerasi NAD (P) H atau generasi ATP. Namun, hasil teoritis maksimum (YE) adalah parameter global yang mempertimbangkan keseimbangan elektron dan oleh karena itu juga mempertimbangkan regenerasi NAD (P) H. Oleh karena itu, dalam beberapa kasus, YP mungkin lebih tinggi daripada YE. Sintesis siklus rTCA dari SA terutama dilakukan oleh bakteri rumen dalam kondisi anaerobik. Sebaliknya, untuk ragi, siklus rTCA secara termodinamika tidak menguntungkan dan menghasilkan pasokan NADH seluler yang tidak memadai. Gambar berikut membandingkan perubahan energi bebas Gibbs dari sintesis SA melalui siklus oTCA atau siklus rTCA dengan sumber karbon yang berbeda. Ini termasuk glukosa, gliserol, xilosa melalui siklus CBB parsial, asimilasi asam format atau metanol melalui jalur glisin tereduksi dan asimilasi metanol melalui jalur xiloglukan fosfat. Gambar 2. Produksi asam suksinat menggunakan cabang oksidatif atau reduktif dari siklus TCA
Kemampuan ragi untuk mentoleransi pH yang lebih rendah dan dengan demikian mengurangi biaya produksi SA selama pemrosesan hilir telah menyebabkan produksi SA oleh ragi menarik perhatian luas, terutama siklus rTCA yang mampu memfiksasi CO2. Meskipun sintesis SA dari glukosa melalui glikolisis dan jalur siklus rTCA dapat memfiksasi 1 mol CO2 / mol SA, jalur ini tidak seimbang secara redoks dan membutuhkan tambahan 1 mol NADH untuk setiap 1 mol SA yang diproduksi, alternatif yang menarik adalah dengan memanfaatkan gliserol sebagai sumber karbon, yang dapat memfiksasi 1 mol CO2 / mol SA melalui jalur rTCA, yang memungkinkan produksi SA yang seimbang secara redoks. Total reduksi γ = 3,5 untuk kombinasi gliserol + CO2 sama dengan SA. Malubhoy et al [5] mencapai hasil 0,6 g / g gliserol dengan memperbaiki CO2, yang merupakan 47,1% dari maksimum teoritis.
Cara lain untuk mencapai kesetimbangan redoks adalah dengan menggunakan glukosa dan CO2 sebagai substrat bersama. Jika siklus glikolisis, GATHCYC, dan TCA parsial digunakan secara bersamaan, keseimbangan redoks dapat dicapai secara teoritis, dengan 1 mol SA mengikat 0,5 mol CO2. Namun, 1 mol SA membutuhkan konsumsi 0,33 mol ATP dengan biaya ATP yang diregenerasi, misalnya melalui respirasi sebagian glukosa. Oleh karena itu, skenario ini perlu dilakukan di bawah setidaknya kondisi yang sedikit aerobik, yang menambah faktor biaya lain dari proses tersebut.
Gbr. 3 Produksi asam butanedioat netral redoks melalui kombinasi glikolisis, GATHCYC, siklus TCA parsial, dan jalur glioksilat Tabel 1 Perbandingan jalur alami dan rekayasa untuk sintesis SA oleh ragi
di mana saya bisa membeli nutrisi ragi？
Jika Anda membutuhkan harga ragi, silakan isi informasi kontak Anda di formulir di bawah ini, kami biasanya akan menghubungi Anda dalam waktu 24 jam. Anda juga bisa mengirim email kepada saya info@longchangchemical.com selama jam kerja (8:30 pagi hingga 6:00 sore UTC+8 Senin-Sabtu) atau gunakan obrolan langsung situs web untuk mendapatkan balasan secepatnya.