Quel est le processus de production des bioenzymes ?

1. production d'enzymes

Les enzymes sont produites à partir de micro-organismes, d'animaux et de plantes, mais les micro-organismes en sont la principale source. Les micro-organismes présentant plus d'avantages que les plantes et les animaux, d'excellentes souches productrices d'enzymes sont généralement sélectionnées pour produire des enzymes par fermentation. Afin d'augmenter la concentration d'enzymes dans le bouillon de fermentation, d'excellentes souches sont sélectionnées, des bactéries génétiquement modifiées sont développées et les conditions de fermentation sont optimisées. La production industrielle nécessite des performances spéciales pour les nouvelles enzymes, telles que l'α-amylase résistante aux températures élevées, la protéase et la lipase résistantes aux alcalins, etc. C'est pourquoi nous devons rechercher et développer des souches capables de produire des performances spéciales pour de nouvelles enzymes.

2. préparation des enzymes

La technologie de séparation et de purification des enzymes est au cœur du "processus de post-traitement" de la biotechnologie actuelle. L'utilisation de diverses techniques de séparation et de purification, à partir de cellules microbiennes et de leur bouillon de fermentation, ou de cellules animales et végétales et de leur bouillon de culture dans la séparation et la purification des enzymes, permet d'obtenir des préparations enzymatiques hautement actives de pureté différente. Afin de généraliser l'utilisation des préparations enzymatiques dans tous les aspects de l'économie nationale, il est nécessaire d'améliorer l'activité, la pureté et le rendement des préparations enzymatiques et d'étudier les nouvelles techniques de séparation et de purification.

3. immobilisation des enzymes et des cellules

La recherche sur l'immobilisation des enzymes et des cellules est la tâche centrale de l'ingénierie enzymatique. Afin d'améliorer la stabilité des enzymes, de réutiliser les préparations enzymatiques, d'élargir le champ d'application des préparations enzymatiques, on utilise diverses méthodes d'immobilisation pour l'immobilisation des enzymes, la préparation d'enzymes immobilisées, telles que la glucose-isomérase immobilisée, la carbamoylase immobilisée, etc. L'enzyme immobilisée a toujours une grande vitalité. Elle est très appréciée dans divers domaines tels que la biochimie, le génie chimique, la microbiologie, les polymères et la médecine.

Les cellules immobilisées sont développées sur la base d'enzymes immobilisées. Diverses méthodes d'immobilisation sont utilisées pour immobiliser des cellules microbiennes, des cellules animales et des cellules végétales afin de produire une variété de cellules biologiques immobilisées. L'étude des propriétés enzymatiques des cellules immobilisées, en particulier les propriétés cinétiques, ainsi que la recherche et le développement de cellules immobilisées dans diverses applications constituent aujourd'hui un sujet brûlant dans le domaine de l'ingénierie enzymatique.

La technologie de l'immobilisation est une étape importante dans la modernisation de la technologie des enzymes, et c'est une technologie de pointe qui permet de surmonter les insuffisances des enzymes naturelles dans les applications industrielles et de tirer pleinement parti des caractéristiques de la réaction enzymatique. On peut dire qu'il n'y a pas de technologie enzymatique moderne sans le développement de la technologie d'immobilisation.

4. Modification moléculaire des enzymes

Également connue sous le nom de modification moléculaire des enzymes. Afin d'améliorer la stabilité de l'enzyme, de réduire l'antigénicité, de prolonger la demi-vie des bactéries médicinales dans l'organisme, diverses méthodes de modification sont utilisées pour modifier la structure de la molécule d'enzyme, afin de créer une enzyme naturelle qui ne possède pas d'excellentes caractéristiques (telles qu'une stabilité plus élevée, l'absence d'antigénicité, la résistance à l'hydrolyse des protéases, etc.), et même de créer une nouvelle activité enzymatique, d'étendre l'application de l'enzyme, de manière à augmenter la valeur de l'application de l'enzyme et à obtenir de plus grands avantages économiques et sociaux.

