1. Méthode de détection de l'activité enzymatique de la naringinase
1-1 Méthode du spectrophotomètre
La méthode spectrophotométrique au para-nitrophénol utilise le p-nitrophénol- α-rhamnoside ( pNP- α- Rha ) et le p-nitrophénol-β-D-glucopyranoside ( pNP- β-Glu) comme substrat, pour détecter l'activité enzymatique de l'α-rhamnosidase et de la β-glucosidase. Li Ping a utilisé la méthode du spectrophotomètre p-nitrophénol, dans l'expérience d'ajout de la β-glucosidase d'Aspergillus niger dans la solution de p-nitrophénol -β-glucoside ( pNPG ) pour l'hydrolyse enzymatique, et la valeur de l'absorbance a été mesurée à une longueur d'onde ultraviolette de 400 nm. Sur la base de la valeur de l'absorbance, ils calculent l'activité enzymatique de la β-glucosidase. Cette méthode a une forte spécificité de substrat, mais le substrat standard est cher, et l'activité enzymatique de la naringinase pour hydrolyser les glycosides dans les aliments ne peut pas être déterminée, de sorte que cette méthode n'est pas adaptée à la détection de l'activité enzymatique dans la préparation industrielle à grande échelle de la naringinase.
Le principe de la méthode du spectrophotomètre de Davis est que la naringine peut subir une réaction chromogène avec le diéthylène glycol 90% dans des conditions légèrement alcalines, et la production de chalcone jaune de naringine peut être détectée sous une lumière ultraviolette d'une longueur d'onde de 420 nm. Selon la valeur d'absorbance mesurée, la quantité restante du substrat naringine peut être calculée, puis l'activité naringinase peut être obtenue par calcul. Wang Weina et al. ont utilisé une méthode de Davis améliorée, ont pris la naringine comme substrat et ont ajouté de la naringinase produite par fermentation liquide d'Aspergillus niger FFCC 848 pour l'hydrolyse enzymatique. L'absorbance a été mesurée sous une lumière ultraviolette de 420 nm, puis l'activité enzymatique a été calculée. La méthode du spectrophotomètre de Davis pour mesurer l'activité enzymatique est simple à utiliser et rapide. Cette méthode est donc largement utilisée pour la détection en temps réel de la production de naringinase par fermentation et de l'activité de la naringinase immobilisée.
1-2 Chromatographie liquide à haute performance
Le principe de la chromatographie liquide à haute performance (CLHP) est que la CLHP peut déterminer avec précision et analyser quantitativement le substrat naringine, le produit intermédiaire purunine et le produit final naringénine pendant tout le processus d'hydrolyse, puis calculer l'activité enzymatique. Chen Yuelong et d'autres ont utilisé la CLHP pour déterminer le temps de rétention de la naringine, de l'arbutine, de la myricétine et de leurs produits, et ont réalisé une séparation complète avec une résolution supérieure à 1,5, et ont contrôlé efficacement l'effet de la naringinase sur de multiples glycosides dans le processus d'hydrolyse, tout en déterminant avec précision l'activité enzymatique. La méthode CLHP présente les avantages d'une grande précision et peut éviter l'interférence des impuretés, mais comparée à la méthode Davis, cette méthode a un temps de détection plus long et une opération plus compliquée.
1-3 Méthode améliorée de détermination de l'activité enzymatique de la naringinase
En utilisant la méthode Davis améliorée : 0,8 ml de 0,8 g-L-1 Une solution de naringine préparée avec un tampon pH 4,5 a été ajoutée au système réactionnel contenant 40 mg de naringinase immobilisée (ou 0,2 mL de naringinase libre). Le placer dans un bain-marie à température constante de 50 ℃ pendant 30 minutes. Prélever 0,1 mL de la solution d'hydrolyse enzymatique réactionnelle et ajouter 5 mL de diéthylène glycol (fraction volumique de 90%) et 0,1 mL de solution de NaOH (4 mol-L-1) dans des tubes et laisser reposer pendant 10 minutes après les avoir mélangés uniformément. Mesurer l'absorbance de la solution mélangée à 420 nm.
La définition de l'activité de l'enzyme naringinase (U) : à une condition de pH 4,5, 50 ℃, 1 unité d'activité enzymatique est la quantité d'enzyme nécessaire pour dégrader 1 μg de naringine par minute. Le rapport d'activité enzymatique ( U-g-1 ou U-mL-1) est définie comme suit : à pH 4,5, 50 ℃, activité enzymatique présentée par 1 g de naringinase immobilisée (ou 1 mL de naringinase libre). L'activité enzymatique relative est calculée selon la formule suivante :
Détermination de la courbe standard : la concentration de masse de la solution standard de glycoside naringine est disposée à 0, 0,4, 0,8, 1,2, 1,6 g - L-1Ensuite, 0,1 mL de la solution a été prélevé pour réagir avec 5 mL de diéthylène glycol (90%, v/v) et 0,1 mL de solution d'hydroxyde de sodium (4 mol-L), puis 0,1 mL de solution d'hydroxyde de sodium (4 mol-L).-1). Après avoir mélangé uniformément le mélange et l'avoir laissé reposer pendant 10 minutes, la valeur d'absorption de la lumière de la solution mélangée a été mesurée à 420 nm et la courbe standard a été tracée en conséquence.