La modification moléculaire des enzymes peut être réalisée sous deux aspects :

(1) Utiliser la technologie de l'ingénierie des protéines pour modifier le gène de la structure de la molécule d'enzyme, dans l'espoir d'obtenir une nouvelle enzyme (enzyme mutante) présentant d'excellentes caractéristiques et une activité élevée, avec une structure primaire et une structure spatiale raisonnables.

(2) Modification chimique ou enzymatique de la structure primaire des protéines enzymatiques, ou modification chimique de la molécule d'enzyme avec modification chimique du groupe de la chaîne latérale. Afin de modifier les propriétés enzymatiques. Ces enzymes sont particulièrement utiles pour la recherche fondamentale en enzymologie et en médecine.

Les micro-organismes utilisés dans la production d'enzymes sont des champignons filamenteux, des levures et des bactéries réparties en trois grands groupes, principalement des bactéries aérobies. Les souches et les utilisations de plusieurs enzymes industrielles majeures sont énumérées ci-dessous :

Amylase

Les amylases hydrolysent l'amidon pour produire des oligosaccharides de malt pâteux et du maltose. La production est dominée par la fermentation profonde avec Bacillus subtilis et Bacillus licheniformis du genre Bacillus, ce dernier produisant des enzymes résistantes à la chaleur. Les fermentations profondes et semi-solides avec des souches d'Aspergillus et de Rhizopus sont également utilisées pour la transformation des aliments [6] . Les amylases sont principalement utilisées dans la production de sucre, le désencollage des textiles, le traitement des matières premières de fermentation et la transformation des aliments. La glucoamylase peut hydrolyser l'amidon en glucose, qui est aujourd'hui presque entièrement produit par la fermentation profonde d'Aspergillus niger, et est utilisé dans la production de sucre, la production d'alcool et le traitement des matières premières de fermentation.

Protéase

L'utilisation de souches et la production de la plupart des variétés. Avec le bacille en forme de lichen, le petit bacille court et le bacille subtilis pour la production de protéase bactérienne par fermentation profonde ; avec les streptomyces, Aspergillus pour la production de protéase neutre par fermentation profonde et Aspergillus pour la production de protéase acide, utilisée pour le dépelliculage du cuir, l'assouplissement de la fourrure, les produits pharmaceutiques et l'industrie alimentaire ; avec Trichoderma spp. pour la production de présure par fermentation semi-solide dans la fabrication de fromage à la place de la présure extraite de l'estomac du veau d'origine.

Glucose isomérase

Une espèce s'est développée rapidement dans les années 70. Les cellules de Streptomyces sont d'abord obtenues par fermentation profonde et, après immobilisation, la solution de glucose est convertie en un sirop contenant environ 50% de fructose, qui peut être utilisé dans l'industrie alimentaire à la place du saccharose. Avec l'amylase, la glucoamylase et la glucose isomérase, etc., l'amidon de maïs sera transformé en sirop, ce qui est devenu l'une des industries sucrières émergentes.

Sélection des systèmes d'expression
1 Système d'expression E. coli
Système d'expression ①pET de préférence
② L'expression et la purification des protéines recombinantes peuvent être effectuées à l'aide d'étiquettes solubilisées, la MBP étant le premier choix.
③ Préférer pET24 ou pET28 (si une purification est nécessaire) avec BL21(DE3), milieu TB 37° croissance jusqu'à 1-1,5 OD, 18 ℃ croissance pendant 1 heure jusqu'à 3 OD , 0,5 mM IPTG induction pendant 19 heures jusqu'à OD jusqu'à 10.
④ Mesures de sauvetage en cas de forte expression et de faible solubilité : refroidissement jusqu'à 15 ℃ ; changement de milieu en 2xYT ou ZYP5052 (auto-induite), changement d'hôte d'expression ; troncation des résidus N-terminaux et/ou C-terminaux de 2 à 10 acides aminés ; expression par fusion avec des protéines hautement solubles, telles que la MBP ; induction chimique de chaperons moléculaires, co-expression de chaperons moléculaires/protéines interagissant, ou apport de ligands.
⑤ Avantages et inconvénients du système d'expression E. coli
Avantages : le plus pratique, le plus efficace
Inconvénients : faible capacité d'expression de la sécrétion ; difficulté à former des liaisons disulfures ; pas de modification post-traductionnelle.

2 Système d'expression de la levure (Picrosporum)
Avantages : intégration stable de gènes exogènes ; le promoteur du gène de l'alcool oxydase est puissant et l'expression peut être strictement régulée par le méthanol ; les protéines recombinantes peuvent être exprimées sous forme intracellulaire ou extracellulaire ; elles contiennent des fonctions de modification post-traductionnelle communes aux systèmes d'expression eucaryotes ; il existe des hôtes/vecteurs commerciaux, ce qui est facile à utiliser ; l'amplification est aisée et la densité de fermentation est extrêmement élevée.
② Inconvénients : forme unique de traitement post-traductionnel ; problème de glycosylation excessive.

3 Le premier choix est le système d'expression rapporté dans la littérature, le deuxième choix est le système E. coli, et le système de levure est utilisé si l'expression dans E. coli est inactive. Selon la source du gène pour déterminer le système d'expression, le gène plus les étiquettes d'affinité pour faciliter la purification.

Modification enzymatique
①Conception rationnelle : basée sur les informations relatives à la structure et à la fonction de la protéine, sur le changement de gène codant et sur le test d'expression de la recombinaison.
Procédure : premièrement, obtenir la structure de l'enzyme à partir de la base de données BRENDA, puis modifier la structure de l'enzyme et prédire la structure de l'enzyme avec Alphafold2, puis effectuer une analyse d'ancrage entre l'enzyme et la molécule de ligand avec le logiciel PyMOL, et enfin, en fonction de la nouvelle structure de l'enzyme, muter les séquences du gène de manière directionnelle, puis l'exprimer par recombinaison pour obtenir une nouvelle enzyme (afin d'améliorer la stabilité thermique de l'enzyme, l'efficacité catalytique et la spécificité du substrat).
② Conception irrationnelle : mutation ou recombinaison à haute fréquence de séquences codantes, expression recombinante et tests à haut débit.

Processus de conception ab initio : 1. développement du champ de force et algorithme d'échantillonnage 2. tests à haut débit 3. identification de la structure

Évolution dirigée des protéines
①Sélectionner les gènes originaux
②Etablir une bibliothèque de mutations génétiques diverses
③Lier plusieurs gènes mutés dans des vecteurs et les exprimer respectivement dans les souches correspondantes
④ Sélectionner un gène mutant de haute qualité par criblage, puis exprimer le gène mutant en grandes quantités.

Méthodes de génération de banques de gènes mutants
①Mutation aléatoire à haute fréquence in vivo : utilisation d'E. coli XL1-Red comme hôte de réplication génétique (système de réparation des dommages à l'ADN défectueux)
Cultivé jusqu'au stade du plateau, une mutation de base se produit en moyenne dans 2Kb.
②Random Mutagenesis kit : taux de mutation 0,1 -1,6% /PCR, équivalent à 1-16 mutations de base/gène
③ Mutagenèse par saturation point par point

L'évolution naturelle : Mutation spontanée, recombinaison, sélection naturelle
Évolution de l'agriculture : mutation spontanée, sélection, criblage
Évolution en laboratoire : taux de mutation accéléré, sélection moléculaire, criblage

Mélange d'ADN
Stratégie expérimentale de l'ingénierie des protéines
①Sélectionner le gène de départ pour établir un système d'inactivation et/ou une méthode de criblage.
②Si la relation structure-fonction est connue, il faut d'abord adopter une méthode de conception rationnelle.
③Mutation aléatoire et criblage à haut débit
④Concevoir à partir de zéro uniquement s'il n'existe pas de gène de départ approprié.