2. Préparation de la solution enzymatique de naringinase
L'Aspergillus niger FFCC uv-11 conservé à 4 ℃ a été transféré sur le milieu de culture, et les spores matures ont été obtenues par culture à température constante à 30 ℃ pendant 96 h . Ensuite, les spores ont été lavées avec une solution saline normale stérile avec une fraction de masse de 0,9%. La valeur de l'absorbance de la suspension de spores est mesurée à 600 nm (valeur OD600), avec une solution saline stérile sa valeur OD600 a été ajustée à 0,200. Ensuite, la suspension de spores avec la fraction volumique de 10% a été inoculée dans 100 ml de milieu de fermentation (fiole conique de 250 ml). Le bouillon de fermentation obtenu a été centrifugé à 4 ℃ et 6000 r-min.-1 pendant 10 minutes dans une centrifugeuse réfrigérée. Puis à travers le filtre d'aspiration pour obtenir le liquide surnageant nécessaire naringine enzyme fluide. Le réfrigérer à 4 ℃ pour une utilisation ultérieure.
3. Préparation de l'enzyme Naringinase immobilisée dans le chitosane
Prendre 3,0 g de chitosane, avec 100 ml de fraction volumique de la solution d'acide acétique 2% a été dissous pour préparer 0,3 g - L-1 La solution colloïdale de chitosane a été soniquée pendant 20 minutes afin d'éliminer les bulles d'air et de la laisser se dissoudre complètement. La solution colloïdale de chitosane a été injectée goutte à goutte à l'aide d'une aiguille dans 0,5 g - L-1 NaOH (1000 ml) pour former des granulés lisses. Laisser reposer à température ambiante pendant 3 heures, et les granulés ont été lavés à plusieurs reprises avec de l'eau distillée jusqu'à neutralité, et l'eau a été absorbée par un papier filtre pour obtenir les microsphères de chitosane. 0,4 g de microsphères de chitosane ont été pesées, 0,4 ml de glutaraldéhyde avec une fraction de volume de 6% a été ajouté, et les microsphères ont été lavées à plusieurs reprises avec de l'eau distillée jusqu'à ce qu'il n'y ait plus de glutaraldéhyde à la surface des microsphères après une température constante et une vibration à 25 ℃ 150 r-min.-1 Les microsphères de chitosane réticulées ont été obtenues par séchage sur papier filtre.
Il dit 0,4 g de microsphères de chitosane, ajouter 0,4 mL de numéro de membre de crédits 6% glutaraldéhyde, à 150 r - min-1 à 25 ℃ oscillation de la température Après 2 h, lavé à plusieurs reprises avec de l'eau distillée micro sphère à la surface de celui-ci n'est pas pentyl Dialdéhyde et le papier filtre sont séchés pour obtenir des microsphères de chitosane réticulé. Prélever 4 ml de solution enzymatique de naringinase, l'ajouter à 0,4 g de microsphères de chitosane réticulé, agiter à une température constante de 25 ℃, 150 r-min.-1 Rincer la solution enzymatique résiduelle sur la surface du support avec un tampon pH 4,5, absorber l'eau sur le papier filtre pour obtenir la naringinase immobilisée, et la stocker dans un réfrigérateur à 4 ℃ pour une utilisation ultérieure.
4. Préparation de microsphères magnétiques de chitosane à base de silicium (MSC)
Le processus de préparation des nanoparticules magnétiques à base de silicium (MS) est illustré à la figure 1.
Figure 1 Schéma de préparation des nanoparticules magnétiques à base de silicium
( 1) Tout d'abord, le Fe magnétique3O4 modifiées par l'acide citrique ont été préparées par la méthode de co-précipitation chimique, et la procédure expérimentale comprend : 2,25 g de FeCl3-6H2O et 1,61 g de FeSO4-7H2O sont ajoutés dans un ballon à trois cols rempli de 100 mL d'eau déionisée, la température du système a été chauffée à 85 ℃ sous l'effet de l'azote gazeux. Agiter sous 1000 r-min-1 et verser rapidement 10 ml d'eau ammoniaquée concentrée. Lorsque la solution devient noire, ajouter 153 mg de citrate de sodium. Après 30 minutes de réaction, séparer la production à l'aide d'un aimant et laver la phase solide avec de l'eau désionisée et de l'éthanol à plusieurs reprises. Le Fe3O4 Les nanoparticules obtenues sont séchées en vue d'une utilisation ultérieure.