Techniques de recherche sur les protéines
1 Propriétés physiques et chimiques liées à la séparation et à la purification des protéines
Taille moléculaire (dialyse, ultrafiltration, filtration sur gel, centrifugation)
②Forme moléculaire (centrifugation en gradient, électrophorèse)
(iii) Propriétés chargées (électrophorèse, chromatographie d'échange d'ions)
(iv) Propriétés de solubilisation (salinisation, précipitation dans un solvant organique)
⑤ Différences dans la liaison spécifique aux ligands (chromatographie d'immunoaffinité, chromatographie de bioaffinité, chromatographie d'affinité avec les chélates métalliques)
(vi) Propriétés d'adsorption (chromatographie hydrophobe)
(vii) dénaturation et dénaturation (dénaturation et dénaturation de l'urée)

2 Système d'expression des protéines
① Système d'expression bactérienne : cycle court, efficacité élevée, faible coût, mais pas de modification post-traductionnelle. Principalement utilisé pour la production de protéines procaryotes, de protéines eucaryotes simples.
Sélection du vecteur d'expression : série pet, série pGEX, PQE30......
Sélection des souches d'expression : BL21(DE3), Rosetta, M15......
Conditions d'induction : Concentration d'IPTG, température et durée
Purification : Ni-NTA (His tag), Strep-beads, GST.....

② Système d'expression de la levure : cycle court, efficacité élevée, faible coût, il existe des modifications post-traductionnelles. Il y aura une glycosylation inappropriée, une forte modification du mannose. Principalement utilisé pour produire des protéines intracellulaires/sécrétoires, des protéines à liaison disulfure, des protéines glycosylées.

(iii) Système d'expression bactériophage : capacité génétique élevée, protéines solubles, adapté à la production de protéines toxiques, modifications post-traductionnelles similaires à celles des mammifères. Les conditions de culture sont difficiles et certaines modifications de glycosylation font défaut. Principalement utilisé pour la production de protéines membranaires, de protéines de grande taille, de vaccins viraux, de protéines de signalisation, de cytokines, de kinases.
Le génome des baculovirus a une énorme capacité d'insertion de gènes exogènes pouvant aller jusqu'à 38 kb.
Les baculovirus sont produits dans des cellules d'insectes et ne se répliquent pas dans les cellules de mammifères.
Avantages : les baculovirus peuvent être transduits efficacement dans les lignées cellulaires de mammifères, y compris les cellules primaires et les cellules souches.
Sécurité (pas de réplication dans les cellules de mammifères) et absence d'effets cytopathiques observables
Les cellules prétransduites congelées peuvent également être utilisées comme cellules de préparation de test.
Portabilité (pour l'analyse de types de cellules pharmacologiquement pertinentes)
Rapidité de développement des tests (pas besoin de passer du temps à générer des lignées cellulaires stables)

④ Systèmes d'expression mammalienne : cycle long, faible efficacité, présence de modifications post-traductionnelles, bioactivité élevée des protéines. Principalement utilisés pour produire des protéines eucaryotes complexes, des protéines qui nécessitent une PTM précise.
Expression transitoire de protéines : Réactifs de transfection PEI ou liposomes
Développement de lignées cellulaires stables : Plateformes d'ingénierie cellulaire Flp-In™ Jump-In™
Expression inductible : Expression régulée par la tétracycline
Expression par livraison virale : système d'expression lentiviral pour l'analyse fonctionnelle ; système d'expression adénoviral pour la production de protéines

3 Purification des protéines
Pourquoi devons-nous purifier les protéines ?
Caractériser la structure et la fonction des protéines d'intérêt.
(ii) Étudier la régulation des protéines et leurs interactions
③ générer des anticorps
Méthodes de purification
Sur la base des propriétés physiques/chimiques
Taille des protéines : dialyse, ultrafiltration, chromatographie de filtration sur gel
Chargement des protéines : chromatographie par échange d'ions
Hydrophobie des protéines : chromatographie d'interaction hydrophobe

Sur la base des propriétés biologiques : chromatographie d'affinité

①Dialyse
Facteurs d'influence : MWCO du tube de dialyse ; volume du tampon ; durée de la dialyse ; fréquence de remplacement du tampon de dialyse.

Ultrafiltration
Filtration centrifuge : la taille des protéines est inférieure à la taille des pores du tube filtrant, elles sont centrifugées jusqu'au fond du tube.