( 2) Ensuite, des nanoparticules magnétiques à base de silicium (MS) ont été préparées par la méthode sol-gel, comme le montre la figure 1. Les étapes expérimentales sont les suivantes 0,1 g de Fe3O4 ont été uniformément dispersées dans une solution mixte contenant 40 ml d'éthanol anhydre, 10 ml d'eau distillée et 1,2 ml d'eau ammoniaquée concentrée. Sous une agitation de 300 r-min-1Des gouttelettes de solution contenant du Fe3O4 ont été ajoutées au TEOS (0,4 ml) dispersé dans 30 ml d'éthanol anhydre, et la réaction des nanoparticules à base de silicium s'est déroulée pendant 12 heures à température ambiante. Les produits ont été lavés plusieurs fois avec de l'éthanol anhydre et de l'eau distillée pour obtenir des nanoparticules magnétiques à base de silice (MS), qui ont été séchées en vue d'une utilisation ultérieure.
Les microsphères de MSC ont été préparées par la méthode de réticulation en émulsion, comme le montre la figure 2. Les étapes expérimentales étaient les suivantes : 0,125 g de nanoparticules de silice magnétiques (MS) uniformément dispersées dans 10 mL de solution de chitosane avec une fraction massique de 2,5% préparée par le chitosane dissous dans une solution d'acide acétique avec une fraction volumique de 5,0%, puis ajouter la solution de chitosane dans une émulsion contenant 60 mL de cire de paraffine liquide et 1,8 mL de twain 80 goutte à goutte. Après 30 minutes d'agitation au bain-marie à 40 ℃ et à 800 r-min, la solution de chitosane est mélangée à la cire de paraffine liquide.-1，additionner 2,0 mL de glutaraldéhyde et faire réagir 1 h. Ensuite, le pH du système a été ajusté à 9,0 avec 1 mol-L-1 NaOH, et la réaction a été poursuivie pendant 1 h. Les produits ont été lavés avec de l'éther de pétrole, de l'éthanol et de l'eau distillée à plusieurs reprises pour obtenir des microsphères MSC, qui ont été séchées sous vide en vue d'une utilisation ultérieure.
Figure 2 Schéma de préparation des microsphères magnétiques de chitosane à base de silicium
5. Préparation de microsphères de chitosane magnétiques à base de silicium et d'époxy (MSCE)
0,5 g de microsphères de MSC séchées préparées par la méthode 4 ont été pesées et ajoutées dans une fiole conique de 50 ml. Ensuite, 2,0 ml de solution de NaOH, de solution d'épichrolohydrine et de NaBH4 ont été ajoutées dans le ballon avec une certaine concentration. La réaction a été effectuée par oscillation de la température constante pendant un certain temps. Le mécanisme de réaction de la préparation du MSCE est illustré à la figure 3.
Figure 3 Principe de préparation des microsphères magnétiques de chitosane à base d'époxy et de silicium
Après activation, les microsphères activées sont lavées à plusieurs reprises avec de l'eau distillée jusqu'à ce qu'il n'y ait plus de groupes OH- et époxy libres à la surface pour obtenir des microsphères de chitosane magnétique à base de silicium et d'époxy (MSCE). La méthode de détection est la suivante : prendre 3,0 ml du surnageant de lavage et ajouter 1~2 gouttes de phénolphtaléine. Après agitation, si la phénolphtaléine ne vire pas au rouge, cela signifie qu'il n'y a pas d'OH- libre dans le MSCE ; prendre 3,0 mL du surnageant de lavage et ajouter 3,0 mL de 1,3 mol-L-1 thiosulfate de sodium et 1 ~2 gouttes de phénolphtaléine, si la solution ne devient pas rouge après agitation, cela signifie qu'il n'y a pas de groupes époxy libres dans le MSCE. L'équation de réaction de la détection du groupe époxy est la suivante :
6 Préparation de l'enzyme naringinase immobilisée dans le MSCE
5,0 g de MSCE préparé par la méthode 5 ont été ajoutés à 50 ml de solution enzymatique de naringinase avec un certain pH, et la réaction a été oscillée sous un bain-marie à température constante, comme le montre la figure 4. Après la réaction, les microsphères ont été lavées plusieurs fois avec une solution tampon jusqu'à ce qu'il n'y ait plus de naringinase libre à la surface des microsphères. Les microsphères ont été drainées par un entonnoir Brinella pour obtenir l'enzyme naringinase immobilisée par MSCE, qui a été réfrigérée à 4 ℃ pour une utilisation ultérieure.
Figure 4 Le principe de préparation de l'enzyme naringinase immobilisée par MSCE
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