③ Chromatographie par filtration sur gel
Séparer des protéines de tailles différentes

④Chromatographie d'échange d'ions
Colonne échangeuse de cations : le gel est chargé négativement, la protéine est chargée positivement.
Colonne d'échange d'anions : le gel est chargé positivement, la protéine est chargée négativement.
Moyen
Support inerte : agarose, dextran
Groupes chargés : carboxyméthyle : chargé négativement, diéthylamino : chargé positivement
Les ions en équilibre : groupes chargés négativement : H+ ou Na+ groupes chargés positivement : OH- ou Cl-
Élution progressive ou en gradient des protéines en augmentant la concentration en sel ou en modifiant le pH.

⑤ Chromatographie d'affinité
La chromatographie d'affinité est une méthode de séparation des biomolécules d'un mélange basée sur des interactions de liaison macromoléculaire hautement spécifiques entre une biomolécule et une autre substance.
Les exemples comprennent : la liaison d'antigènes à des anticorps, la liaison d'enzymes à des ligands, la liaison de protéines de fusion glutathion et GST, la liaison de protéines anti-biotine à des molécules liant la biotine, et la liaison d'ions métalliques à des protéines de fusion polyhistidine.

Chromatographie par chélate de métal immobilisé (IMAC) utilisant des ions métalliques (Ni 2+ ; Co 2+ ; Cu 2+) liés au poly-(His) ₆ protéines marquées.

Purification des protéines étiquetées
Les billes peuvent adsorber spécifiquement les protéines avec l'étiquette strep, puis avec la biotine, la protéine peut être éluée des billes. (Le principe est similaire à l'expérience d'extraction de la GST).

Chromatographie d'affinité protéineA/protéineG
Les protéines A et G obtenues par génie génétique peuvent se lier spécifiquement à la région Fc de l'IgG de mammifère. En liant la protéine A et la protéine G au matériau de la colonne, l'IgG et ses sous-classes et fragments peuvent être purifiés par chromatographie d'affinité.
Protéine A : poids moléculaire de 42 kDa, codée par le gène spa, avec 5 domaines structuraux isotypiques de liaison aux immunoglobulines, chacun consistant en 3 hélices alpha.
protéine G : d'un poids moléculaire de 65 kDa, codée par le gène spg, elle lie les segments Fc et Fab de l'anticorps ainsi que l'albumine présente dans le sérum. La protéine G obtenue par génie génétique supprime le site de liaison à l'albumine et ne conserve que le domaine de liaison Fc, qui est plus puissant que la protéine A. La protéine A/protéine G est une protéine obtenue par génie génétique qui se lie à l'albumine.
protéineA/protéine G : il s'agit d'une protéine de liaison génétiquement modifiée. Elle se compose de 4 domaines de liaison à la protéine A et de 2 domaines de liaison à l'immunoglobuline de la protéine G, qui ont une plage de liaison plus large que la protéine A ou la protéine G seule, et qui combinent leurs avantages en un seul, ce qui peut être appliqué à la purification de l'IgG à partir de presque toutes les espèces.

Comment identifier la protéine purifiée ?
SDS-PAGE ; HPLC ; spectrométrie de masse ; Western blot ; essais de liaison ; essais fonctionnels ; élucidation structurelle.

4 Microscopie électronique
Cryo-microscopie électronique à particule unique (Single-ParticleAnalysis, SPA)
Microscopie par tomographie cryo-électronique (cryo-ET)

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Composé Glucoamylase	9032-08-0
Pullulanase	9075-68-7
Xylanase	37278-89-0
Cellulase	9012-54-8
Naringinase	9068-31-9
β-Amylase	9000-91-3
Glucose oxydase	9001-37-0
alpha-amylase	9000-90-2
Pectinase	9032-75-1
Peroxydase	9003-99-0
Lipase	9001-62-1
Catalase	9001-05-2
TANNASE	9025-71-2
Elastase	39445-21-1
Uréase	9002-13-5
DEXTRANASE	9025-70-1
L-Lactique déshydrogénase	9001-60-9
Déshydrogénase malate	9001-64-3
Cholestérol oxydase	9028-76-6